Produzione automatizzata su larga scala di sferoidi a cellule staminali di derivazione adiposa per la bioprinting 3D

Riepilogo

Qui, descriviamo la produzione su larga scala di sferoidi stromali / cellule staminali (ASC) di derivazione adiposa utilizzando un sistema di pipettaggio automatizzato per seminare la sospensione cellulare, garantendo così l'omogeneità delle dimensioni e della forma dello sferoide. Questi sferoidi ASC possono essere utilizzati come elementi costitutivi per approcci di bioprinting 3D.

Abstract

Le cellule stromali/staminali di derivazione adiposa (ASC) sono una sottopopolazione di cellule presenti nella frazione vascolare stromale del tessuto adiposo sottocutaneo umano riconosciuta come fonte classica di cellule stromali/staminali mesenchimali. Molti studi sono stati pubblicati con ASC per approcci di ingegneria tissutale basati su scaffold, che hanno esplorato principalmente il comportamento di queste cellule dopo la loro semina su scaffold bioattivi. Tuttavia, stanno emergendo approcci senza impalcature per ingegnerizzare i tessuti in vitro e in vivo, principalmente utilizzando sferoidi, per superare i limiti degli approcci basati su scaffold.

Gli sferoidi sono microtessuti 3D formati dal processo di auto-assemblaggio. Possono imitare meglio l'architettura e il microambiente dei tessuti nativi, principalmente a causa dell'ingrandimento delle interazioni cellula-cellula e cellula-cellula-matrice extracellulare. Recentemente, gli sferoidi vengono esplorati principalmente come modelli di malattia, studi di screening farmacologico e elementi costitutivi per la bioprinting 3D. Tuttavia, per gli approcci di bioprinting 3D, sono necessari numerosi sferoidi, omogenei per dimensioni e forma, per biofabbricare modelli complessi di tessuti e organi. Inoltre, quando gli sferoidi vengono prodotti automaticamente, ci sono poche possibilità di contaminazione microbiologica, aumentando la riproducibilità del metodo.

La produzione su larga scala di sferoidi è considerata il primo passo obbligatorio per lo sviluppo di una linea di biofabbricazione, che continua nel processo di bioprinting 3D e termina nella piena maturazione del costrutto tissutale nei bioreattori. Tuttavia, il numero di studi che hanno esplorato la produzione di sferoidi ASC su larga scala sono ancora scarsi, insieme al numero di studi che hanno utilizzato gli sferoidi ASC come elementi costitutivi per la bioprinting 3D. Pertanto, questo articolo mira a mostrare la produzione su larga scala di sferoidi ASC utilizzando una tecnica di idrogel microstampato non adesiva che diffonde sferoidi ASC come elementi costitutivi per approcci di bioprinting 3D.

Introduzione

Gli sferoidi sono considerati un approccio privo di impalcature nell'ingegneria tissutale. Gli ASC sono in grado di formare sferoidi dal processo di auto-assemblaggio. La microarchitettura 3D dello sferoide aumenta il potenziale rigenerativo delle ASC, compresa la capacità di differenziazione in più lignaggi ^1,2,3. Questo gruppo di ricerca ha lavorato con sferoidi ASC per l'ingegneria della cartilagine e del tessuto osseo ^4,5,6. Ancora più importante, gli sferoidi sono considerati elementi costitutivi nella biofabbricazione di tessuti e organi, principalmente a causa della loro capacità di fusione.

L'uso di sferoidi per la formazione dei tessuti dipende da tre punti principali: (1) lo sviluppo di metodi robotici standardizzati e scalabili per la loro biofabbricazione⁷, (2) la fenotipizzazione sistematica degli sferoidi tissutali⁸, (3) lo sviluppo di metodi per l'assemblaggio di tessuti 3D⁹. Questi sferoidi possono essere formati con diversi tipi di cellule e ottenuti attraverso vari metodi, tra cui hanging drop, reaggregazione, microfluidica e micromole ^8,9,10. Ognuno di questi metodi presenta vantaggi e svantaggi legati all'omogeneità delle dimensioni e della forma degli sferoidi, al recupero degli sferoidi dopo la formazione, al numero di sferoidi prodotti, all'automazione del processo, all'intensità del lavoro e ai costi¹¹.

Nel metodo micromold, le cellule vengono erogate e depositate sul fondo del micromold a causa della gravità. L'idrogel non adesivo non consente alle cellule di aderire al fondo e le interazioni cellula-cellula portano alla formazione di un singolo sferoide per recessione ^8,12. Questo metodo di biofabbricazione genera sferoidi di dimensioni omogenee e controllate, può essere robotizzato per la produzione su larga scala in modo efficiente in termini di tempo con il minimo sforzo e ha buoni fattori critici in termini di economicità nella progettazione di una biofabbricazione di tessuto sferoide ^7,8. Questo metodo può essere applicato per formare sferoidi di qualsiasi lignaggio cellulare per preparare un nuovo tipo di tessuto con caratteristiche prevedibili, ottimali e controllabili⁸.

La biofabbricazione è definita come "la generazione automatizzata di prodotti biologicamente funzionali con organizzazione strutturale ..."¹³. Pertanto, la produzione automatizzata di sferoidi è considerata il primo passo obbligatorio per lo sviluppo di una linea di biofabbricazione, che continua nel processo di bioprinting 3D e termina nella piena maturazione del tessuto biostampato mediante fusione sferoide. In questo studio, per migliorare la scalabilità della biofabbricazione sferoide ASC, utilizziamo un sistema di pipettaggio automatizzato per seminare la sospensione cellulare, garantendo così l'omogeneità delle dimensioni e della forma dello sferoide. Questo documento mostra che è stato possibile produrre un gran numero (migliaia) di sferoidi necessari per gli approcci di bioprinting 3D per biofabbricare modelli di tessuto più complessi.

Protocollo

Gli ASC utilizzati in questo studio erano precedentemente isolati da donatori umani sani e crioconservati come descritto¹⁴ secondo il Comitato etico di ricerca dell'Ospedale Universitario Clementino Fraga Filho, Università Federale di Rio de Janeiro, Brasile (25818719.4.0000.5257). Vedere la tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali e le attrezzature utilizzate in questo studio.

1. Tripsinizzazione del monostrato ASC al passaggio tre

1. Aprire la coltura tissutale di 175 cm² matraccio contenente il monostrato di ASC all'80% di confluenza ed eliminare il surnatante.
2. Aggiungere 7 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, 0,01 M) e lavare il monostrato due volte. Quindi, scartare il liquido.
3. Aggiungere 5 ml di tripsina allo 0,125% con 0,78 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA). Quindi, incubare per 5 minuti a 37 °C.
4. Aggiungere 10 ml di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM LOW) a basso contenuto di glucosio con siero bovino fetale al 10% (FBS) alla coltura tissutale di 175 cm² e mescolare bene la sospensione cellulare con una pipetta sorologica da 10 mL.
5. Raccogliere la sospensione cellulare con una pipetta sierologica da 10 mL e trasferirla in un tubo centrifuga da 50 mL. Successivamente, centrifugare a 400 × g per 5 minuti per ottenere il pellet di ASC. Risospesso il pellet cellulare utilizzando DMEM LOW contenente il 10% di FBS.
6. Eseguire un conteggio delle celle mediante esclusione del tripano.
7. Dopo il conteggio, prendi un totale di 1 × 10⁶ ASC in un tubo centrifugo separato da 15 ml per seminare le 81 recessioni microstampate con idrogel non aderente (un totale di 10.000 cellule / mL seminate qui). Per seminare 256 recessioni di idrogel microstampato non aderente, prendere un totale di 5 × 10⁵ ASC in un tubo centrifugo (un totale di 2.500 cellule / mL seminati qui).

2. Fabbricazione di idrogel di agarosio non aderente microstampato

1. Preparare 50 ml di una soluzione sterile di agarosio ultrapuro al 2% in NaCl allo 0,9% in acqua ultrapura. Autoclave della soluzione per 30 min a 121 °C.
2. Aggiungere 500 μL di soluzione sterile di agarosio ultrapuro al 2% al centro di uno stampo in silicone contenente 81 o 256 recessi circolari.
3. Dopo 40 minuti, sformare l'agarosio ultrapuro dallo stampo in silicone e metterlo in un pozzetto di una piastra di plastica a 12 pozzetti.
4. Aggiungere 2 ml di DMEM LOW nel pozzo con l'agarosio microstampato e incubare in un incubatore a 37 °C in un'atmosfera di CO_{2 al} 5% per almeno 12 ore prima di seminare le ASC.

3. Biofabbricazione di sferoidi ASC mediante il sistema di pipettaggio automatizzato

1. Verificare quanto segue:
   1. Controllare se il flusso laminare è attivo e il flusso d'aria dell'armadio funziona correttamente.
   2. Verificare se l'apparecchiatura è collegata alla tensione corretta.
   3. Verificare se il tablet è collegato all'apparecchiatura.
   4. Verificare se l'altezza del vetro di protezione dell'armadio è alla stessa altezza della marcatura del sensore dell'apparecchiatura.
2. Premere il pulsante On/Off sul lato sinistro dell'apparecchiatura e attendere l'avvio del tablet e dell'apparecchiatura.
3. Posizionare le scatole di punta, il rack per i tubi della centrifuga e la piastra contenente l'idrogel di agarosio microstampato nello spazio di lavoro dell'apparecchiatura.
4. Sul tablet con il software aperto, fare prima clic su Labware Editor.
5. Imposta un tavolo da lavoro virtuale e scegli le posizioni delle pipette, delle scatole di punta, del rack per i tubi di plastica e delle piastre.
   NOTA: il tavolo di lavoro virtuale deve rappresentare le posizioni fisiche degli accessori nell'apparecchiatura.
6. Fare clic sul pulsante Passa a produrre per includere i parametri (vedere il passaggio 3.10) e i comandi che l'apparecchiatura eseguirà durante l'esperimento. Attendere che una barra degli strumenti e un elenco di prodotti si aprano nel software.
7. Inizialmente, per indicare i comandi, includere il numero di campioni da pipettare e trascinarlo nell'elenco di produzione.
   NOTA: Il numero di campioni è il numero di tubi di centrifuga in plastica contenenti la sospensione ASC da seminare al centro dei microstampi.
8. Dopo aver inserito il numero di campioni, fare clic sul pulsante di comando Sample Transfer sul software per trasferire la sospensione ASC nei pozzetti della piastra a 12 pozzetti, contenente i micromolghi, e trascinarla nell'elenco dei prodotti.
9. Fare clic su Proprietà per impostare le posizioni iniziale e finale per l'apparecchiatura per trasferire il campione.
10. Attendere che il software torni alla pagina Tabella di lavoro . Fare clic sul pulsante Opzioni per impostare i parametri per il seeding automatico degli ASC: i) Velocità di aspirazione di 15,4 ^s-1; ii) Velocità di erogazione di 1 ^s-1; iii) Ritardo di soffiaggio di 0 ms; iv) Velocità di soffiaggio di 15,4 ^s-1; v) Corsa iniziale del 100%. Selezionare Acqua come tipo di liquido standard.
11. Impostare i parametri per miscelare gli ASC per ottenere una sospensione omogenea: i) Numero di Cicli di 5; ii) Velocità di 6,5 ^s-1; iii) Volume di 300 μL.
12. Dopo aver impostato i parametri, aggiungere il tempo di 40 minuti all'elenco dei prodotti.
    NOTA: questo tempo è necessario attendere che la sospensione ASC decantare nella parte inferiore del microstampo.
13. Nell'elenco dei prodotti, includere l'opzione Trasferimento reagente per trasferire il terreno di coltura sferoide ai corrispondenti pozzetti della piastra.
14. Ripetere i passaggi 3.9-3.11 per impostare le configurazioni di posizione e parametri per trasferire il terreno di coltura sferoide.
15. Fare clic sul pulsante con un simbolo di controllo sulla barra superiore del software per assicurarsi che non vi siano errori di programmazione.
16. Fare clic sul pulsante Riproduci (con il simbolo di un triangolo) nella barra superiore del software per avviare il programma.
17. Lascia che l'apparecchiatura si avvii, come programmato, e attendi che emetta un suono, indicando che è finita.
18. Raccogliere la piastra a 12 pozzetti e incubarla in un incubatore a 37 °C, 5% CO₂ per almeno 18 ore affinché gli sferoidi siano completamente formati e compatti.
19. Raccogliere manualmente gli sferoidi dopo 1, 3 e 7 giorni di coltura per l'analisi. Lavare manualmente il mezzo con una micropipetta per liberare gli sferoidi dall'idrogel di agarosio non aderente microstampato.
20. Dopo 5 minuti, controllare al microscopio per determinare se gli sferoidi sono completamente rilasciati dall'idrogel di agarosio non aderente microstampato.
21. Raccogliere manualmente gli sferoidi utilizzando una micropipetta e trasferirli in un tubo centrifugo da 15 ml.
22. Lavare gli sferoidi almeno due volte con 0,01 M PBS. Valutare la fattibilità ed eseguire analisi biomeccaniche sui campioni sferoidi freschi. Per l'analisi morfologica (istologia), incubare i campioni di sferoidi in paraformaldeide al 4% in PBS per almeno 18 ore a 2-8 °C.

Risultati

Il sistema di pipette automatiche può seminare la sospensione della cella ASC in 12 pozzetti di una piastra a 12 pozzetti in 15 minuti. L'utilizzo dell'idrogel non aderente 81 microstampato produrrà 972 sferoidi alla fine del protocollo. L'utilizzo di 256 idrogel non aderenti microstampato produrrà 3.072 sferoidi alla fine del protocollo. Gli sferoidi ASC sono stati analizzati per l'omogeneità delle loro dimensioni e forma. Gli sferoidi ASC dei microstidi con 81 recessioni hanno mostrato un diametro omogeneo durante ...

Discussione

Questo documento presenta la generazione su larga scala di sferoidi ASC utilizzando un sistema di pipette automatizzato. Il passaggio critico del protocollo è quello di impostare con precisione il software per garantire il corretto volume di sospensione della cella, la velocità e la distanza per il pipettaggio. I parametri descritti nel protocollo sono stati determinati dopo una serie di prove per ottimizzare l'erogazione della sospensione cellulare ASC nei pozzetti di piastre a 12 pozzetti contenenti gli idrogel micro...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-well plastic plate	Corning	3512
50 mL centrifuge tube	Corning	CLS430828
EpMotion 5070	Eppendorf	5070000282
epT.I.P.S. Motion	Eppendorf	30015231
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Invitrogen	15576028
fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10082147
Low Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM LOW)	Gibco	31600034
MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 16 x 16 array	Sigma	Z764000
MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 9 x 9 array	Sigma	Z764019
phosphate saline buffer (PBS)	Sigma	806552
sodium chloride (NaCl)	Sigma	S8776
tissue culture flask	Corning	430720U
trypan	Lonza	17-942E
trypsin	Gibco	27250018
ultrapure agarose	Invitrogen	16500100