Uma caixa de ferramentas de tarefa de tempo de reação serial de 5 opções de código aberto e totalmente personalizável para treinamento comportamental automatizado de roedores

Resumo

O presente protocolo descreve o desenvolvimento de uma caixa de ferramentas de tempo de reação serial de 5 opções de código aberto para modelos animais roedores, usando Arduino e hardware relacionado e uma caixa de ferramentas Matlab versátil, incluindo um script opcional para treinamento comportamental automatizado. Os scripts são personalizáveis e facilitam a implementação de diferentes projetos de teste e teste.

Resumo

A tarefa de tempo de reação serial de 5 opções (5-CSRTT) é um teste comportamental frequentemente usado para estudar a atenção visuosespacial e a impulsividade em roedores. A tarefa exige que os animais aloquem atenção a uma matriz horizontal de cinco pequenas aberturas equipadas com fontes de luz e, dentro de uma janela de tempo limitada, cutuque uma abertura de alvo iluminada para obter uma recompensa alimentar na revista de alimentos localizada na parede oposta da câmara. A tarefa considera medidas de controle comportamental, como precisão de resposta e tempos de reação e permite inferir atenção seletiva e impulsividade. A dificuldade da tarefa pode ser controlada modificando a duração do estímulo e o desenho da tarefa em geral. O aparelho comercialmente disponível geralmente consiste em uma câmara experimental e software específico para especificar parâmetros de tarefa, mas devido a hard-e software fixos, eles representam muitas limitações sobre mudanças no design experimental geral e requisitos de tarefas específicas e a saída de dados relacionada. Este artigo explica uma alternativa totalmente personalizável baseada em um microcontrolador de placa única fácil de usar e componentes eletrotécnicos padrão, um script Arduino de acesso aberto e uma caixa de ferramentas Matlab para controle de hardware e especificações de tarefas comportamentais, respectivamente. A caixa de ferramentas inclui um procedimento de escada opcional, permitindo treinamento comportamental automatizado. A configuração completa de hardware, que pode ser instalada em câmaras personalizadas, e o software livremente adaptável incentivam tarefas não padronizadas e design de câmara. O design do sistema e o código de código aberto para controle de hardware e configuração experimental são descritos.

Introdução

O 5-CSRTT é um teste comportamental, frequentemente utilizado em roedores para estudar processos de atenção visual e impulsividade ^1,2,3,4,5,6, como determinar o papel do sistema colinérgico na atenção e a influência dos inibidores de recaptação de norepinefrinas em comportamentos impulsivos⁷ . O aparelho padrão permite observar várias medidas de controle, como precisão de resposta, tempos de reação, comportamento impulsivo e compulsivo, capacidade motora e motivação 1,2,3,4,5. Consiste em uma matriz horizontal de cinco aberturas equipadas com LED, uma revista de comida nas paredes da câmara oposta às aberturas, e luzes da casa ^2,5. Em uma tarefa típica, a luz da casa é iluminada, e o início de uma sessão é marcado pela iluminação da revista de comida, onde uma pelota grátis é entregue. O curso de teste é iniciado quando o animal cutuca o nariz da revista para recuperar a pelota¹. Depois disso, a luz da revista de alimentos é apagada, e o intervalo inter-ensaio (ITI) começa, durante o qual o animal deve direcionar sua atenção para as aberturas. Uma vez que o ITI decorre, uma iluminação de estímulo é apresentada em uma das aberturas ^1,2,5. O estímulo é dado para um comprimento específico conhecido como duração do estímulo (DST). O animal pode responder ao estímulo enquanto está sendo apresentado ou durante uma janela de tempo limitado após o fim da DST, conhecido como porão limitado (LH). Para responder, o animal tem que cutucar o nariz da abertura do alvo e, se feito corretamente, uma recompensa é liberada na revista de alimentos ^1,2,5. Caso contrário, qualquer resposta incorreta, bem como quaisquer respostas antes da apresentação de estímulo (antecipatória ou prematura) ou qualquer falha de resposta (omissão) resulta em um tempo limite (TO), durante o qual a luz da casa é desligada por uma determinada duração ^1,2,5 (Figura 1). Em geral, a precisão do estímulo discriminatório mede o funcionamento da atenção, enquanto as respostas prematuras e perseverantes (respostas repetidas nas aberturas após apresentação de estímulo) são consideradas medidas de comportamento impulsivo e compulsividade, respectivamente 1,4,5,6.

Figura 1: Possíveis sequências de ensaio de um típico 5-CSRTT. Após o intervalo intertrial, a luz de estímulo é acesa por uma duração específica e, em seguida, desligada durante o intervalo de espera limitada. O rato pode responder corretamente e receber uma recompensa ou responder incorretamente e obter um tempo limite durante este tempo. Se o rato não responder a tempo, sua omissão resulta em um tempo limite. Da mesma forma, se ele responder antes da apresentação do estímulo leve, sua resposta prematura resulta em um intervalo. Outro teste começa após a coleta da recompensa ou o fim do período de intervalo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O 5-CSRTT é amplamente utilizado devido à sua flexibilidade: ao alterar parâmetros do projeto de ensaio, diferentes subcategorias de atenção podem ser investigadas. Por exemplo, enquanto o animal deve dividir sua atenção através das cinco aberturas diferentes (atenção visuosespacial), o uso de estímulos irrelevantes (por exemplo, estímulos auditivos) permite o teste de atenção seletiva ou sustentada 1,2,5,6. Para isso, a configuração experimental pode ser estendida por meio da inclusão de alto-falantes, que podem ser usados como distrativos ou até mesmo reforços^de estímulos 1,2,5,6. Além disso, a carga atencional pode ser diretamente modulada alterando a apresentação de estímulo ou randomizando a duração do ITI¹⁰. O 5-CSRTT não é usado apenas em roedores ^3,7, mas recentemente foi adaptado para testar primatas não humanos ^1,7,8 e^{peixes 7,9}, mostrando ainda mais sua viabilidade. Uma caixa de ferramentas 5-CSRTT totalmente personalizável permite uma fácil adaptação do paradigma de roedores padrão para outros modelos animais. Além disso, a flexibilidade de personalização da caixa de ferramentas 5-CSRTT também incentiva a pesquisa usando projetos de tarefas não padronizados.

A caixa de ferramentas 5-CSRTT totalmente personalizável apresentada aqui contém um script Arduino para controle de hardware, programado em um ambiente de desenvolvimento integrado. Ele também consiste em uma caixa de ferramentas Matlab (versão R2019b ou mais jovem) para controle de experimentos. O protocolo a seguir explica como configurar a caixa de ferramentas 5-CSRTT com o paradigma padrão amplamente utilizado e mostra configurações opcionais para paradigmas não padronizados.

Protocolo

O procedimento experimental neste protocolo foi realizado seguindo as recomendações da diretiva da UE 2010/63 para o Bem-Estar dos Animais Experimentais e de acordo com a Lei de Bem-Estar Animal emitida pelo Governo Federal da Alemanha e aprovada pelas autoridades locais. Como a pesquisa exigia apenas treinamento comportamental, nenhum animal foi eutanizado, e todos foram mantidos na criação após a ásição. A pesquisa foi realizada utilizando dez ratos encapuzados lister masculino (4 meses de idade no início do treinamento comportamental).

1. Habitação animal, criação e manuseio

1. Ratos da casa, juntamente com até cinco companheiros de lixo em uma gaiola padrão com material adequado para cama, de acordo com as recomendações do seu comitê de bem-estar animal.
2. Mantenha os ratos em uma sala ventilada com uma temperatura controlada de 20 ± 2 °C e umidade relativa de 50% com um ciclo claro/escuro de 12:12 h, ou de acordo com as recomendações do seu comitê de bem-estar animal. Restringir o acesso a alimentos (12 g de chow por dia por rato, ver Tabela de Materiais) e fornecer acesso irrestrito à água.
3. Marque as caudas dos animais usando um marcador de tinta não tóxico permanente.
4. Antes de iniciar o experimento comportamental, manuseie os ratos por pelo menos uma semana até que eles estejam acostumados a serem manipulados por experimentadores, e introduzem os ratos às pastilhas de alimentos gratificantes para reduzir a neofobia alimentar.

2. Preparação do software de hardware e controle

1. Abra o software de Ambiente de Desenvolvimento Integrado (IDE) disponível gratuitamente (ver Tabela de Materiais). Clique em Arquivo > Abra e clique no script para controle de hardware (Arquivo Complementar 1).
2. Ligue o microcontrolador USB ao computador. Verifique se as informações de placa e processador escolhidas automaticamente correspondem à placa de microcontrolador conectada clicando em Ferramentas na metade superior esquerda da tela. Selecione as informações correspondentes de placa e processador e clique em Porta para selecionar a porta disponível.
3. Na metade superior esquerda da tela, clique em Sketch > Incluir Biblioteca > Gerenciar bibliotecas. Na janela recém-aberta do Library Manager, digite o termo "Adafruit Motor Shield V2" na barra de pesquisa e clique no botão Instalar na biblioteca correspondente. Repita o mesmo processo para o termo de pesquisa "Adafruit Neopixel".
4. Na metade superior esquerda da tela, clique em Verificar (o botão com um marcador de verificação) para garantir que não há erros no script. Clique em Upload (o botão com uma seta à direita) para carregar o script na placa de microcontrolador.

3. Preparação do software de controle de experimentos

1. Certifique-se de que todos os quatro scripts e funções para controle de experimentos estejam localizados na mesma pasta.
   1. Abra a plataforma de programação, clique na guia barra de ferramentas HOME na metade superior da tela e clique em Definir Caminho. Clique em Adicionar pasta e selecione a pasta que contém todos os scripts de controle de experimento.
   2. Clique em Salvar e feche a janela Definir caminho. Clique em Abrir na guia barra de ferramentas HOME na metade superior da tela e abra os seguintes scripts e funções: Usuário (Arquivo Suplementar 2), Escada (Arquivo Suplementar 3) e DataProc (Arquivo Suplementar 4).
2. Siga as instruções para baixar e instalar o software Psychtoolbox para habilitar a funcionalidade do botão ESC usada pela caixa de ferramentas (consulte Tabela de Materiais para o link de acesso).

4. Configuração dos parâmetros utilizados na caixa de ferramentas 5-CSRTT

1. Prepare a caixa de ferramentas para a habituação.
   NOTA: A Figura 2 representa o aparelho 5-CSRTT utilizado para o presente estudo.
   1. Selecione o script do Usuário aberto. Certifique-se de que a variável de habitação na linha 7 seja definida como "verdadeira". Escreva um número em minutos (por exemplo, '30' por 30 min) na linha 8 para definir um prazo para a habitação. Na linha 9, escreva um número entre 0,01 e 1 (brilho total) para escolher um nível de brilho para a luz de estímulo.
      NOTA: O nível de brilho utilizado neste projeto está definido para 0,2.
   2. Realizar o experimento comportamental (passo 5).
2. Prepare a caixa de ferramentas para a sessão de experimento.
   1. Selecione o script do Usuário aberto. Certifique-se de que a variável na linha 7 seja definida como 'falsa'.
   2. Na linha 12, digite o caminho do diretório onde os dados do experimento serão salvos automaticamente (por exemplo, 'C:\Users\trainer\Desktop\5CSRTT'). Certifique-se de que existe um diretório com esse nome exato.
   3. Digite a identificação do sujeito na linha 13 (por exemplo, 'red1').
   4. Certifique-se de que a variável na linha 14 seja definida como 'verdadeira', para que os dados gerados seja automaticamente salvo no caminho do diretório.
   5. Certifique-se de que a variável na linha 15 seja definida como 'verdadeira' e digite um número nas linhas 16 e 17 para definir um teste e limite de tempo (em min), respectivamente, após o qual o programa será automaticamente parado.
   6. Configure os parâmetros para um paradigma padrão 5-CSRTT.
      1. Verifique se a variável na linha 32 está definida como 'verdadeira' para uma entrega gratuita de pelotas antes do primeiro teste. Defina a variável na linha 33 como 'verdadeira' para garantir uma entrada de revista antes do início de cada ensaio. Verifique se a variável na linha 34 está definida como 'definida' e digite um número na linha 35 para especificar o comprimento do ITI em segundos.
      2. Certifique-se de que a variável definida na linha 37 seja definida como "verdadeira" para que os ensaios com respostas prematuras não influenciem o limite de ensaio da sessão. Digite um valor numérico na linha 38 que definirá o comprimento de hold (LH) limitado em segundos.
      3. Certifique-se de que a variável na linha 39 seja definida como 'nenhuma' e que a variável na linha 40 seja definida como 'falsa'. Digite um número na linha 41 para definir o comprimento TO em segundos e certifique-se de que a variável na linha 42 seja definida como 'falsa'.
      4. Digite um valor numérico na linha 45 que corresponda ao número de aberturas que podem ser iluminadas (por exemplo, '5'). Certifique-se de que a variável na linha 46 seja definida como 'pseudorandom' ou 'aleatória' e digite um número na linha 47, definindo o comprimento de D.D. em segundos. Verifique se a variável na linha 48 é definida como 'single' e o valor numérico na linha 49 é '1'. Na linha 50, digite um número para definir o brilho do estímulo alvo.
      5. Verifique se as variáveis das linhas 64 e 65 são definidas como 'binárias' e 'não dependentes', respectivamente. Digite um valor numérico na linha 71 correspondente ao número de pelotas de alimentos a serem liberadas após uma cutucada correta no nariz.
      6. Realizar o experimento comportamental (passo 5).
   7. Configure os parâmetros para um paradigma 5-CSRTT não padrão.
      NOTA: Todas as etapas descritas neste subchapter são opcionais.
      1. Se for desejada uma verificação automática de desempenho para usar o procedimento automatizado de treinamento de escadas, certifique-se de que a variável na linha 18 seja definida como 'verdadeira' e digite um valor numérico na linha 20 definindo a frequência da verificação de desempenho. Digite um número na linha 21 para definir o número mínimo de ensaios a serem concluídos durante a sessão atual antes de calcular o desempenho do sujeito. Certifique-se de que a variável na linha 21 seja definida como 'todas' para que todos os ensaios da sessão atual sejam incluídos na verificação de desempenho.
      2. Certifique-se de que a variável na linha 22 seja definida como 'verdadeira' para que o programa atualize os parâmetros da sessão atual para corresponder a uma sessão previamente concluída. Na linha 23, digite 'mais recente' para estabelecer que a última sessão será carregada.
         NOTA: O programa atualizará os parâmetros com base nas especificações da função "Escadaria", saltando para o nível previamente concluído. Um conjunto de dados específico a ser carregado também pode ser escolhido digitando no caminho exato para o arquivo de dados com o final ".mat".
      3. Se o treinamento comportamental automatizado for desejado, certifique-se de que a variável na linha 26 seja definida como "verdadeira". Digite um valor numérico nas linhas 27 e 28 para definir o nível de treinamento para começar e o número total de níveis disponíveis, respectivamente. Se uma divisão de coortes for desejável, digite um nome (por exemplo, 'grupo1') na linha 29 que especifica o grupo.
         NOTA: Cada grupo pode usar seu próprio conjunto de níveis de treinamento e critérios para atualizações de nível. Os parâmetros para cada grupo são definidos na função "Escadaria" (etapa 4.2.8.).
      4. Na linha 34, digite 'aleatório' se uma duração iti aleatória for desejada. Digite um intervalo numérico (por exemplo, '[0,2]') para definir o intervalo contendo um número randomizado que será adicionado à duração do ITI fixo.
      5. Para garantir que os ensaios com respostas prematuras influenciem o limite de ensaio da sessão, digite 'falso' na linha 37.
      6. Para definir uma janela de tempo durante a qual as cutucadas adicionais do nariz serão contadas como respostas perseverantes, digite um valor numérico na linha 39. Digite 'verdadeiro' na linha 40 para que as respostas prematuras evoquem um tempo limite.
      7. Para definir diferentes agrupamentos das aberturas de alvo, digite 'vizinho', 'deslocado' ou 'tudo' na linha 48. Digite um valor numérico na linha 49, definindo o número total de aberturas de destino. Se forem desejados estímulos escurecidos, digite um valor numérico nas linhas 51 e 52, definindo o número total de aberturas escurecidas e seu brilho, respectivamente.
      8. Se desejar a emissão de um tom curto (Tom C4, 262 Hz (Anotação de Tom Científico)) antes da apresentação do estímulo, certifique-se de que a variável na linha 55 seja definida como "verdadeira". Digite valores numéricos nas linhas 56, 57 e 58 para definir a janela de tempo (em milissegundos) entre o tom do orador e a apresentação de estímulo, a duração do tom (em milissegundos) e o volume do tom (números entre 0 (sem tom) e 1 (volume completo).
      9. Se desejar a emissão de um tom curto (Tom C6, 1047 Hz) após um golpe de nariz bem sucedido, certifique-se de que a variável na linha 59 seja definida como "verdadeira". Digite um valor numérico nas linhas 60 e 61 que definem a duração do tom (em milissegundos) e o volume do tom (números entre 0 (sem tom) e 1 (volume completo).
      10. Se as respostas em aberturas acesas escurecidas forem recompensadas, certifique-se de que a variável na linha 64 seja definida como "não-binária". Digite um valor numérico na linha 73 para definir o número de pelotas de alimentos entregues para cutucadas de nariz em aberturas acesas.
      11. Se usar mais de um distribuidor de pelotas, digite o número correspondente do motor nas linhas 70 e 72 para cutucar o nariz nas aberturas do alvo e aberturas acesas.
          NOTA: O número do motor pode ser 1 ou 2. Os terminais de parafusos M3 e M4 do escudo do motor correspondente são definidos no script para controle de hardware.
      12. Se a classificação da recompensa com base no tempo de reação for desejada, certifique-se de que a variável na linha 65 seja definida como 'dependente'.
          1. Defina a dependência de cutucadas no nariz nas aberturas de destino digitando em valores numéricos na linha 67 que dividirá o tempo de reação (em segundos), o número do motor e o número de pelotas de alimentos a serem entregues em diferentes categorias, de modo que um intervalo específico de tempo de reação corresponda a um número de motor escolhido e número de pelotas.
          2. Digite números na linha 68 para definir diferentes categorias para tempo de reação (em segundos), número do motor e número de pelotas de alimentos a serem entregues para cutucadas de nariz em aberturas acesas.
   8. Configure a função Escadaria seguindo as etapas abaixo.
      NOTA: Esta etapa é opcional.
      1. Selecione a função escada aberta . Na linha 4, digite o nome do primeiro grupo (por exemplo, 'grupo1'). Se for o caso, digite o nome do segundo grupo (por exemplo, 'grupo2') na linha 77.
      2. Para alterar os parâmetros para o segundo nível de treinamento para o primeiro grupo, digite um dos parâmetros calculados na verificação de desempenho na linha 17 (por exemplo, PerformanceCheck.NumCorrect >= 30 se os critérios estiverem respondendo corretamente 30 cutucadas no nariz).
         NOTA: Não altere o parâmetro "Config_trigger == 2" ao utilizar o carregamento automático da sessão anterior (etapa 4.2.7.2.).
      3. Na linha 19, digite uma variável que você deseja atualizar e um valor numérico, se aplicável (por exemplo, 'Config.LED.StimDuration = 30' para definir o comprimento de D.D. para 30 s).
         NOTA: O número de parâmetros a serem alterados e seu novo valor podem ser escolhidos livremente. O único requisito é que o parâmetro a ser atualizado precise ser digitado após a variável 'UpdateTrigger = 1' em cada nível desejado pela atualização.
   9. Configure a função "DataProc".
      1. Selecione a função DataProc aberta. Se um gráfico com a visão geral da sessão precisar ser plotado e salvo automaticamente, digite os comandos para o plot desejado da linha 83 em diante.
         NOTA: Os comandos atuais na linha 83 em diante traçam uma visão geral do resultado da sessão e algumas medidas de controle necessárias, como o número total de respostas prematuras ou o número de empurrões do painel de alimentos durante um ITI.

5. Experimento comportamental

1. Transporte a gaiola de ratos do vivarium para a sala experimental pelo menos 30 minutos antes da habituação ou sessão de experimento para familiarizar os animais para a sala de testes.
2. Para a sessão de habituação, prepare a câmara operante colocando duas pelotas de comida de recompensa em cada uma das aberturas e cinco pelotas de comida na porta da revista. Configure os parâmetros da sessão seguindo as etapas 2-4.1.
   NOTA: A câmara operante usada para este protocolo foi uma caixa de PVC Skinner modificada com dimensões 30 x 30 x 45 cm.
   NOTA: Para a primeira etapa de habitação, grave a porta da aba da revista para permanecer aberta. Para o segundo estágio de habitação, remova a fita na porta da aba da revista.
3. Selecione o script do Usuário aberto. Certifique-se de que a descrição 'COM' na linha 75 corresponda à porta disponível escolhida na etapa 2.2. Se não coincidir, altere o valor numérico no script de controle de experimento (por exemplo, de 'COM3' para 'COM4').
4. Coloque suavemente os ratos na câmara.
5. No script aberto do Usuário, clique na guia barra de ferramentas EDITOR na metade superior da tela e clique no botão reprodução verde Run. Verifique se o programa está sendo executado corretamente lendo as informações da "Janela de Comando".
6. Para interromper o experimento a qualquer momento, pressione a tecla de escape ESC no teclado do computador. Aguarde que uma mensagem apareça no visor da janela de comando. Digite "y" e pressione a tecla Enter no teclado do computador para interromper a sessão atual e salvar os dados adquiridos.
7. Quando o tempo de habituação ou tempo de sessão ou limite de ensaio for atingido (etapa 4.1.1 ou 4.2.5, respectivamente), verifique a mensagem que aparece no visor da janela de comando. Digite "y" e pressione a tecla Enter no teclado do computador para interromper a sessão atual.
   NOTA: A mensagem só será mostrada no início de um novo teste e interromperá a sessão em andamento até que uma resposta seja digitada ("y" para interromper a sessão ou "n" para continuar o experimento).
8. No caso de uma sessão de habitação, verifique se o rato consumiu todas as pelotas de alimentos. Repita o estágio de habitação até que todas as pelotas sejam consumidas antes de avançar para a próxima etapa de habituação ou, após a segunda etapa, iniciar o treinamento 5-CSRTT.
9. Após a sessão, limpe as paredes e o piso da câmara operante, por exemplo, com uma solução de 70% de etanol e papel toalha. Antes de introduzir o próximo rato, espere por 2-3 min até que o cheiro de etanol se dissipa.
10. Quando o dia do experimento acabar, desligue o MICROcontrolador USB do computador. Opcionalmente, feche ambos os scripts para controle de hardware e experimento.

Resultados

Figura 2: O aparelho 5-CSRTT utilizado para o presente estudo. O aparelho é executado em um laptop equipado com a caixa de ferramentas 5-CSRTT, que fornece um script para controlar o microcontrolador e todos os equipamentos relacionados e vários scripts para controlar o experimento 5-CSRTT. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A caixa de ferramentas totalmente personalizável é fácil de usar e baseada em um microcontrolador de placa única e componentes eletrotécnicos padrão. A Figura 3 mostra um circuito simplificado e diagrama de fiação. Toda a abertura consiste em 5 LEDs como estímulos de luz e cinco sensores infravermelhos para detectar cutucadas no nariz. A luz da casa consiste em uma tira com oito LEDs, e a revista de comida é feita de uma abertura com uma porta de retalho com um micro interruptor, um distribuidor de pelotas movido a motor e uma tira com oito LEDs para iluminação. O circuito também exemplifica conexões para componentes opcionais, como o alto-falante de campainha passiva para feedback auditivo e um potencializador digital para ajuste de volume. Para obter uma lista dos equipamentos utilizados no desenvolvimento desta caixa de ferramentas, consulte Tabela de Materiais.

Figura 3: Circuito simplificado do hardware do microcontrolador. Para ser personalizável e rapidamente, o equipamento microcontrolador é conectado através de uma tábua de pão. Da parte superior esquerda para baixo esquerda, no sentido horário: Uma placa microcontroladora é conectada a um escudo motor e a um motor DC (representando o motor dispensador de pelotas). À direita estão as tiras de LED para as luzes da casa e da revista food, e no meio estão todos os cinco LEDs brancos para a luz de estímulo e os cinco pares de sensores infravermelhos usados nas aberturas. Abaixo da placa microcontrolador está um microswitch simples (representando o interruptor usado na porta da aba da revista de alimentos). Finalmente, um alto-falante passivo e um potencialiômetro digital são retratados no meio. Esta imagem foi feita usando o software de código aberto Fritzing. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Linkage e funções de todos os componentes dos scripts de controle do experimento e diagrama simplificado da função "Código". (A) O script "Usuário" envia seus parâmetros para a função "Código", que por sua vez se conecta diretamente à função "Escadaria", permitindo que ele atualize qualquer parâmetro usado na função "Código" enquanto o experimento estiver em andamento. A função "Código" envia seus resultados para a função "DataProc" no final da sessão. (B) Antes de iniciar uma sessão de experimento, a função "Código" verifica primeiro se é suposto iniciar o protocolo de habitação. Caso não, ele configura os parâmetros com base nas definições escolhidas no script "Usuário". Antes de cada teste começar, a função então verifica se a tecla ESC no teclado foi pressionada. Se não, continua com um novo julgamento. Caso contrário, ele interrompe a sessão de experimento e passa os dados coletados para a função DataProc. Esta verificação crítica antes de cada início de teste permite que o programa pare antes que qualquer limite de tempo escolhido seja atingido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Interações entre os diferentes scripts de controle de experimentos podem ser vistas na Figura 4A. O script "Usuário" inclui todos os parâmetros que definem o experimento. Lá, variáveis que determinam o tempo, o número e o brilho do experimento de estímulos iluminados, duração de ITI e afins podem ser escolhidos livremente. A função Código (Arquivo Suplementar 5) inclui uma descrição detalhada de um único ensaio e todos os resultados possíveis, que é reiterado ao longo do experimento, como mostrado na Figura 4B. Além disso, consiste em um protocolo para a habituação do animal ao aparelho. A função Código também verifica regularmente o desempenho do animal. Além disso, a função Escadaria é opcional. O desempenho do sujeito é comparado aos critérios previamente definidos, e os parâmetros desejados são atualizados automaticamente se o desempenho do animal atender a esses critérios. A função Escadaria também pode considerar os resultados adquiridos da sessão do dia anterior. Enquanto o experimento estiver em execução, uma verificação de desempenho no final de um teste calculará a precisão, as omissões e o número total de respostas corretas dos ensaios concluídos e comparará o resultado com os critérios desejados para uma atualização de nível, conforme especificado na função Staircase. Finalmente, a função DataProc processa todos os dados coletados e gera gráficos simples para análise rápida. No final de uma sessão, a caixa de ferramentas salva automaticamente todos os dados em um arquivo *.mat e gera um arquivo extra de *.xlsx com as informações essenciais do experimento.

Figura 5: Exemplo de diferentes configurações de estímulo da caixa de ferramentas 5-CSRTT. O diagrama exemplifica possíveis combinações de estímulos-alvo na dependência da configuração escolhida. Ambas as configurações "all" e "single" são usadas no paradigma padrão (para a habitação e experiência comportamental). As configurações "vizinhas" e "deslocadas" mostram configurações de estímulo não padronizadas, permitindo o uso de outros números de estímulos acessos, que também podem ter um contraste diferente do estímulo-alvo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A etapa 4.2.7.7 do protocolo menciona um recurso opcional: alterar o agrupamento de aberturas de destino. O paradigma padrão 5-CSRTT faz uso de um único estímulo de alvo. Aqui, exemplificamos como a caixa de ferramentas apresentada permite modificações do paradigma padrão. A Figura 5 exibe algumas combinações de grupo possíveis de um total de cinco aberturas relativas à configuração escolhida. A configuração "tudo" acende todas as aberturas disponíveis para que cada abertura seja agora uma abertura de destino, o que pode ser útil nas fases iniciais de treinamento. A configuração do vizinho garante que o número (livremente escolhido) de aberturas de destino será vizinho um do outro. As configurações podem ser especificadas de tal forma que os vizinhos não serão idênticos à abertura do alvo, mas serão iluminados em contraste menor (ou até maior). O uso de aberturas com diferentes contrastes de iluminação permite testar novos paradigmas, como o uso de recompensas de diferentes graus para cutucadas de nariz nas aberturas de alto ou baixo contraste. A Figura 5 mostra um exemplo com três aberturas de destino com iluminação idêntica. A configuração única é normalmente usada no padrão 5-CSRTT, onde apenas um único alvo é iluminado. Finalmente, a configuração deslocada amplia a configuração do vizinho. Ele desloca o estímulo do vizinho para a última ou primeira abertura no caso da abertura do alvo estiver na primeira ou última posição, respectivamente. Como na configuração do vizinho, a força de iluminação dos vizinhos pode ser livremente escolhida, sendo a mesma ou diferente da abertura do alvo. Além disso, o número de estímulos iluminados globais pode ser livremente escolhido. A caixa de ferramentas calcula então todos os estímulos possíveis automaticamente. No entanto, o parâmetro "Config.LED.NumHighLED" deve ser definido como "1" para esta configuração.

Seguindo o protocolo, o treinamento de ratos (N = 10) para o 5-CSRTT foi realizado de acordo com as etapas de treinamento apresentadas na Tabela 1.

Tabela 1: Cronograma de treinamento 5-CSRTT e critérios para passar para o próximo nível. (A) O intervalo inter-trial foi mantido constante em 5 s em todos os níveis de treinamento. (B) Duração do estímulo para cada nível de treinamento. (C) Janela de tempo Limited Hold (LH), o tempo máximo tolerado entre o estímulo desligado e qualquer resposta de cutucar o nariz. (D) O número total de respostas corretas necessárias para passar pelo respectivo nível de treinamento. (E) A porcentagem de precisão é calculada como . (F) Percentual de erros de omissão é definido como . Este critério não inclui respostas prematuras. Clique aqui para baixar esta Tabela.

O desempenho dos ratos foi comparado ao número de dias de treinamento (sessões) necessários para completar cada nível de treinamento dado na Tabela 1. Todos os animais começaram no treinamento nível 1 com DST e LH de 60 s cada. No entanto, alguns ratos (N = 5) receberam treinamento aprimorado de habituação para testar algumas das opções adicionais de estímulo relatadas anteriormente, o que explica a diferença no número de sessões que os animais individuais permaneceram no nível 1 de treinamento. A conclusão do nível foi marcada por atingir um total de 30 ou mais respostas corretas. StD e LH diminuíram durante os níveis seguintes, enquanto os critérios para avançar para o próximo nível de treinamento ficaram mais difíceis, aumentando a demanda de atenção da tarefa ^1,6.

A Tabela 2 mostra a planilha de .xlsx de um exemplo gerada automaticamente durante uma sessão. O rato começou com a configuração especificada no nível de treinamento 5. Após quatro ensaios, o rato avançou para o nível 6, considerando os ensaios realizados na sessão atual mais a precisão alcançada na sessão anterior. Quantos ensaios devem ser realizados no mínimo na sessão atual para avançar para o próximo nível de treinamento é especificado na variável "Config.Experiment.MinNumTrials". Na mesma sessão, o rato avançou para o nível de treinamento 7 após completar 66 ensaios no nível 6 e alcançar a exigência de > 80% de precisão e < omissão de 20%. No total, os ratos foram treinados por 26 dias utilizando a configuração dos níveis de treinamento conforme previsto na Tabela 1. O número de sessões gastas por nível de treinamento é fornecido na Figura 6A. A linha preta mostra a média entre todos os sujeitos, e cada linha colorida exibe os dados de um rato. Todos os ratos atingiram o oitavo nível dentro de 14-22 sessões (Figura 6B). A Figura 6C mostra o desempenho médio dos sujeitos por nível de treinamento e em todos os dias de treinamento no aparelho 5-CSRTT. A linha preta tracejada representa a porcentagem de precisão, e a linha preta reta representa a porcentagem de omissão. A precisão foi calculada como a razão entre o número de respostas corretas e o número total de respostas. As omissões foram calculadas como a razão entre o número de omissões e o número total de ensaios (ou seja, a soma das respostas corretas, respostas incorretas e omissões). A linha cinza indica o número médio total de respostas corretas em todos os ensaios em cada nível. A Figura 6D exibe a precisão final alcançada por cada sujeito no oitavo e último nível de treinamento.

Em média, os ratos passaram 5,9 sessões (± 1,03 SEM) para completar o nível 1, entre 1,5 (±0,17) e 3,5 (±0,5) sessões para completar o nível 2 a 6, e 1,7 (±0,16) para completar o nível 7 antes de atingirem o nível final 8. Como é evidente na Figura 6A, a variância entre os sujeitos foi mais significativa nos níveis iniciais (SD = 3,25 no nível 1, 1,58 no nível 2) e diminuiu nos níveis posteriores (0,47 e 0,48 nos níveis 6 e 7, respectivamente). No nível 4, quando a duração do estímulo foi ainda reduzida, a média de sessões gastas (2,6 ± 0,52) e a variância entre ratos (1,64) aumentaram, com dois ratos levando 5 e 6 dias para concluir o nível.

Figura 6: Resultados do experimento comportamental com a caixa de ferramentas 5-CSRTT. (A) O número de sessões realizadas em cada nível de treinamento. A linha preta retrata o número médio de sessões de todos os sujeitos para cada nível (média ± SEM) e as linhas coloridas representam dados individuais dos sujeitos. (B) O número absoluto de sessões necessárias para atingir o nível final, por sujeito. (C) Medidas médias de desempenho ao longo do treinamento (média ± SEM). A linha preta pontilhada retrata a precisão de todos os assuntos em todas as respostas em todas as sessões por nível de treinamento, e a linha preta mostra a porcentagem de omissão correspondente. A linha cinza retrata o número absoluto médio de respostas corretas de todos os sujeitos em cada nível de treinamento. (D) Precisão por assunto durante o oitavo e último nível de treinamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 2: Dados coletados de um rato de exemplo durante uma sessão de treinamento. A coluna A exibe a contagem de ensaios sobre a sessão em relação ao nível de treinamento atual, como mostrado na coluna B. A coluna C exibe a duração do ITI e a coluna D exibe o tempo de início do teste. As colunas E a I mostram o nível de brilho para o estímulo led nas aberturas de 1 a 5, respectivamente. Um nível de brilho de 0 significa que o estímulo estava desligado, e um nível de brilho de 0,2 significa que o estímulo foi ligado com 20% de sua intensidade máxima. As colunas J e K mostram a hora exata em que o estímulo foi ligado e desligado, respectivamente. A coluna L exibe o resultado do ensaio: 0 significa "omissão", 1 significa "resposta correta", 3 significa "resposta incorreta" (cutucar o nariz na abertura não-alvo) e 4 significa "prematuro". A coluna M mostra qual abertura foi cutucada pelo nariz durante o julgamento, enquanto a coluna N mostra a hora exata do cutuque o nariz. As colunas O, P e Q mostram o tempo em que o motor do distribuidor de pelotas foi ligado, o número do motor correspondente, e o momento em que o rato abriu o distribuidor de pelotas para receber sua recompensa, respectivamente. A coluna R exibe o tempo final do teste. As colunas S, T, U, V e W mostram o número total de respostas prematuras, tempo limite, empurrões de painel durante um ITI, o número total de respostas perseverantes e o tempo total de execução da sessão em minutos, respectivamente. Clique aqui para baixar esta Tabela.

Arquivo Suplementar 1: Script para o controle de hardware do software IDE (código Arduino). Isso inclui todos os comandos para controlar o hardware e componentes eletrotécnicos da caixa de ferramentas. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Arquivo complementar 2: Script para a função "Usuário" no software de controle de experimento. Isso inclui todos os parâmetros que definem o experimento. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Arquivo complementar 3: Script para a função "Escadaria" no software de controle de experimento. Isso monitora o desempenho do sujeito e o compara aos critérios previamente definidos. Os parâmetros desejados são atualizados automaticamente se o desempenho do animal atender a esses critérios. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Arquivo suplementar 4: Script para a função "DataProc" no software de controle de experimento. Isso processa todos os dados coletados e gera gráficos simples para análise rápida. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Arquivo complementar 5: Script para a função "Código". Isso inclui uma descrição detalhada de um único teste e todos os resultados possíveis, o que é reiterado ao longo do experimento. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Discussão

O presente protocolo visa desenvolver e testar uma alternativa de baixo custo e totalmente personalizável ao aparato de tarefa de tempo de reação serial padrão e comercialmente disponível. Normalmente, os tipos de aparelhos disponíveis comercialmente fornecem um conjunto limitado de recursos conforme necessário para executar a pesquisa padrão 5-CSRTT. Por causa disso, modificações não padronizais no design de teste específico, como alterações na sequência de ensaio ou combinações de estímulo de alvo, geralmente não são possíveis. Além disso, muitos dos tipos disponíveis de aparelhos vêm com software específico e fechado que pode não fornecer acesso a todos os dados comportamentais do experimento, como o tempo e o número de abertura de respostas prematuras e perseverantes. Em contrapartida, a vantagem vital da caixa de ferramentas aqui apresentada é - além de seu baixo custo - a possibilidade de implementar muitos projetos de ensaios diferentes e paradigmas de pesquisa. Atualmente, a caixa de ferramentas suporta a definição de projetos de estímulo múltiplo, como permitir estímulos escurecidos e usar dois sistemas de entrega de pelotas e recompensar a dependência do tempo de reação. Ele também suporta o uso de um alto-falante em miniatura para feedback auditivo. No entanto, o objetivo principal é permitir modificações fáceis da sequência de ensaios de acordo com o objetivo do usuário, como introduzir aberturas acesas e programas gratificantes para tarefas de tomada de decisão ou integrar abordagens de treinamento de reforço positivo de última geração¹¹. Além disso, todos os dados brutos adquiridos ao longo da sessão são disponibilizados para análise posterior. A caixa de ferramentas fornece uma função Staircase para treinamento comportamental automatizado, que também é totalmente personalizável e permite que o usuário altere os critérios para cada atualização de nível, o número de níveis de treinamento e os parâmetros a serem atualizados. Além disso, o aparelho em si é altamente adaptável, e mudanças no design do ensaio e no layout da câmara são facilmente viáveis, possibilitando a aplicação do paradigma 5-CSRTT a espécies animais que precisam de um design de pesquisa diferente do que os tipos de aparelhos disponíveis comercialmente oferecem.

Partes específicas do protocolo para a configuração do software são fundamentais para garantir um fluxo de trabalho suave: especialmente para o primeiro dia do experimento, a preparação tanto do software de controle de hardware quanto de experimentos (etapas 2 e 3) e a configuração da etapa 5.3 é crucial. Garantir que a conexão de porta serial entre o hardware microcontrolador, seu software e o software de controle de experimento esteja funcionando corretamente é fundamental para estabelecer uma caixa de ferramentas 5-CSRTT em pleno funcionamento. No início de cada dia de experimento, é aconselhável repetir as três etapas mencionadas acima para garantir que os scripts de controle de hardware e experimento sejam configurados corretamente.

Finalmente, a limitação atual da caixa de ferramentas é sua implementação para uma plataforma de programação exclusiva, que infelizmente compromete seu uso como uma caixa de ferramentas completa de código aberto. No entanto, em princípio, a caixa de ferramentas deve ser facilmente adaptável a outras linguagens de programação, como python, uma vez que o curso de um teste permanece inalterado.

Em comparação com os métodos alternativos existentes, a caixa de ferramentas 5-CSRTT introduzida aqui permite a implementação do paradigma padrão 5-CSRTT e modificações dele, como definir uma janela de tempo definida para respostas perseverantes ou introduzir estímulos de distração ou reforço como alto-falantes ou luzes piscando. Além de ser fácil de usar e altamente adaptável, o aparelho é de baixo custo e pode ser facilmente replicado, e incentiva pesquisas usando modelos animais não roedores.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1200 Ohm Resistor			Already available in the lab
8-bit 10 kΩ digital potentiometer	Microchip	MCP42010-I/P	From Conrad.de: 1083205
ARD MEGA2560 KIT Arduino - Mega 2560 R3 Lernset	JOY-IT	ARD-Set01	From Reichelt.de: ARD MEGA2560 KIT
ARD SHD MOTOR Arduino Shield - Motor	Adafruit	1438	From Reichelt.de: ARD SHD MOTOR
ARDUINO STACKABLE HEADER KIT - R3	Sparkfun Electronics	PRT-11417	From Antratek.de: PRT-11417
Chow	Altromin	1324 N	Altromin chow products
Euro-Gehäuse	Hammond Electronics	1591EBK	From Conrad.de: 520691
Food pellets	Bio-Serv	F0021	From Bio-serv.com: Dustless Precision Pellets Rodent
Fritzing	Interaction Design Lab Potsdam		Fritzing Software download
Integrated Development Environment	Arduino		Arduino IDE download (Freely available)
IR Break Beam Sensor - 3mm LEDs	Adafruit	2167	From Mouser.de: 485-2167
Laptop or Computer
LED white round 5mm 2000mcd 20mA	TruComponents	1573731	From Conrad.de: 1573731
Microswitch	Hartmann	MBB1 01 A 01 C 09 A	From Conrad.com: 707243
NeoPixel Stick - 8 WS2812 5050 RGB LEDs	Adafruit	1426	From Reichelt.de: DEBO LED NP8 2
Passive buzzer Speaker	Conrad Components	93038c213a	From Conrad.de: 1511468
Pellet release disk			Already available in the lab. Similar products depicted below. Keep in mind that some of these products make use of different (and stronger) motors and infrared sensors. The use of the microswitch (row 7) and the  Arduino Motor Shield (row 3) need to be adapted to fit these new specifications. We recommend 3d printing the disk to work with the provided materials and software. Carbatec universal base plate Open Science Framework Open Feeder Open Ephys 3d Model Food Pellet Dispenser Campden Instruments 45mg pellet dispenser
Programming platform	Mathworks	R2019b or younger
Psychtoolbox Software		V3	Psychtoolbox-3 download
Spur GEAR-MOTOR with DC brush motor	Micromotors	B138F.12.208	Micromotos Series B138F Technical data