Purificazione biochimica e caratterizzazione proteomica dei nuclei di fibrille amiloidi dal cervello

Riepilogo

Questo metodo di purificazione biochimica con analisi proteomica basata sulla spettrometria di massa facilita la robusta caratterizzazione dei nuclei di fibrille amiloidi, che possono accelerare l'identificazione di bersagli per la prevenzione della malattia di Alzheimer.

Abstract

Le inclusioni fibrillari proteiche sono caratteristiche patologiche chiave di più malattie neurodegenerative. Nelle prime fasi della malattia di Alzheimer (AD), i peptidi amiloide-beta formano protofibrille nello spazio extracellulare, che agiscono come semi che gradualmente crescono e maturano in grandi placche amiloidi. Nonostante questa comprensione di base, l'attuale conoscenza della struttura, della composizione e dei modelli di deposizione delle fibrille amiloidi nel cervello è limitata. Uno dei principali ostacoli è stata l'incapacità di isolare fibrille amiloidi altamente purificate dagli estratti cerebrali. Gli approcci basati sulla purificazione dell'affinità e sulla microdissezione di cattura laser sono stati precedentemente utilizzati per isolare le amiloidi, ma sono limitati dalla piccola quantità di materiale che può essere recuperato. Questo nuovo e robusto protocollo descrive la purificazione biochimica dei nuclei della placca amiloide utilizzando la solubilizzazione del dodecil solfato di sodio (SDS) con ultracentrifugazione e ultrasuoni del gradiente di densità di saccarosio e produce fibrille altamente pure da pazienti CON AD e tessuti cerebrali modello AD. L'analisi proteomica bottom-up basata sulla spettrometria di massa (MS) del materiale purificato rappresenta una solida strategia per identificare quasi tutti i componenti proteici primari delle fibrille amiloidi. Precedenti studi proteomici sulle proteine nelle coronae amiloidi hanno rivelato una collezione di proteine inaspettatamente ampia e funzionalmente diversificata. In particolare, dopo aver perfezionato la strategia di purificazione, il numero di proteine co-purificanti è stato ridotto di oltre 10 volte, indicando l'elevata purezza del materiale insolubile SDS isolato. La colorazione negativa e la microscopia elettronica immuno-oro hanno permesso di confermare la purezza di questi preparati. Sono necessari ulteriori studi per comprendere gli attributi spaziali e biologici che contribuiscono alla deposizione di queste proteine in inclusioni amiloidi. Nel complesso, questa strategia analitica è ben posizionata per aumentare la comprensione della biologia amiloide.

Introduzione

L'amiloide è una disposizione supramolecolare estremamente stabile che si trova in un gruppo diversificato di proteine, alcune delle quali portano a cambiamenti patologici¹. L'accumulo di aggregati amiloidi intra- o extracellulari è osservato in diverse malattie neurodegenerative². Gli aggregati amiloidi sono eterogenei e sono arricchiti con un gran numero di proteine e lipidi³. Negli ultimi anni, l'interesse per il proteoma amiloide ha generato un notevole interesse tra i neuroscienziati di base e traslazionali. Sono stati sviluppati diversi metodi per estrarre e purificare gli aggregati amiloidi dai tessuti cerebrali umani di topo e post-mortem. La microdissezione a cattura laser, l'immunoprecipitazione, la decellularizzazione e l'isolamento biochimico degli aggregati amiloidi sono metodi ampiamente utilizzati per estrarre e purificare placche amiloidi, fibrille e oligomeri 4,5,6,7. Molti di questi studi si sono concentrati sulla determinazione della composizione proteica di questi depositi fibrillari strettamente imballati utilizzando la SM semi-quantitativa. Tuttavia, i risultati disponibili sono incoerenti e il numero sorprendentemente elevato di proteine co-purificanti precedentemente riportate sono difficili da interpretare.

La limitazione principale della letteratura esistente che descrive il proteoma del nucleo amiloide nei cervelli modello murino AD e AD è che il materiale purificato contiene un numero ingestibile di proteine co-purificanti. L'obiettivo generale di questo metodo è quello di superare questa limitazione e sviluppare una robusta purificazione biochimica per isolare i nuclei delle fibrille amiloidi. Questa strategia impiega un metodo biochimico basato sull'ultracentrifugazione del gradiente di densità di densità del saccarosio precedentemente descritto per l'isolamento di frazioni amiloidi arricchite insolubili SDS da tessuti cerebrali umani e murini post-mortem AD ^8,9. Questo metodo si basa sulla letteratura esistente, ma va oltre con l'ultrasonicazione e i lavaggi SDS per rimuovere la maggior parte delle proteine associate all'amiloide liberamente legate, portando all'isolamento di fibrille amiloidi altamente purificate (Figura 1). Le fibrille purificate da questo protocollo superano diverse sfide esistenti frequentemente incontrate negli studi strutturali delle fibrille amiloidi isolate dagli estratti cerebrali. La visualizzazione di queste fibrille con microscopia elettronica a trasmissione (TEM) conferma l'integrità e la purezza del materiale purificato (Figura 2). In questo studio, le fibrille isolate vengono solubilizzate e digerite in peptidi con tripsina e l'analisi della SM senza etichetta può facilmente rivelare l'identità delle proteine che formano il nucleo della fibrilla. In particolare, alcune di queste proteine hanno una tendenza intrinseca a formare assemblaggi supramolecolari in organelli non legati alla membrana. Inoltre, molte delle proteine identificate nell'analisi delle fibrille amiloide-beta (Aβ) sono anche associate ad altre malattie neurodegenerative, suggerendo che queste proteine possono svolgere un ruolo chiave in più proteinopatie.

È improbabile che questo metodo SDS / ultrasuoni alteri o interrompa la struttura dei nuclei delle fibrille. Il materiale purificato è adatto anche per una vasta gamma di approcci di analisi proteomica top-down e bottom-up e ulteriori strategie di analisi strutturale basate su MS, come la reticolazione chimica o lo scambio idrogeno-deuterio. Il recupero complessivo utilizzando questo metodo è relativamente elevato e, quindi, è adatto per studi strutturali dettagliati, che richiedono microgrammi a milligrammi del materiale purificato. Il materiale purificato è adatto anche per studi strutturali utilizzando crioEM e microscopia a forza atomica. Questo protocollo, in combinazione con l'etichettatura isotopica stabile dei mammiferi, può facilitare gli studi di risonanza magnetica nucleare allo stato solido (NMR) della struttura amiloide¹⁰.

Protocollo

Questo protocollo prevede l'uso di tessuti cerebrali umani o vertebrati. Tutta la ricerca è stata eseguita in conformità con le linee guida istituzionali approvate della Northwestern University. L'attuale flusso di lavoro è standardizzato utilizzando APP-knock in (App^{NL-G-F/NL-G-F}) mouse cervello corticale e ippocampo cervello e la regione del cervello espopule^{estratti 11}. Questo protocollo è stato ottimizzato per gli estratti cerebrali di topi a 6-9 mesi di età e può purificare efficacemente gli amiloidi da animali maschi e femmine.

NOTA: per una migliore comprensione della procedura sperimentale complessiva, vedere la Figura 1 per uno schema del flusso di lavoro.

1. Raccolta dei tessuti e purificazione dell'amiloide

NOTA: Idealmente, le fibrille amiloidi dovrebbero essere isolate dalle regioni cerebrali appena sezionate. Tuttavia, questo metodo funziona bene anche con tessuti cerebrali congelati a scatto o flash. Di seguito è riportato un breve schema di tessuti cerebrali con congelamento a scatto per la conservazione per l'uso in un secondo momento.

1. Raccolta e conservazione del tessuto cerebrale: seziona i cervelli dei topi e raccogli rapidamente le regioni cariche di amiloide (cioè corteccia e ippocampo), seguite dal congelamento a scatto in azoto liquido o da un bagno di alcol di ghiaccio secco.
   NOTA: il congelamento a scatto aiuta a preservare gli attributi strutturali dei costituenti del tessuto. I topi sono eutanasizzati da isoflurano e lussazione cervicale^12,13. Si consiglia di evitare l'uso di CO 2 poiché_ciò può compromettere l'integrità del proteoma cerebrale.
2. Post-dissezione, tagliare e conservare i tessuti freschi in piccoli blocchi (ad esempio, 5 mm x 5 mm), in quanto ciò facilita un'omogeneizzazione più efficiente prima dell'estrazione dell'amiloide. Trasferire il tessuto alla fiala criogenica sterile, stringere il cappuccio e immergere rapidamente.
3. Mantenere i tessuti congelati in condizioni ultrafredde (cioè -80 °C o azoto liquido). Se l'estrazione deve essere eseguita pochi giorni dopo, conservare i tessuti a -20 °C ed evitare cicli di congelamento e scongelamento. Scongelare i tessuti congelati sul ghiaccio bagnato quando sono pronti per l'estrazione e la purificazione.
   NOTA: Il contatto diretto dei tessuti con l'azoto liquido può causare danni ai tessuti e alle proteine. Si noti che un bagno alcolico può rimuovere i marcatori permanenti dalle etichette del tubo.

2. Arricchimento di materiale insolubile SDS

NOTA: Eseguire tutti i passaggi su ghiaccio e centrifugare a 4 °C, salvo diversa indicazione. I dettagli di tutti i buffer e le soluzioni utilizzate in questo protocollo sono forniti nel file supplementare 1. I produttori e i numeri di catalogo di sostanze chimiche e strumenti sono forniti nella Tabella dei materiali.

1. Inizia con regioni del tessuto cerebrale appena sezionate o congelate a scatto (scongelate sul ghiaccio) poste in un tubo da 2 ml contenente 6-8 perline di ceramica e un tampone di omogeneizzazione ghiacciato appena preparato (1 mL per 0,25-1 g di massa di tessuto umido).
2. Trasferire i tubi all'omogeneizzatore del mulino a perline e macinare il contenuto di tessuto a 4000 giri / min, con due cicli di 30 s ciascuno e un intervallo di 30 s in mezzo.
   NOTA: In alternativa, è possibile utilizzare sistemi di agitatori o omogeneizzatori motorizzati per macinare e omogeneizzare i tessuti.
3. Aggiungere 9 mL di tampone di omogeneizzazione ghiacciato a freddo a 1 mL di omogeneizzato di tessuto intero cerebrale in tubi da 15 mL, sigillare con strisce di film di cera da laboratorio e ruotare end-to-end durante la notte a 4 °C per garantire una solubilizzazione robusta.
   NOTA: Per rimuovere detriti cellulari e lipidi indesiderati di grandi dimensioni, la mattina successiva, ruotare i tubi a 800 x g a 4 °C per 10 minuti e raccogliere il surnatante in un tubo fresco. Risospesciare il pellet rimanente in 2 mL di tampone di omogeneizzazione ghiacciato, mescolare bene, girare di nuovo per 10 minuti a 4 °C e unire i due supernatanti.
4. Aggiungere lentamente saccarosio solido alla sospensione di estratto tissutale fino a una concentrazione finale di 1,2 M, mescolare bene e centrifugare a 250.000 x g per 45 minuti a 4 °C.
5. Rimuovere con cura e scartare il surnatante usando una pipetta. Risospesso il pellet in 2 mL di tampone di omogeneizzazione contenente 1,9 M di saccarosio mediante triturazione, seguito da centrifugazione a 125.000 x g per 45 min a 4 °C.
   NOTA: il volume del buffer può essere regolato in base alla quantità di materiale recuperato dal passaggio precedente. In generale, 10 volumi di buffer di omogeneizzazione (V/V) sono ideali per questo passaggio.
6. Raccogliere lo strato solido bianco superiore utilizzando una pipetta, trasferirlo in un tubo fresco e solubilizzare in 1 mL di tampone di lavaggio ghiacciato tubando su e giù più volte, senza introdurre bolle d'aria.
7. Oltre allo strato superiore, il pellet è anche arricchito con fibrille amiloidi. Per una resa più elevata, combinare le due frazioni e procedere. Rimuovere con attenzione lo strato acquoso centrale usando una pipetta e scartare.
8. Centrifugare le frazioni combinate a 8000 x g per 20 min a 4 °C. Scartare il surnatante.
9. Aggiungere 1 mL di tampone di digestione ghiacciato al pellet lavato, risospeso e incubare a temperatura ambiente (RT) per 3 ore.
10. Centrifugare a 8000 x g per 20 minuti a 4 °C e rimuovere il surnatante con una pipetta.
11. Risospendare e lavare (come nella fase 2.8.) il pellet digerito due volte in 1 mL di tampone Tris ghiacciato.
12. Risospesciare il pellet lavato in 1 mL di tampone di solubilizzazione contenente 1% di SDS e 1,3 M di saccarosio mediante pipettaggio su e giù. Centrifugare rapidamente a 200.000 x g per 60 minuti a 4 °C.
    NOTA: Sebbene le fibrille amiloidi siano altamente resistenti ai detergenti e ai denaturanti, esposizioni molto lunghe al detergente (1% SDS) possono compromettere l'integrità delle fibrille o rimuovere le proteine strettamente legate, il che comprometterà le analisi successive. Pertanto, subito dopo aver risospeso il pellet, procedere alla centrifugazione.
13. Salvare il pellet e aumentare il volume del surnatante rimanente aggiungendo un tampone Tris da 50 mM (in rapporto 1:0,3) per ridurre la concentrazione di saccarosio da 1,3 a 1 M e centrifugare ancora una volta a 200.000 x g per 45 minuti a 4 °C.
14. Sciogliere i due pellet in 100 μL di tampone Tris contenente 0,5% SDS e piscina per la purificazione dell'amiloide. I pellet visibili sono piccoli e dovrebbero apparire opachi e bianco sporco (vedere figura 2A).

3. Purificazione dell'amiloide

NOTA: Unire i due pellet, solubilizzare mediante pipettaggio fino ad ottenere una soluzione uniforme e procedere con le seguenti fasi di purificazione dell'amiloide.

1. Per la completa solubilizzazione del materiale ricco di amiloidi presente nei pellet, sottoporre il tubo a cesoiatura meccanica prodotta da onde ultrasoniche in un dispositivo di sonicazione a bagno funzionante per 30 s ON e 30 s OFF ad una frequenza di medio raggio per 20 cicli.
2. Centrifugare immediatamente il materiale a 20.000 x g per 30 minuti a 4 °C e risospescere il pellet in 500 μL di tampone SDS Tris allo 0,5%.
3. Ripetere il passaggio 3.1. e Passo 3.2. quattro volte per un totale di cinque lavaggi. Il numero di lavaggi può essere aumentato per migliorare la purezza.
   NOTA: le fasi di sonicazione e lavaggio sono ottimizzate allo 0,5% di SDS poiché concentrazioni più elevate possono influire sulla struttura, l'integrità o la composizione proteica delle fibrille. Aumentare la concentrazione di SDS in questa fase non è raccomandato.
4. Dopo la fase finale di centrifugazione, lavare il pellet in 200 μL di acqua ultrapura e centrifugare a 20.000 x g per 30 minuti a 4 °C per rimuovere l'eventuale detersivo rimanente. Il pellet lavato contenente fibrille amiloidi purificate appare di colore semitrasparente ed è difficile da vedere a volte.
5. Sciogliere il pellet finale contenente fibrille amiloidi purificate in 100 μL di acqua ultrapura. Procedere immediatamente alla fase successiva per la lavorazione a valle o salvare la sospensione di fibrille a -20 °C per ulteriori analisi. Se congelato, scongelare sul ghiaccio prima di iniziare le precipitazioni.

4. Precipitazione del cloroformio di metanolo

NOTA: Se l'obiettivo finale è quello di eseguire l'analisi delle proteine, si consiglia di dissalare e rimuovere ulteriori impurità non proteiche.

1. Aggiungere 400 μL di metanolo ai 100 μL purificati di fibrille amiloidi in un tubo da 1,5 ml e un pozzetto vortice.
2. Aggiungere 100 μL di cloroformio al tubo e vortice bene.
3. Aggiungere 300 μL di acqua ultrapura e vortice accuratamente. Questo rende la miscela torbida a causa della precipitazione proteica.
4. Centrifuga a 12.000 x g per 2 min a RT.
5. Rimuovere con attenzione lo strato acquoso (cioè in alto) senza disturbare lo strato di interfaccia contenente il fiocco proteico.
6. Aggiungere nuovamente lo stesso volume di metanolo e centrifugare a 12.000 x g per 2 minuti a RT.
7. Scartare il surnatante usando una pipetta e asciugare all'aria il pellet a RT. Evitare l'essiccazione eccessiva; la frazione amiloide è difficile da ridistribuire se eccessivamente essiccata.

5. Digestione della tripsina

1. Sciogliere il pellet in 50 μL di tampone di guanidina cloridrato (GuHCl). Sonicare in un bagno di acqua ghiacciata e riscaldare a 95 °C per 5 minuti, se necessario.
2. Vortice completo a RT per 45 minuti a 1 ora per dissolverlo completamente. Il pellet non sarà visibile dopo questo passaggio e la soluzione appare chiara nell'aspetto.
3. Aggiungere lo stesso volume di soluzione di tensioattivo allo 0,2%. Solubilizzare a RT con vortice per 60 min. Questo passaggio migliora l'attività enzimatica della tripsina.
4. Aggiungere 1 μL di tris-2-carbossietilfosfina (TCEP) dalla soluzione madre da 500 mM. Incubare per 60 min.
5. Aggiungere 2 μL di 500 mM di iodoacetammide (IAA) e incubare al buio per 20 min.
6. Spegnere l'IAA con 5 μL di soluzione TCEP per 15 min.
7. Aggiungere il volume richiesto di 50 mM di soluzione di bicarbonato di ammonio al tubo per ridurre la concentrazione di guanidina a 1,5 M.
8. Aggiungere una soluzione di tensioattivo all'1% al tubo (1 μL/50 μg di proteine).
9. Aggiungere tripsina (1 μg/100 μg di proteine) e lasciare la miscelazione in provetta a 37 °C durante la notte.

6. Pulizia dei peptidi

1. La mattina successiva, acidificare la soluzione peptidica digerita abbassando il pH a 2,0 aggiungendo acido formico.
2. Attivare la colonna di spin C18 (n-ottadecil) in un tubo ricevitore da 2 mL aggiungendo 200 μL di soluzione di metanolo al 50% e ruotare a 1500 x g per 2 minuti a RT. Ripetere la fase di attivazione.
3. Equilibrare i letti in resina della colonna C18 aggiungendo 200 μL di tampone di equilibrio e ruotando per 2 minuti con le stesse condizioni. Ripetere questo passaggio.
4. Caricare la soluzione peptidica acidificata sulla colonna C18 e centrifugare a 1500 x g per 2 minuti a RT. Raccogliere il flusso e ricaricarlo ancora una volta. Scartate il secondo flusso.
5. Lavare i peptidi legati alla resina C18 con il tampone di lavaggio 2x, come fatto nel passaggio 6.3. Utilizzare lo stesso tampone di equilibrio per lavare la colonna.
6. Eluire i peptidi aggiungendo 40 μL di tampone di eluizione seguito da centrifugazione a 1500 x g, per 2 minuti a RT. Ripetere la fase di eluizione tre volte per aumentare la resa dei peptidi recuperati.
7. Asciugare i peptidi in un concentratore di vuoto a velocità facendo evaporare la soluzione acquosa. I pellet secchi possono essere salvati a -20 °C per alcune settimane prima dell'analisi MS.

7. Impostazione dello spettrometro di massa per l'analisi peptidica

NOTA: per i parametri MS, vedere il file supplementare 1 (adattato da una precedente pubblicazione del laboratorio)¹⁴.

1. Prima di caricare i campioni peptidici per l'analisi MS, sciogliere i pellet peptidici secchi in 20 μL di tampone di carico del campione ed eseguire micro BCA per quantificare la concentrazione di peptidi recuperati.
2. Trasferire i peptidi disciolti in una fiala di vetro e caricare 3 μg (quantificati da micro BCA) di peptidi nell'autocampionatore del sistema UPLC.
3. Caricare i campioni su una colonna di trappola ventilata (colonna HPLC C18, 0,075 mm x 20 mm) con una portata di 250 nL/min.
4. Disporre la colonna trappola in linea con una colonna analitica (0,075 μm x 500 mm) e assemblare una punta dell'emettitore alla sorgente di ionizzazione elettrospray (ESI) sottoposta a una tensione di spruzzo di 2000 V.
   NOTA: In questo studio viene eseguito ESI, in cui la fase mobile è sottoposta a ionizzazione ad alta tensione nella fase gassosa. Lo spray creato da questo è diretto alla camera a vuoto della SM attraverso un capillare riscaldato. Mentre si è sotto vuoto, la de-solvatazione delle goccioline e l'espulsione degli ioni avviene in presenza di calore e tensione. Successivamente, gli ioni vengono accelerati verso l'analizzatore di massa in presenza di un ambiente ad alta tensione.
5. Analizza i campioni con 2 ore di acquisizione. Questo studio viene eseguito utilizzando l'acquisizione dipendente dai dati con il paradigma di selezione degli ioni precursori 20 più intenso.
   NOTA: nell'acquisizione dipendente dai dati, un numero limitato di peptidi precursori viene rilevato nella scansione MS1 e sottoposto a frammentazione per l'analisi MS2. Tuttavia, l'esclusione dinamica è problematica qui poiché i peptidi Aβ altamente abbondanti saranno omessi per frammentazione e si tradurrà in una sottostima della loro quantità.
6. Per la quantificazione assoluta dei peptidi Aβ, eseguire gli stessi campioni ancora una volta utilizzando il metodo MS/MS mirato. Per questo studio, viene preparato un elenco esaustivo di tutti i rapporti m/z per vari possibili peptidi triptici Aβ per i modelli murini knock-in APP (vedere Tabella supplementare 1). Altri gruppi dovrebbero preparare un elenco simile in conformità con il modello murino disponibile e i possibili peptidi generati dalla proteina di interesse (ad esempio, Aβ per AD).
   NOTA: Per affrontare l'esclusione di peptidi altamente abbondanti, utilizzare un approccio mirato fornendo un elenco di valori m/z selezionati corrispondenti ai peptidi trittici Aβ. Questo approccio affronta il problema dell'esclusione data-dipendente dei peptidi Aβ e può quantificare le quantità assolute di diversi monomeri (Aβ38, 40 e 42 peptidi) con alta risoluzione.
7. Lo spettrometro di massa genera spettri MS dei campioni peptidici e salva i file di dati grezzi nella directory di destinazione. Utilizzare questo file per eseguire la corrispondenza spettrale utilizzando strumenti statistici e bioinformatici consolidati. Sono disponibili più strumenti di ricerca e analisi di database online e offline.

8. Analisi dei dati MS

1. Estrarre i file MS1 e MS2 utilizzando lo strumento Rawconverter offline (http://www.fields.scripps.edu/rawconv/).
2. Eseguire l'identificazione, la quantificazione e l'analisi dettagliata dei dati su un motore di ricerca di dati MS basato sul Web. In questo studio è stato utilizzato Integrated Proteomics Pipeline - IP2 (Bruker: http://www.integratedproteomics.com/).
   NOTA: sono disponibili diversi altri strumenti di analisi dei dati MS online e offline, come MaxQuant (https://www.maxquant.org/).
3. Dopo aver caricato i file MS1 e MS2, selezionare un database del proteoma del mouse aggiornato. Qui, un database di topi aggiornato contenente ulteriori mutazioni specifiche knock-in dell'app viene selezionato per l'identificazione dei peptidi utilizzando gli algoritmi ProLuCId e SEQUEST¹¹.
4. Nel sistema di analisi IP2, selezionare i parametri predefiniti e modificarli in base alle esigenze sperimentali. In questo studio, viene utilizzata una tolleranza di massa peptidica di 50 ppm per il precursore e 600 ppm per i frammenti (fare riferimento al file supplementare 1 per altri parametri utilizzati in IP2).
   NOTA: I ricercatori possono modificare i parametri di ricerca in base agli obiettivi sperimentali. Ad esempio, per identificare le modifiche post-traduzionali, aggiungere valori di modifica differenziale per vari PTM (ad esempio, ubiquitinazione, SUMOilazione, fosforilazione).

Risultati

Qui, viene riassunto un metodo dettagliato per l'isolamento e la purificazione delle fibrille amiloidi utilizzando un metodo di purificazione ultracentrifugazione con gradiente di densità di saccarosio modificato (vedere Figura 1). L'innovazione in questo metodo è l'inclusione di fasi di lavaggio ad ultrasuoni utilizzando un sistema di sonicazione a bagnomaria seguito dalla solubilizzazione SDS, che rimuove molte proteine vagamente associate dalle fibrille amiloidi che co-purificano con le...

Discussione

Sviluppare una chiara comprensione della struttura e della composizione dell'amiloide è difficile per i biologi strutturali e i biochimici a causa delle complessità biologiche e delle limitazioni sperimentali nell'estrazione di fibrille purificate dai tessuti cerebrali dell'AD^16,17. Le fibrille amiloidi sono polimorfiche a livello molecolare, mostrando una popolazione eterogenea di varie lunghezze e complessità^18,19

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acclaim PepMap 100 C18 HPLC column 0.075 mm x 20 mm	Thermo Scientific	164535	Alternative instruments, chemicals and antibodies from other manufacturers can be used
Ammonium bicarbonate	Sigma-Aldrich	9830
anti-amyloid beta (1-16) 6E10 antibody	Biolegend	803001
anti-amyloid beta (17-24) 4G8 antibody	Biolegend	800701
anti-amyloid beta (N terminus 82E1) antibody	IBL America	10323
anti-amyloid fibril LOC antibody	EMD Millipore	AB2287
BCA kit	Thermo Fisher Scientific	23225
Bioruptor Pico Plus	Diagenode	B01020001
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	C1016
Collagenase	Sigma-Aldrich	C0130
Complete  Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	11697498001
Dnase I	Thermo Fisher Scientific	EN0521
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS
Guanidine hydrochloride	Sigma-Aldrich	G4505
HyperSep C18 Cartridges	Thermo Fisher Scientific	60108-302
Integrated Proteomics Pipeline - IP2	http://www.integratedproteomics.com/
Iodoacetamide (IAA)	Sigma-Aldrich	I1149
K54 Tissue Homogenizing System Motor	Cole Parmer	Glas-Col 099C
MaxQuant	https://www.maxquant.org/
Micro BCA kit	Thermo Fisher Scientific	23235
Nanoviper 75 μm x 50 cm	Thermo Scientific	164942
Optima L-90K Ultracentrifuge	Beckman Coulter	BR-8101P-E
Orbitrap Fusion TribridMass Spectrometer	Thermo Scientific	IQLAAEGAAPFADBMBCX
Pierce C18 Spin Columns	Thermo Fisher Scientific	89870
Precellys 24 tissue homogenizer	Bertin Instruments	P000062-PEVO0-A
ProteaseMAX(TM) Surfactant Trypsin Enhancer	Promega	V2072
RawConverter	http://www.fields.scripps.edu/rawconv/
Sodium azide	VWR	97064-646
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	74255
Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002446
Speed Vaccum Concentrator	Labconco	7315021
Tris-2-carboxyethylphosphine (TCEP)	Sigma-Aldrich	C4706-2G
Tris-HCl	Thermo Fisher Scientific	15568025
Trypsin Gold-Mass spec grade	Promega	V5280
UltiMate 3000 RSLCnano System	Thermo Scientific	ULTIM3000RSLCNANO