Un open source, completamente personalizzabile, 5-Choice Serial Reaction Time Task Toolbox per l'addestramento comportamentale automatizzato dei roditori

Riepilogo

Il presente protocollo descrive lo sviluppo di una cassetta degli attrezzi open source a 5 scelte per i modelli di animali roditori, utilizzando Arduino e l'hardware correlato e una versatile cassetta degli attrezzi Matlab, incluso uno script opzionale per l'addestramento comportamentale automatizzato. Gli script sono personalizzabili e facilitano l'implementazione di diversi progetti di prova e test.

Abstract

Il compito del tempo di reazione seriale a 5 scelte (5-CSRTT) è un test comportamentale spesso utilizzato per studiare l'attenzione visuospaziale e l'impulsività nei roditori. Il compito richiede agli animali di allocare l'attenzione su una serie orizzontale di cinque piccole aperture dotate di sorgenti luminose e, entro una finestra temporale limitata, di colpire al naso un'apertura del bersaglio illuminata per ottenere una ricompensa alimentare presso la rivista di cibo situata nella parete opposta della camera. Il compito considera misure di controllo comportamentale come l'accuratezza della risposta e i tempi di reazione e consente di dedurre attenzione e impulsività selettive. La difficoltà del compito può essere controllata modificando la durata dello stimolo e la progettazione del compito in generale. Gli apparecchi disponibili in commercio di solito consistono in una camera sperimentale e in un particolare software per specificare i parametri del compito, ma a causa di hardware e software fissi, pongono molte limitazioni ai cambiamenti nella progettazione sperimentale generale e ai requisiti specifici delle attività e alla relativa produzione di dati. Questo articolo spiega un'alternativa completamente personalizzabile basata su un microcontroller a scheda singola facile da usare e componenti elettrotecnici standard, uno script Arduino ad accesso aperto e un Toolbox Matlab per il controllo hardware e le specifiche delle attività comportamentali, rispettivamente. La cassetta degli attrezzi include una procedura di scala opzionale, che consente la formazione comportamentale automatizzata. La configurazione hardware completa, che può essere installata in camere personalizzate, e il software liberamente adattabile incoraggiano la progettazione di attività e camere non standardizzate. Vengono descritti il design del sistema e il codice open source per il controllo hardware e l'installazione sperimentale.

Introduzione

Il 5-CSRTT è un test comportamentale, spesso utilizzato nei roditori per studiare i processi visivi attenzionali e l'impulsività 1,2,3,4,5,6, come determinare il ruolo del sistema colinergico nell'attenzione e l'influenza degli inibitori della ricaptazione della noradrenalina sui comportamenti impulsivi 7 . L'apparato standard consente di osservare varie misure di controllo come l'accuratezza della risposta, i tempi di reazione, il comportamento impulsivo e compulsivo, la capacità motoria e la motivazione ^1,2,3,4,5. Consiste in una serie orizzontale di cinque aperture dotate di LED, una rivista alimentare sulle pareti della camera che si oppone alle aperture e luci di casa ^2,5. In un compito tipico, la luce della casa è illuminata e l'inizio di una sessione è contrassegnato dall'illuminazione della rivista alimentare, dove viene consegnato un pellet gratuito. Il corso di prova inizia quando l'animale colpisce il caricatore per recuperare il pellet¹. Successivamente, la luce della rivista alimentare viene spenta e inizia l'intervallo inter-trial (ITI), durante il quale l'animale dovrebbe dirigere la sua attenzione verso le aperture. Una volta trascorso l'ITI, viene presentata un'illuminazione di stimolo in una delle aperture ^1,2,5. Lo stimolo viene dato per una lunghezza specifica nota come durata dello stimolo (StD). L'animale può rispondere allo stimolo mentre viene presentato o durante una finestra di tempo limitata dopo che l'StD è finito, noto come presa limitata (LH). Per rispondere, l'animale deve colpire il naso all'apertura del bersaglio e, se fatto correttamente, una ricompensa viene rilasciata nella rivista alimentare ^1,2,5. In caso contrario, qualsiasi risposta errata, così come qualsiasi risposta prima della presentazione dello stimolo (anticipatoria o prematura) o qualsiasi mancata risposta (omissione) si traduce in un timeout (TO), durante il quale la luce della casa viene spenta per una certa durata ^1,2,5 (Figura 1). In generale, l'accuratezza dello stimolo discriminativo misura il funzionamento attentivo, mentre le risposte premature e perseveranti (risposte ripetute alle aperture dopo la presentazione dello stimolo) sono considerate misure del comportamento impulsivo e della compulsività, rispettivamente 1,4,5,6.

Figura 1: Possibili sequenze di prova di un tipico 5-CSRTT. Dopo l'intervallo intertriale, la luce di stimolo viene accesa per una durata specifica e quindi spenta durante l'intervallo di attesa limitata. Il topo può rispondere correttamente e ricevere una ricompensa o rispondere in modo errato e ottenere un timeout durante questo periodo. Se il ratto non risponde in tempo, la sua omissione si traduce in un timeout. Allo stesso modo, se risponde prima della presentazione dello stimolo luminoso, la sua risposta prematura si traduce in un timeout. Un'altra prova inizia dopo la raccolta della ricompensa o la fine del periodo di timeout. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il 5-CSRTT è ampiamente utilizzato per la sua flessibilità: modificando i parametri del progetto di prova, è possibile indagare diverse sottocategorie di attenzione. Ad esempio, mentre l'animale dovrebbe dividere la sua attenzione attraverso le cinque diverse aperture (attenzione visuospaziale), l'uso di stimoli irrilevanti (ad esempio, stimoli uditivi) consente il test dell'attenzione selettiva o sostenuta 1,2,5,6. A tale scopo, la configurazione sperimentale può essere estesa includendo altoparlanti, che possono essere utilizzati come stimoli di distrazione o addirittura rinforzanti 1,2,5,6. Inoltre, il carico attentivo può essere modulato direttamente alterando la presentazione dello stimolo o randomizzando la durata ITI¹⁰. Il 5-CSRTT non è utilizzato solo nei roditori ^3,7, ma è stato recentemente adattato per testare i primati non umani ^1,7,8 e i pesci ^7,9, mostrando ulteriormente la sua fattibilità. Una cassetta degli attrezzi 5-CSRTT completamente personalizzabile consente un facile adattamento del paradigma standard dei roditori ad altri modelli animali. Inoltre, la flessibilità di personalizzazione del toolbox 5-CSRTT incoraggia anche la ricerca utilizzando progetti di attività non standard.

Il toolbox 5-CSRTT completamente personalizzabile qui presentato contiene uno script Arduino per il controllo hardware, programmato in un ambiente di sviluppo integrato. Consiste anche in un toolbox Matlab (versione R2019b o più giovane) per il controllo degli esperimenti. Il seguente protocollo spiega come configurare la casella degli strumenti 5-CSRTT con il paradigma standard ampiamente utilizzato e mostra le configurazioni opzionali per i paradigmi non standard.

Protocollo

La procedura sperimentale in questo protocollo è stata eseguita seguendo le raccomandazioni della direttiva UE 2010/63 per il benessere degli animali da esperimento e in conformità con la legge sul benessere degli animali emessa dal governo federale della Germania ed è stata approvata dalle autorità locali. Poiché la ricerca richiedeva solo un addestramento comportamentale, nessun animale è stato eutanasia e tutti sono stati tenuti nell'allevamento dopo che la ricerca è stata condotta. La ricerca è stata condotta utilizzando dieci ratti maschi con cappuccio Lister (4 mesi di età all'inizio dell'allenamento comportamentale).

1. Stabulazione, allevamento e manipolazione degli animali

1. Ospita i ratti insieme a un massimo di cinque compagni di cucciolata in una gabbia standard con materiale di lettiera adatto, secondo le raccomandazioni del comitato per il benessere degli animali.
2. Tenere i ratti in una stanza ventilata con una temperatura controllata di 20 ± 2 °C e umidità relativa di un massimo del 50% con un ciclo luce/buio di 12:12 h o in conformità con le raccomandazioni del comitato per il benessere degli animali. Limitare l'accesso al cibo (12 g di chow al giorno per ratto, vedi Tabella dei materiali) e fornire un accesso illimitato all'acqua.
3. Contrassegnare le code degli animali utilizzando un marcatore di inchiostro permanente non tossico.
4. Prima di iniziare l'esperimento comportamentale, maneggia i ratti per almeno una settimana fino a quando non sono abituati a essere gestiti dagli sperimentatori e introduci i ratti ai pellet di cibo gratificanti per ridurre la neofobia alimentare.

2. Preparazione dell'hardware e del software di controllo

1. Aprire il software IDE (Integrated Development Environment) disponibile gratuitamente (vedere Tabella dei materiali). Fare clic su File > Apri e fare clic sullo script per il controllo hardware (File supplementare 1).
2. Collegare il microcontroller USB al computer. Verificare se le informazioni sulla scheda e sul processore scelte automaticamente corrispondono alla scheda del microcontrollore collegata facendo clic su Strumenti nella metà in alto a sinistra dello schermo. Selezionare le informazioni corrispondenti sulla scheda e sul processore e fare clic su Porta per selezionare la porta disponibile.
3. Nella metà superiore sinistra dello schermo, fai clic su Sketch > Includi libreria > Gestisci librerie. Nella finestra di Library Manager appena aperta, digitare il termine "Adafruit Motor Shield V2" nella barra di ricerca e fare clic sul pulsante Installa nella libreria corrispondente. Ripeti lo stesso processo per il termine di ricerca "Adafruit Neopixel".
4. Nella metà in alto a sinistra dello schermo, fai clic su Verifica (il pulsante con un segno di spunta) per assicurarti che non ci siano errori nello script. Fare clic su Carica (il pulsante con una freccia a destra) per caricare lo script sulla scheda del microcontrollore.

3. Preparazione del software di controllo dell'esperimento

1. Assicurarsi che tutti e quattro gli script e le funzioni per il controllo dell'esperimento si trovino nella stessa cartella.
   1. Apri la piattaforma di programmazione, fai clic sulla scheda della barra degli strumenti HOME nella metà superiore dello schermo e fai clic su Imposta percorso. Fare clic su Aggiungi cartella e selezionare la cartella contenente tutti gli script di controllo dell'esperimento.
   2. Fare clic su Salva e chiudere la finestra Imposta percorso. Fare clic su Apri nella scheda home della barra degli strumenti nella metà superiore dello schermo e aprire i seguenti script e funzioni: Utente (file supplementare 2), Scala (file supplementare 3) e DataProc (file supplementare 4).
2. Seguire le istruzioni per il download e l'installazione del software Psychtoolbox per abilitare la funzionalità del pulsante ESC utilizzata dalla casella degli strumenti (vedere Tabella dei materiali per il collegamento di accesso).

4. Configurazione dei parametri utilizzati nella casella degli strumenti 5-CSRTT

1. Prepara la cassetta degli attrezzi per l'assuefazione.
   NOTA: la Figura 2 rappresenta l'apparato 5-CSRTT utilizzato per lo studio corrente.
   1. Selezionare lo script utente aperto. Assicurarsi che la variabile di assuefazione sulla riga 7 sia impostata su 'true'. Scrivi un numero in minuti (ad esempio '30' per 30 min) sulla riga 8 per impostare un limite di tempo per l'assuefazione. Sulla riga 9, scrivi un numero compreso tra 0,01 e 1 (piena luminosità) per scegliere un livello di luminosità per la luce di stimolo.
      NOTA: il livello di luminosità utilizzato in questo progetto è impostato su 0,2.
   2. Condurre l'esperimento comportamentale (passaggio 5).
2. Preparare la casella degli strumenti per la sessione dell'esperimento.
   1. Selezionare lo script utente aperto. Assicurarsi che la variabile sulla riga 7 sia definita come "false".
   2. Nella riga 12, digitare il percorso della directory in cui verranno salvati automaticamente i dati dell'esperimento (ad esempio, "C:\Users\trainer\Desktop\5CSRTT"). Assicurarsi che esista una directory con questo nome esatto.
   3. Digitare l'identificazione del soggetto alla riga 13 (ad esempio 'red1').
   4. Assicurarsi che la variabile alla riga 14 sia definita come "true", in modo che i dati generati vengano salvati automaticamente nel percorso della directory.
   5. Assicurarsi che la variabile sulla riga 15 sia definita come "true" e digitare un numero sulle righe 16 e 17 per impostare rispettivamente un limite di prova e di tempo (in min), dopo di che il programma si fermerà automaticamente.
   6. Configurare i parametri per un paradigma 5-CSRTT standard.
      1. Verificare se la variabile sulla riga 32 è impostata su "true" per una consegna gratuita di pellet prima della prima prova. Definire la variabile sulla riga 33 come "true" per garantire una voce di rivista prima dell'inizio di ogni prova. Controllare se la variabile sulla riga 34 è impostata come "definita" e digitare un numero sulla riga 35 per specificare la lunghezza dell'ITI in secondi.
      2. Assicurarsi che la variabile definita sulla riga 37 sia impostata su "true" in modo che le prove con risposte premature non influenzino il limite di prova della sessione. Digitare un valore numerico sulla riga 38 che definirà la lunghezza di attesa limitata (LH) in secondi.
      3. Assicurarsi che la variabile sulla riga 39 sia impostata su 'none' e che la variabile sulla riga 40 sia definita come 'false'. Digitare un numero sulla riga 41 per definire la lunghezza TO in secondi e assicurarsi che la variabile sulla riga 42 sia impostata su 'false'.
      4. Digitare un valore numerico sulla riga 45 che corrisponda al numero di aperture che possono essere illuminate (ad esempio, '5'). Assicurarsi che la variabile sulla riga 46 sia definita come "pseudocasuale" o "casuale" e digitare un numero sulla riga 47, impostando la lunghezza StD in secondi. Verificare se la variabile alla riga 48 è definita come «singola» e il valore numerico alla riga 49 è «1». Sulla riga 50, digitare un numero per definire la luminosità dello stimolo target.
      5. Verificare se le variabili sulle righe 64 e 65 sono definite rispettivamente come "binarie" e "non dipendenti". Digitare un valore numerico alla riga 71 corrispondente al numero di pellet alimentari da rilasciare a seguito di un corretto colpo al naso.
      6. Condurre l'esperimento comportamentale (passaggio 5).
   7. Configurare i parametri per un paradigma 5-CSRTT non standard.
      NOTA: tutti i passaggi descritti in questo sottocapitolo sono facoltativi.
      1. Se si desidera un controllo automatico delle prestazioni per l'utilizzo della procedura di addestramento automatico della scala, assicurarsi che la variabile sulla riga 18 sia definita come "true" e digitare un valore numerico sulla riga 20 che definisca la frequenza del controllo delle prestazioni. Digitare un numero alla riga 21 per definire il numero minimo di prove da completare durante la sessione corrente prima di calcolare le prestazioni del soggetto. Assicurarsi che la variabile sulla riga 21 sia definita come "tutte" in modo che tutte le prove della sessione corrente siano incluse nel controllo delle prestazioni.
      2. Assicurarsi che la variabile sulla riga 22 sia impostata su 'true' in modo che il programma aggiorni i parametri della sessione corrente in modo che corrispondano a una sessione completata in precedenza. Sulla riga 23, digita "più recente" per stabilire che verrà caricata l'ultima sessione.
         NOTA: Il programma aggiornerà i parametri in base alle specifiche nella funzione "Scala", saltando al livello precedentemente completato. Un set di dati specifico da caricare può anche essere scelto digitando il percorso esatto del file di dati con ".mat" finale.
      3. Se si desidera la formazione comportamentale automatizzata, assicurarsi che la variabile sulla riga 26 sia impostata su "true". Digitare un valore numerico alle righe 27 e 28 per definire rispettivamente il livello di allenamento da cui iniziare e il numero totale di livelli disponibili. Se è auspicabile una divisione delle coorti, digitare un nome (ad esempio, 'gruppo1') alla riga 29 che specifica il gruppo.
         NOTA: ogni gruppo può utilizzare il proprio set di livelli di allenamento e criteri per gli aggiornamenti dei livelli. I parametri per ciascun gruppo sono definiti nella funzione "Scala" (punto 4.2.8.).
      4. Alla riga 34, digitare 'random' se si desidera una durata ITI randomizzata. Digitare un intervallo numerico (ad esempio, '[0,2]') per definire l'intervallo contenente un numero randomizzato che verrà aggiunto alla durata ITI fissa.
      5. Per garantire che gli studi con risposte premature influenzino il limite di prova della sessione, digitare "false" sulla riga 37.
      6. Per definire una finestra temporale durante la quale ulteriori colpi di naso verranno conteggiati come risposte perseveranti, digitare un valore numerico alla riga 39. Digita "true" sulla riga 40 in modo che le risposte premature evochino un timeout.
      7. Per definire diversi raggruppamenti delle aperture target, digitare 'vicino', 'spostato' o 'tutto' sulla riga 48. Digitare un valore numerico sulla riga 49, definendo il numero totale di aperture di destinazione. Se si desiderano stimoli attenuati, digitare un valore numerico sulle linee 51 e 52, definendo rispettivamente il numero totale di aperture dimmerate e la sua luminosità.
      8. Se si desidera l'emissione di un tono corto (Tone C4, 262 Hz (Scientific Pitch Notation)) prima della presentazione dello stimolo, assicurarsi che la variabile sulla riga 55 sia impostata su 'true'. Digitare valori numerici sulle righe 56, 57 e 58 per definire la finestra temporale (in millisecondi) tra il tono e la presentazione dello stimolo dell'oratore, la durata del tono (in millisecondi) e il volume del tono (sono consentiti numeri compresi tra 0 (nessun tono) e 1 (volume pieno).
      9. Se si desidera l'emissione di un tono corto (Tono C6, 1047 Hz) dopo un colpo al naso riuscito, assicurarsi che la variabile sulla riga 59 sia impostata su "true". Digitare un valore numerico sulle righe 60 e 61 che definiscono la durata del tono (in millisecondi) e il volume del tono (sono consentiti numeri compresi tra 0 (nessun tono) e 1 (volume pieno).
      10. Se le risposte in aperture illuminate attenuate devono essere premiate, assicurarsi che la variabile sulla riga 64 sia impostata su "non binaria". Digitare un valore numerico sulla riga 73 per definire il numero di pellet alimentari consegnati per i colpi di naso in aperture illuminate attenuate.
      11. Se si utilizza più di un distributore di pellet, digitare il numero di motore corrispondente sulle linee 70 e 72 per i colpi al naso nelle aperture del bersaglio e nelle aperture illuminate attenuate.
          NOTA: il numero del motore può essere 1 o 2. I corrispondenti terminali a vite M3 e M4 dello scudo motore sono definiti nello script per il controllo hardware.
      12. Se si desidera classificare la ricompensa in base al tempo di reazione, assicurarsi che la variabile sulla riga 65 sia impostata su "dipendente".
          1. Definire la dipendenza dei nose-poke nelle aperture target digitando valori numerici sulla riga 67 che divideranno il tempo di reazione (in secondi), il numero del motore e il numero di pellet alimentari da erogare in diverse categorie, in modo tale che un intervallo di tempo di reazione specifico corrisponda a un numero di motore scelto e al numero di pellet.
          2. Digitare i numeri sulla riga 68 per definire diverse categorie per il tempo di reazione (in secondi), il numero del motore e il numero di pellet di cibo da consegnare per i colpi di naso in aperture illuminate attenuate.
   8. Configurare la funzione Scala seguendo i passaggi seguenti.
      NOTA: questo passaggio è facoltativo.
      1. Selezionare la funzione Scala aperta. Nella riga 4, digitare il nome del primo gruppo (ad esempio 'gruppo1'). Se del caso, digitare il nome del secondo gruppo (ad esempio «gruppo2») alla riga 77.
      2. Per modificare i parametri per il secondo livello di allenamento per il primo gruppo, digitare uno dei parametri calcolati nel controllo delle prestazioni sulla riga 17 (ad esempio, PerformanceCheck.NumCorrect > = 30 se i criteri rispondono correttamente a 30 colpi di naso).
         NOTA: non modificare il parametro "Config_trigger == 2" quando si utilizza il caricamento automatico della sessione precedente (passaggio 4.2.7.2.).
      3. Alla riga 19, digitare una variabile che si desidera aggiornare e un valore numerico, se applicabile (ad esempio, 'Config.LED.StimDuration = 30' per impostare la lunghezza StD su 30 s).
         NOTA: Il numero di parametri da modificare e il loro nuovo valore possono essere scelti liberamente. L'unico requisito è che il parametro da aggiornare debba essere digitato dopo la variabile 'UpdateTrigger = 1' in ogni livello desiderato dall'aggiornamento.
   9. Configurare la funzione "DataProc".
      1. Selezionare la funzione DataProc aperta. Se è necessario tracciare e salvare automaticamente un grafico con la panoramica della sessione, digitare i comandi per il grafico desiderato dalla riga 83 in poi.
         NOTA: I comandi correnti dalla riga 83 in poi tracciano una panoramica dell'esito della sessione e alcune misure di controllo necessarie come il numero totale di risposte premature o il numero di spinte del pannello alimentare durante un ITI.

5. Esperimento comportamentale

1. Trasportare la gabbia per topi dal vivaio alla sala sperimentale almeno 30 minuti prima dell'assuefazione o della sessione di esperimento per familiarizzare gli animali nella sala prove.
2. Per la sessione di assuefazione, preparare la camera operante posizionando due pellet di cibo di ricompensa in ciascuna delle aperture e cinque pellet di cibo nella porta della rivista. Configurare i parametri per la sessione seguendo i passaggi da 2 a 4.1.
   NOTA: La camera operante utilizzata per questo protocollo era una scatola in PVC Skinner modificata con dimensioni 30 x 30 x 45 cm.
   NOTA: per la prima fase di assuefazione, fissare la porta a ribalta del caricatore in modo che rimanga aperta. Per la seconda fase di assuefazione, rimuovere il nastro sulla porta a ribalta del caricatore.
3. Selezionare lo script utente aperto. Assicurarsi che la descrizione 'COM' sulla riga 75 corrisponda alla porta disponibile scelta nel passaggio 2.2. Se non corrisponde, modificare il valore numerico nello script di controllo dell'esperimento (ad esempio, da 'COM3' a 'COM4').
4. Posizionare delicatamente i ratti nella camera.
5. Nello script utente aperto, fare clic sulla scheda della barra degli strumenti EDITOR nella metà superiore dello schermo, quindi fare clic sul pulsante di riproduzione verde Esegui. Verificare se il programma funziona correttamente leggendo le informazioni "Finestra di comando".
6. Per interrompere l'esperimento in qualsiasi momento, premere il tasto ESC sulla tastiera del computer. Attendere che venga visualizzato un messaggio sul display della finestra di comando. Digitare "y" e premere il tasto Invio sulla tastiera del computer per interrompere la sessione corrente e salvare i dati acquisiti.
7. Quando viene raggiunto il limite di tempo di assuefazione o di sessione o di prova (rispettivamente i passaggi 4.1.1 o 4.2.5), controllare il messaggio visualizzato nella finestra di comando. Digita "y" e premi il tasto Invio sulla tastiera del computer per interrompere la sessione corrente.
   NOTA: il messaggio verrà visualizzato solo all'inizio di una nuova prova e interromperà la sessione in corso fino a quando non verrà digitata una risposta ("y" per interrompere la sessione o "n" per continuare l'esperimento).
8. Nel caso di una sessione di assuefazione, controlla se il ratto ha consumato tutti i pellet di cibo. Ripetere la fase di assuefazione fino a quando tutti i pellet vengono consumati prima di avanzare alla fase di assuefazione successiva o, dopo la seconda fase, iniziare l'allenamento 5-CSRTT.
9. Dopo la sessione, pulire le pareti e il pavimento della camera operante, ad esempio con una soluzione di etanolo al 70% e un tovagliolo di carta. Prima di introdurre il prossimo ratto, attendere 2-3 minuti fino a quando l'odore di etanolo si dissipa.
10. Al termine della giornata dell'esperimento, scollegare il microcontroller USB dal computer. Facoltativamente, chiudere entrambi gli script per l'hardware e il controllo dell'esperimento.

Risultati

Figura 2: L'apparato 5-CSRTT utilizzato per lo studio corrente. L'apparato funziona su un laptop dotato del toolbox 5-CSRTT, che fornisce uno script per il controllo del microcontrollore e di tutte le apparecchiature correlate e più script per il controllo dell'esperimento 5-CSRTT. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La cassetta degli attrezzi completamente personalizzabile è facile da usare e si basa su un microcontrollore a scheda singola e componenti elettrotecnici standard. La Figura 3 mostra un circuito semplificato e uno schema elettrico. L'intera apertura è composta da 5 LED come stimoli luminosi e cinque sensori a infrarossi per rilevare i colpi del naso. La luce della casa è composta da una striscia con otto LED e la rivista alimentare è composta da un'apertura con una porta a ribalta con un micro interruttore, un distributore di pellet motorizzato e una striscia con otto LED per l'illuminazione. Il circuito esemplifica anche le connessioni per componenti opzionali come l'altoparlante cicalino passivo per il feedback uditivo e un potenziometro digitale per la regolazione del volume. Per un elenco delle attrezzature utilizzate nello sviluppo di questa cassetta degli attrezzi, vedere Tabella dei materiali.

Figura 3: Circuito semplificato dell'hardware del microcontrollore. Per essere facilmente e rapidamente personalizzabile, l'apparecchiatura del microcontrollore è collegata tramite una breadboard. Dall'alto a sinistra verso il basso a sinistra, in senso orario: una scheda microcontrollore è collegata a uno schermo motore e un motore CC (che rappresenta il motore erogatore di pellet). A destra ci sono le strisce LED per le luci della casa e della rivista alimentare, e al centro ci sono tutti e cinque i LED bianchi per la luce di stimolo e le cinque coppie di sensori a infrarossi utilizzate nelle aperture. Sotto la scheda del microcontrollore c'è un semplice microinterruttore (che rappresenta l'interruttore utilizzato nella porta a ribalta del caricatore alimentare). Infine, un altoparlante cicalino passivo e un potenziometro digitale sono raffigurati al centro. Questa immagine è stata realizzata utilizzando il software open source Fritzing. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Collegamento e funzioni di tutti i componenti degli script di controllo dell'esperimento e diagramma semplificato della funzione "Codice". (A) Lo script "Utente" invia i suoi parametri alla funzione "Codice", che a sua volta si collega direttamente alla funzione "Scala", consentendogli di aggiornare qualsiasi parametro utilizzato nella funzione "Codice" mentre l'esperimento è in corso. La funzione "Code" invia quindi i suoi risultati alla funzione "DataProc" alla fine della sessione. (B) Prima di iniziare una sessione di esperimento, la funzione "Codice" controlla prima se si suppone che avvii il protocollo di assuefazione. In caso contrario, imposta i parametri in base alle definizioni scelte nello script "Utente". Prima dell'inizio di ogni prova, la funzione controlla quindi se è stato premuto il tasto ESC sulla tastiera. In caso contrario, continua con una nuova prova. In caso contrario, interrompe la sessione dell'esperimento e passa i dati raccolti alla funzione DataProc. Questo controllo critico prima di ogni inizio della prova consente al programma di fermarsi prima che venga raggiunto qualsiasi limite di tempo scelto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Le interazioni tra i diversi script di controllo dell'esperimento possono essere visualizzate nella Figura 4A. Lo script "User" include tutti i parametri che definiscono l'esperimento. Lì, le variabili che determinano i tempi dell'esperimento, il numero e la luminosità degli stimoli illuminati, la durata dell'ITI e simili possono essere scelte liberamente. La funzione Codice (Fascicolo Supplementare 5) include una descrizione dettagliata di un singolo studio e di tutti i possibili risultati, che viene ribadita durante l'esperimento, come mostrato nella Figura 4B. Inoltre, consiste in un protocollo per l'assuefazione dell'animale all'apparato. La funzione Codice controlla inoltre regolarmente le prestazioni dell'animale. Inoltre, la funzione Scala è opzionale. Le prestazioni del soggetto vengono confrontate con i criteri precedentemente impostati e i parametri desiderati vengono aggiornati automaticamente se le prestazioni dell'animale soddisfano questi criteri. La funzione Scala può anche considerare i risultati acquisiti dalla sessione del giorno precedente. Durante l'esecuzione dell'esperimento, un controllo delle prestazioni alla fine di una prova calcolerà l'accuratezza, le omissioni e il numero totale di risposte corrette delle prove completate e confronterà il risultato con i criteri desiderati per un aggiornamento del livello, come specificato nella funzione Scala. Infine, la funzione DataProc elabora tutti i dati raccolti e genera semplici grafici per un'analisi rapida. Al termine di una sessione, la casella degli strumenti salva automaticamente tutti i dati in un file *.mat e genera un file *.xlsx aggiuntivo con le informazioni essenziali dell'esperimento.

Figura 5: Esempio di diverse configurazioni di stimolo del toolbox 5-CSRTT. Il diagramma esemplifica le possibili combinazioni di stimoli target in dipendenza dalla configurazione scelta. Entrambe le configurazioni "tutte" e "singole" sono utilizzate nel paradigma standard (per l'assuefazione e l'esperimento comportamentale). Le configurazioni "vicina" e "spostata" mostrano configurazioni di stimolo non standard, consentendo l'uso di altri numeri di stimoli accesi, che possono anche avere un contrasto diverso rispetto allo stimolo target. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il passaggio del protocollo 4.2.7.7 menziona una caratteristica opzionale: la modifica del raggruppamento delle aperture di destinazione. Il paradigma standard 5-CSRTT fa uso di un singolo stimolo target. Qui, esemplifichiamo come la cassetta degli attrezzi presentata consente modifiche del paradigma standard. La Figura 5 mostra alcune possibili combinazioni di gruppi su un totale di cinque aperture relative alla configurazione scelta. La configurazione "tutte" illumina tutte le aperture disponibili in modo che ogni apertura sia ora un'apertura target, che può essere utile nelle fasi di allenamento iniziale. La configurazione vicina assicura che il numero (scelto liberamente) di aperture target sia adiacente l'una all'altra. Le impostazioni possono essere specificate in modo tale che i vicini non siano identici all'apertura di destinazione, ma siano illuminati a un contrasto inferiore (o anche superiore). L'uso di aperture con diversi contrasti di illuminazione consente di testare nuovi paradigmi, come l'utilizzo di ricompense di diversa classificazione per i colpi di naso nelle aperture ad alto o basso contrasto. La Figura 5 mostra un esempio con tre aperture target con illuminazione identica. La singola configurazione viene in genere utilizzata nello standard 5-CSRTT, in cui viene illuminato solo un singolo target. Infine, la configurazione spostata estende la configurazione vicina. Sposta lo stimolo vicino verso l'ultima o la prima apertura nel caso in cui l'apertura target si trovi rispettivamente nella prima o nell'ultima posizione. Come nella configurazione vicina, la forza di illuminazione dei vicini può essere scelta liberamente, essendo la stessa o diversa dall'apertura del bersaglio. Inoltre, il numero di stimoli luminosi complessivi può essere scelto liberamente. La cassetta degli attrezzi calcola quindi automaticamente tutti gli stimoli possibili. Tuttavia, il parametro "Config.LED.NumHighLED" deve essere impostato su "1" per questa configurazione.

Seguendo il protocollo, l'addestramento dei ratti (N = 10) per il 5-CSRTT è stato eseguito secondo le fasi di addestramento presentate nella Tabella 1.

Tabella 1: Programma di formazione 5-CSRTT e criteri per passare al livello successivo. (A) L'intervallo tra le prove è stato mantenuto costante a 5 s in ogni livello di allenamento. (B) Durata dello stimolo per ogni livello di allenamento. (C) Finestra temporale Limited Hold (LH), il tempo massimo tollerato tra lo stimolo spento e qualsiasi risposta al naso. (D) Il numero totale di risposte corrette necessarie per superare il rispettivo livello di formazione. (E) La percentuale di accuratezza è calcolata come . (F) La percentuale di errori di omissione è definita come . Questo criterio non include risposte premature. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Le prestazioni dei ratti sono state confrontate con il numero di giorni di allenamento (sessioni) necessari per completare ciascun livello di allenamento indicato nella Tabella 1. Tutti gli animali hanno iniziato al livello di addestramento 1 con un StD e LH di 60 s ciascuno. Tuttavia, alcuni ratti (N = 5) hanno ricevuto un addestramento di assuefazione potenziato per testare alcune delle opzioni di stimolo aggiuntive riportate in precedenza, il che spiega la differenza nel numero di sessioni in cui i singoli animali sono rimasti nel livello di allenamento 1. Il completamento del livello è stato contrassegnato dal raggiungimento di un totale di 30 o più risposte corrette. StD e LH sono diminuiti durante i livelli successivi, mentre i criteri per avanzare al livello di allenamento successivo sono diventati più severi, aumentando la domanda di attenzione del compito ^1,6.

La Tabella 2 mostra il foglio di calcolo *.xlsx generato automaticamente di un ratto di esempio durante una sessione. Il ratto ha iniziato con la configurazione specificata nel livello di allenamento 5. Dopo quattro prove, il ratto è avanzato al livello 6, considerando le prove eseguite nella sessione corrente più l'accuratezza raggiunta nella sessione precedente. Quante prove devono essere eseguite almeno nella sessione corrente per passare al livello di allenamento successivo è specificato nella variabile "Config.Experiment.MinNumTrials". Nella stessa sessione, il ratto è avanzato al livello di allenamento 7 dopo aver completato 66 prove nel livello 6 e aver raggiunto il requisito di > l'80% di precisione e < 20% di omissione. In totale, i ratti sono stati addestrati per 26 giorni utilizzando la configurazione dei livelli di allenamento come indicato nella Tabella 1. Il numero di sessioni trascorse per livello di allenamento è fornito nella Figura 6A. La linea nera mostra la media su tutti i soggetti e ogni linea colorata visualizza i dati di un ratto. Tutti i ratti hanno raggiunto l'ottavo livello entro 14-22 sessioni (Figura 6B). La figura 6C mostra le prestazioni medie dei soggetti per livello di allenamento e in tutti i giorni di formazione nell'apparato 5-CSRTT. La linea nera tratteggiata rappresenta la percentuale di precisione e la linea nera diritta rappresenta la percentuale di omissione. L'accuratezza è stata calcolata come il rapporto tra il numero di risposte corrette e il numero totale di risposte. Le omissioni sono state calcolate come il rapporto tra il numero di omissioni e il numero totale di processi (cioè la somma delle risposte corrette, delle risposte errate e delle omissioni). La linea grigia indica il numero totale medio di risposte corrette in tutte le prove in ogni livello. La Figura 6D mostra la precisione finale raggiunta da ciascun soggetto all'ottavo e ultimo livello di allenamento.

In media, i ratti hanno trascorso 5,9 sessioni (±1,03 SEM) per completare il livello 1, tra 1,5 (±0,17) e 3,5 (±0,5) sessioni per completare il livello da 2 a 6 e 1,7 (±0,16) sessioni per completare il livello 7 prima di raggiungere il livello finale 8. Come è evidente dalla Figura 6A, la varianza tra i soggetti era più significativa nei livelli iniziali (SD = 3,25 nel livello 1, 1,58 nel livello 2) e diminuiva nei livelli successivi (0,47 e 0,48 nei livelli 6 e 7, rispettivamente). Nel livello 4, quando la durata dello stimolo è stata ulteriormente ridotta, il numero medio di sessioni trascorse (2,6 ± 0,52) e la varianza tra i ratti (1,64) sono aumentati, con due ratti che hanno impiegato 5 e 6 giorni per concludere il livello.

Figura 6: Risultati dell'esperimento comportamentale con la cassetta degli attrezzi 5-CSRTT. (A) Il numero di sessioni eseguite a ciascun livello di allenamento. La linea nera raffigura il numero medio di sessioni di tutti i soggetti per ogni livello (media ± SEM) e le linee colorate rappresentano i dati dei singoli soggetti. (B) Il numero assoluto di sessioni necessarie per raggiungere il livello finale, per materia. (C) Misure medie delle prestazioni durante l'allenamento (media ± SEM). La linea nera tratteggiata raffigura l'accuratezza di tutti i soggetti in tutte le risposte date in tutte le sessioni per livello di allenamento e la linea nera mostra la percentuale di omissione corrispondente. La linea grigia rappresenta il numero medio assoluto di risposte corrette di tutti i soggetti a ciascun livello di allenamento. (D) Accuratezza per materia durante l'ottavo e ultimo livello di formazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 2: Dati raccolti da un ratto di esempio durante una sessione di allenamento. La colonna A visualizza il conteggio delle prove durante la sessione per quanto riguarda il livello di allenamento corrente, come mostrato nella colonna B. La colonna C visualizza la durata dell'ITI e la colonna D visualizza l'ora di inizio della prova. Le colonne da E a I mostrano il livello di luminosità per lo stimolo LED nelle aperture da 1 a 5, rispettivamente. Un livello di luminosità pari a 0 significa che lo stimolo era spento e un livello di luminosità di 0,2 significa che lo stimolo è stato attivato con il 20% della sua intensità massima. Le colonne J e K mostrano l'ora esatta in cui lo stimolo è stato acceso e spento, rispettivamente. La colonna L mostra l'esito dello studio: 0 significa "omissione", 1 significa "risposta corretta", 3 significa "risposta errata" (colpo del naso nell'apertura non target) e 4 significa "prematuro". La colonna M mostra quale apertura è stata colpita dal naso durante il processo, mentre la colonna N raffigura l'ora esatta del colpo al naso. Le colonne O, P e Q mostrano rispettivamente l'ora in cui il motore del distributore di pellet è stato acceso, il numero del motore corrispondente e il momento in cui il ratto ha aperto il distributore di pellet per ottenere la sua ricompensa. La colonna R visualizza l'ora di fine della versione di prova. Le colonne S, T, U, V e W mostrano rispettivamente il numero totale di risposte premature, timeout, push del pannello durante un ITI, il numero totale di risposte perseveranti e il runtime totale della sessione in minuti. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

File 1 supplementare: Script per il controllo hardware del software IDE (codice Arduino). Ciò include tutti i comandi per controllare l'hardware e i componenti elettrotecnici della cassetta degli attrezzi. Fare clic qui per scaricare questo file.

File supplementare 2: Script per la funzione "Utente" nel software di controllo dell'esperimento. Questo include tutti i parametri che definiscono l'esperimento. Fare clic qui per scaricare questo file.

File supplementare 3: Script per la funzione "Staircase" nel software di controllo dell'esperimento. Questo monitora le prestazioni del soggetto e lo confronta con i criteri precedentemente impostati. I parametri desiderati vengono aggiornati automaticamente se le prestazioni dell'animale soddisfano questi criteri. Fare clic qui per scaricare questo file.

File supplementare 4: Script per la funzione "DataProc" nel software di controllo dell'esperimento. Questo elabora tutti i dati raccolti e genera semplici grafici per un'analisi rapida. Fare clic qui per scaricare questo file.

File supplementare 5: Script per la funzione "Codice". Ciò include una descrizione dettagliata di un singolo studio e tutti i possibili risultati, che viene ribadita durante l'esperimento. Fare clic qui per scaricare questo file.

Discussione

Il presente protocollo mira a sviluppare e testare un'alternativa a basso costo e completamente personalizzabile all'apparecchiatura standard a 5 scelte per il tempo di reazione seriale a 5 scelte. Di solito, i tipi di apparecchiature disponibili in commercio forniscono un set limitato di funzionalità necessarie per eseguire la ricerca standard 5-CSRTT. Per questo motivo, le modifiche non standard nella progettazione specifica dello studio, come le modifiche alla sequenza di prova o le combinazioni di stimoli target, di solito non sono possibili. Inoltre, molti dei tipi di apparecchiature disponibili sono dotati di software specifici e chiusi che potrebbero non fornire l'accesso a tutti i dati comportamentali dell'esperimento, come il numero di tempi e aperture di risposte premature e perseveranti. Al contrario, il vantaggio vitale della cassetta degli attrezzi qui presentata è - oltre al suo basso costo - la possibilità di implementare molti diversi progetti di prova e paradigmi di ricerca. Attualmente, la cassetta degli attrezzi supporta la definizione di progetti di stimoli multipli, come consentire stimoli attenuati e utilizzare due sistemi di erogazione di pellet e premiare la dipendenza dal tempo di reazione. Supporta anche l'uso di un altoparlante in miniatura per il feedback uditivo. Tuttavia, lo scopo principale è quello di consentire facili modifiche della sequenza di prova in base all'obiettivo dell'utente, come l'introduzione di aperture illuminate attenuate e programmi gratificanti per le attività decisionali o l'integrazione di approcci di formazione di rinforzo positivo all'avanguardia¹¹. Inoltre, tutti i dati grezzi acquisiti durante la sessione sono resi disponibili per ulteriori analisi. Il toolbox fornisce una funzione Staircase per l'allenamento comportamentale automatizzato, che è anche completamente personalizzabile e consente all'utente di modificare i criteri per ogni aggiornamento di livello, il numero di livelli di allenamento e i parametri da aggiornare. Inoltre, l'apparato stesso è altamente adattabile e le modifiche nel design dello studio e nel layout della camera sono facilmente fattibili, rendendo possibile applicare il paradigma 5-CSRTT alle specie animali che necessitano di un design di ricerca diverso da quello offerto dai tipi di apparecchi disponibili in commercio.

Parti specifiche del protocollo per la configurazione del software sono fondamentali per garantire un flusso di lavoro regolare: soprattutto per il primo giorno dell'esperimento, la preparazione sia dell'hardware che del software di controllo dell'esperimento (passaggi 2 e 3) e la configurazione del passaggio 5.3 sono cruciali. Garantire che la connessione della porta seriale tra l'hardware del microcontroller, il suo software e il software di controllo dell'esperimento funzioni correttamente è fondamentale per stabilire una cassetta degli attrezzi 5-CSRTT pienamente funzionante. All'inizio di ogni giornata di esperimento, è consigliabile ripetere i tre passaggi sopra menzionati per assicurarsi che l'hardware e gli script di controllo dell'esperimento siano configurati correttamente.

Infine, l'attuale limitazione del toolbox è la sua implementazione in una piattaforma di programmazione esclusiva, che purtroppo compromette il suo utilizzo come toolbox open source completo. Tuttavia, in linea di principio, la cassetta degli attrezzi dovrebbe essere facilmente adattabile ad altri linguaggi di programmazione come Python poiché il corso di una prova rimane invariato.

Rispetto ai metodi alternativi esistenti, il toolbox 5-CSRTT qui introdotto consente l'implementazione del paradigma standard 5-CSRTT e modifiche di esso come la definizione di una finestra temporale impostata per risposte perseveranti o l'introduzione di stimoli distraenti o rinforzanti come altoparlanti o luci lampeggianti. Oltre ad essere facile da usare e altamente adattabile, l'apparecchio è a basso costo e può essere facilmente replicato, e incentiva la ricerca utilizzando modelli animali non roditori.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1200 Ohm Resistor			Already available in the lab
8-bit 10 kΩ digital potentiometer	Microchip	MCP42010-I/P	From Conrad.de: 1083205
ARD MEGA2560 KIT Arduino - Mega 2560 R3 Lernset	JOY-IT	ARD-Set01	From Reichelt.de: ARD MEGA2560 KIT
ARD SHD MOTOR Arduino Shield - Motor	Adafruit	1438	From Reichelt.de: ARD SHD MOTOR
ARDUINO STACKABLE HEADER KIT - R3	Sparkfun Electronics	PRT-11417	From Antratek.de: PRT-11417
Chow	Altromin	1324 N	Altromin chow products
Euro-Gehäuse	Hammond Electronics	1591EBK	From Conrad.de: 520691
Food pellets	Bio-Serv	F0021	From Bio-serv.com: Dustless Precision Pellets Rodent
Fritzing	Interaction Design Lab Potsdam		Fritzing Software download
Integrated Development Environment	Arduino		Arduino IDE download (Freely available)
IR Break Beam Sensor - 3mm LEDs	Adafruit	2167	From Mouser.de: 485-2167
Laptop or Computer
LED white round 5mm 2000mcd 20mA	TruComponents	1573731	From Conrad.de: 1573731
Microswitch	Hartmann	MBB1 01 A 01 C 09 A	From Conrad.com: 707243
NeoPixel Stick - 8 WS2812 5050 RGB LEDs	Adafruit	1426	From Reichelt.de: DEBO LED NP8 2
Passive buzzer Speaker	Conrad Components	93038c213a	From Conrad.de: 1511468
Pellet release disk			Already available in the lab. Similar products depicted below. Keep in mind that some of these products make use of different (and stronger) motors and infrared sensors. The use of the microswitch (row 7) and the  Arduino Motor Shield (row 3) need to be adapted to fit these new specifications. We recommend 3d printing the disk to work with the provided materials and software. Carbatec universal base plate Open Science Framework Open Feeder Open Ephys 3d Model Food Pellet Dispenser Campden Instruments 45mg pellet dispenser
Programming platform	Mathworks	R2019b or younger
Psychtoolbox Software		V3	Psychtoolbox-3 download
Spur GEAR-MOTOR with DC brush motor	Micromotors	B138F.12.208	Micromotos Series B138F Technical data