Indurre il salvataggio di polipi nelle colonie di corallo per ottenere micropropagati individualizzati per uso sperimentale di laboratorio

Riepilogo

Il salvataggio del polipo è un processo indotto dallo stress acuto, in cui i polipi di corallo digeriscono il tessuto che li collega alla loro colonia e si staccano da esso per vivere come individui. Il presente protocollo descrive come indurre la micropropagazione del corallo mediante salvataggio utilizzando trattamenti di acqua di mare ipersalini o privi di calcio.

Abstract

I coralli sono animali coloniali formati da unità modulari chiamate polipi. I polipi di corallo sono fisiologicamente collegati e collegati dai tessuti. Il fenomeno del salvataggio dei polipi è un processo indotto dallo stress acuto, in cui i polipi di corallo digeriscono il tessuto che li collega al resto della colonia e alla fine si staccano dallo scheletro per continuare a vivere come individui separati. I biologi del corallo hanno riconosciuto il processo di salvataggio dei polipi per anni, ma solo di recente i micropropagati generati da questo processo sono stati riconosciuti come un sistema modello per gli studi di biologia dei coralli. L'uso del salvataggio del polipo può creare un numero elevato di unità clonali da un singolo frammento di corallo. Un altro vantaggio è che singoli polipi o patch di polipi possono essere facilmente visualizzati al microscopio e mantenuti in ambienti a basso costo altamente standardizzati come piastre di Petri, fiaschi e chip microfluidici. Il presente protocollo dimostra metodi riproducibili in grado di indurre la micropropagazione dei coralli e diversi approcci per mantenere in vita i singoli polipi a lungo termine. Questa metodologia è stata in grado di coltivare con successo polipi della specie di corallo Pocillopora verrucosa fino a 8 settimane dopo il salvataggio, mostrando la praticità dell'uso di singoli polipi di corallo per la ricerca sui coralli.

Introduzione

I coralli scleractiniani o che costruiscono barriere coralline sono cnidari in grado di formare scheletri carbonatici, creare barriere coralline ed ecosistemi strutturalmente complessi che possono essere trovati da ambienti di acque profonde a poco profonde¹. Le barriere coralline tropicali ospitano un'elevata biodiversità e forniscono servizi ecosistemici essenziali, come la protezione costiera e la manutenzione della pesca². La maggior parte dei coralli che costruiscono barriere coralline di acque poco profonde si basano su una relazione mutualistica con le alghe della famiglia delle Symbiodiniaceae, che forniscono l'energia di cui i coralli hanno bisogno per costruire i loro scheletri. La simbiosi tra il corallo e le alghe può essere interrotta dallo stress ambientale, causando lo sbiancamento dei coralli 3,4,5,6. Recenti anomalie di temperatura hanno causato importanti eventi di sbiancamento dei coralli in tutto il mondo, portando alla mortalità di massa dei coralli e al degrado permanente della barriera corallina 7,8,9,10,11. Poiché questo fenomeno si basa sull'espulsione di simbionti da parte di meccanismi cellulari associati allo stress post-calore, come l'apoptosi, l'autofagia e l'esocitosi, lo sbiancamento dei coralli può essere descritto come un processo cellulare che ha conseguenze su scala ecosistemica ^5,6,12, il che significa che avere colture in vitro di cellule o tessuti di corallo sarebbe applicabile per studiare da vicino questo fenomeno.

A causa dell'importanza delle barriere coralline e delle principali minacce che hanno dovuto affrontare, in particolare negli ultimi due decenni², i coralli sono diventati il fulcro della ricerca per scopi di protezione e ripristino in tutto il mondo¹³. Tuttavia, lo sviluppo di approcci e sistemi sperimentali che siano affidabili, riproducibili e offrano un impatto ambientale minimo per studiare i coralli è una grande lotta in questo campo.

La micropropagazione è definita come la proliferazione in vitro del genotipo di un organismo coltivando il suo materiale biologico in vasi controllati^14,15. La coltura di cellule, tessuti e organi è stata cruciale per la biologia vegetale e animale negli ultimi decenni. Permette la riproduzione di massa di organismi in laboratorio, la rapida valutazione di diversi trattamenti (come farmaci e prodotti farmaceutici), e lo studio diretto della funzione cellulare 14,15,16,17. In generale, i modelli in vitro sono stati utili per integrare e approfondire gli studi di diversi organismi in condizioni fisiche e chimiche meglio controllate. A causa dei vantaggi delle tecniche di coltivazione in vitro, sono state sviluppate, ottimizzate e utilizzate diverse tecnologie di coltura di cellule e tessuti animali come strumenti importanti in molti campi di ricerca, dove sono state studiate e commercializzate più linee cellulari per numerose applicazioni 16,17,18.

Molti progressi nella conoscenza della coltura cellulare e tissutale sono stati fatti dalla prima coltura di tessuti animali nel 1882¹⁷, come l'uso di mezzi naturali e sintetici, l'invenzione di linee cellulari consolidate e lo sviluppo di mezzi 3D per coltivare una moltitudine di tipi di cellule in modo migliore^{16,17, 18,19}. Tuttavia, il campo della biologia cellulare si è concentrato principalmente su un gruppo selezionato di organismi modello, mentre molti taxa non hanno ancora colture in vitro ben consolidate di cellule, tessuti o organi²⁰. Ad esempio, nella ricerca sui coralli, nessuna linea cellulare immortalizzata è stata ampiamente utilizzata per la ricerca, vincolando la ricerca sulle cellule di corallo all'uso di colture cellulari primarie. Queste colture hanno vitalità limitata a poche settimane²¹, senza studi che registrano la sopravvivenza di singole cellule da tutti i tessuti di corallo per più di 13 giorni fino all'inizio del 2021²². Il primo rapporto sulle linee cellulari di corallo sostenibili ad essere pubblicato è stato con cellule di Acropora tenuis che hanno vissuto fino a 6 mesi, e l'utilità di queste cellule per la ricerca futura rimane da esplorare²³.

Per superare i limiti nella coltivazione di colture cellulari di corallo e per mantenere una coltura di laboratorio che preservi l'organizzazione tissutale complessiva dei coralli, l'uso di polipi isolati è stato recentemente proposto come modello per la ricerca sulla biologia dei coralli^24,25. I polipi sono le unità anatomiche dei coralli e ognuno di essi ha una bocca situata al centro del loro disco orale ed è collegato ad altri polipi dal cenosarco nella sua regione aborigena²⁶. La separazione dei polipi vivi avviene naturalmente attraverso il processo di salvataggio dei polipi, in cui lo stress acuto provoca la digestione del cenosarco tra i polipi, che può quindi staccarsi dallo scheletro della colonia 25,27,28. Questo fenomeno è stato segnalato per verificarsi in una varietà di taxa, tra cui octocoralli^29,30,31, coralli neri³² e coralli scleractini 25,27,28,32,33, ed è stato collegato a molteplici fattori di stress ambientali, come la mancanza di calcio nell'acqua ^24,34, l'aumento dell'acidità³⁵, condizioni iperosmotiche 25,27,32,36, alte temperature^36,37, fame ³³, esposizione all'aria^25,30 e contaminazione da insetticidi^28,38. Il salvataggio di polipi è stato, ad esempio, riportato nei coralli pocilloporidi¹⁹, che sono ampiamente distribuiti in tutto il mondo e sono comunemente usati come modelli nella ricerca sui coralli. Specie appartenenti a questo gruppo, come Pocillopora damicornis e Styllophora pistillata, hanno generato circa 30-40 micropropaghi da un frammento di 5 mm²⁵. Questo numero sottolinea il vantaggio di utilizzare il salvataggio del polipo come metodo per la micropropagazione del corallo, in quanto crea la possibilità di generare molti individui geneticamente identici da un piccolo pezzo di corallo. L'uso di polipi isolati per la ricerca ha anche gli stessi vantaggi delle colture cellulari per quanto riguarda la possibilità di essere coltivati in ambienti di laboratorio controllati, come fiaschi e piastre di Petri. Inoltre, le piattaforme microfluidiche per mantenere polipi vivi hanno dimostrato che questi micropropagati possono essere conservati in ambienti relativamente economici e facili da riprodurre, con flusso d'acqua controllato, superficie e temperatura ^24,25. Queste piattaforme di microfluidica possono anche essere utilizzate per visualizzare le strutture di coralli vivi al microscopio direttamente^24,25.

Nel presente articolo, riassumiamo e dimostriamo le tecniche che sono state sviluppate per isolare i singoli polipi di corallo dalle loro colonie, mostrando come mantenerli in condizioni di laboratorio per la coltura a lungo termine. I metodi discussi includono il salvataggio del polipo attraverso condizioni iperosmotiche per evaporazione e pompaggio di acqua di mare ad alta salinità e incubazione in acqua di mare priva di calcio.

Protocollo

Per il presente studio, una colonia appartenente alla specie di corallo Pocillopora verrucosa è stata raccolta dalla barriera corallina di Al Fahal (22.305118 N; 38.964568 E) da SCUBA immergendosi con un martello e uno scalpello. Il genere della colonia è stato identificato morfologicamente, e la sua specie è stata classificata come P. verrucosa sulla base di lavori precedentemente pubblicati, tra cui Pocillopora dal Mar Rosso, indicando che, da un punto di vista genetico, la specie presente in quest'area è P. verrucosa^39,40. La barriera corallina di Al Fahal non fa parte di un'area ambientale protetta e non sono stati necessari permessi speciali per la raccolta dei coralli. La colonia è stata tenuta in un acquario da 300 litri per un mese prima di essere frammentata e avere i suoi polipi "salvati". L'acquario è stato mantenuto a 26 °C con due riscaldatori per acquari, tre pompe e due sorgenti luminose (vedi Tabella dei materiali), mantenendo un ciclo di luce di 12 ore. La temperatura dell'acquario è stata mantenuta collegando ciascuno dei due riscaldatori a un regolatore di temperatura. L'emissione luminosa è stata programmata per iniziare alle 6 del mattino e terminare alle 6 del pomeriggio, producendo una curva di irraggiamento che ha raggiunto il picco alle 12:00 con 230 fotoni μmol m⁻²s⁻¹.

1. Salvataggio del polipo ad alta salinità dopo l'evaporazione dell'acqua

NOTA: Questo metodo è stato adattato da Shapiro et ^al.25. Se si utilizzano specie diverse da Pocillopora verrucosa, la dimensione dei polipi deve essere presa in considerazione prima di determinare la dimensione del frammento da tagliare.

1. Tagliare piccoli frammenti (meno di 1 cm di lunghezza) da una colonia di coralli usando pinze da taglio diagonali (vedi Tabella dei materiali).
   NOTA: Adattare gli utensili da taglio in base alle specie di corallo utilizzate. Le pinze diagonali sono utili per tagliare coralli con rami sottili. Nel presente studio, un frammento è stato tagliato per ogni trattamento, ma il numero e la dimensione dei frammenti possono variare a seconda del numero di polipi desiderati. La dimensione dei frammenti tagliati non deve superare la profondità dell'acqua dopo l'evaporazione, quindi i coralli rimangono completamente all'interno dell'acqua dopo che il processo è stato completato.
2. Posizionare i frammenti tagliati in piccole piastre di Petri riempite con 12 ml di acqua di mare a cui la colonia corallina è stata acclimata. Questo può essere acqua di mare artificiale (vedi Tabella dei materiali) o acqua di mare filtrata alla stessa salinità in cui è stata inserita la colonia di coralli prima della frammentazione.
   NOTA: È importante coprire completamente il frammento con acqua. Se 12 ml in una capsula di Petri non sono sufficienti per coprire il frammento tagliato, ottimizzare il contenitore e il volume di conseguenza. Nel presente studio, l'acqua utilizzata è stata raccolta dal Mar Rosso e la sua salinità era di 40 PSU, misurata da un misuratore multiparametro (vedi Tabella dei materiali).
3. Lasciare la piastra aperta per ~ 24 ore a temperatura ambiente in modo che l'acqua possa evaporare e la sua salinità possa aumentare gradualmente. Quando la digestione dei tessuti è osservabile tra i polipi, procedere al passaggio 1.4.
   NOTA: Dopo che il tempo di incubazione è passato, la salinità dell'acqua deve essere circa il 40% superiore rispetto all'inizio e i polipi devono essere pronti per essere staccati dallo scheletro.
4. Utilizzando una pipetta di trasferimento da 1 mL, creare un flusso delicato vicino al tessuto corallino. Il flusso aiuterà lentamente il completo distacco dei polipi che hanno già digerito il tessuto intorno a loro dallo scheletro.
   NOTA: quando il flusso d'acqua viene creato con la pipetta, polipi separati o gruppi di polipi devono staccarsi dallo scheletro come scaglie. Se invece una sostanza torbida si stacca, indica la morte o la disintegrazione dei tessuti, il che significa che i coralli sono stati incubati per troppo tempo o in una condizione troppo stressante (in questo caso, alta salinità). È molto importante fare un flusso delicato di acqua per staccare i polipi, poiché un flusso più forte può causare danni fisici a loro.
5. Sostituire lentamente l'acqua nella capsula di Petri con acqua isosmotica (utilizzare la stessa acqua del punto 1.2.) usando una pipetta. Uno scambio d'acqua del 50% in 10 minuti è sufficiente per acclimatare i polipi a una condizione di salinità non stressante.
   NOTA: Poiché sono state utilizzate colonie di coralli della specie pocilloporid Pocillopora verrucosa del Mar Rosso, sono stati effettuati test per determinare in quali condizioni specifiche i coralli di questo ambiente unico avrebbero salvato. È importante evidenziare l'elevata salinità del Mar Rosso rispetto alla maggior parte degli altri ambienti della barriera corallina.

2. Salvataggio di polipi mediante approvvigionamento di acqua di mare ad alta salinità

NOTA: Questo metodo è stato adattato da Chuang et ^al.27.

1. Preparare 3 L di acqua di mare ad alta salinità aggiungendo NaCl all'acqua di mare fino a quando la salinità aumenta dell'85%, misurata da una sonda di salinità.
   NOTA: Nel presente studio, è stata preparata un'acqua di mare ad alta salinità 74 PSU da 40 PSU di acqua di mare del Mar Rosso.
2. Tagliare piccoli frammenti di corallo come descritto nel passaggio 1.1.
3. Posizionare i frammenti tagliati in un contenitore da 10 L riempito con 3 L di acqua di mare isosmotica (in questo caso, acqua di mare con salinità non stressante per i coralli, la stessa utilizzata nella fase 1.2) collegato a una pompa peristaltica (vedi Tabella dei materiali).
   NOTA: per un migliore mantenimento della salute dei coralli, è possibile aggiungere regolatori di temperatura, pompe d'aria e luci per simulare le stesse condizioni dell'acquario a cui la colonia era precedentemente esposta. Durante l'incubazione nel presente lavoro, i frammenti di corallo sono stati conservati in contenitori a 26 °C, sotto un ciclo di luce giornaliera di 12 ore. Il movimento dell'acqua e l'omogeneizzazione della temperatura sono stati mantenuti da pompe ad aria.
4. Riempire il contenitore contenente frammenti di corallo con l'acqua di mare ad alta salinità preparata nella fase 2.1 utilizzando la pompa peristaltica per 24 ore a una velocità di 126 ml / h. Aggiungere un totale di 3 L di acqua ad una salinità crescente di circa il 40%.
   NOTA: L'acqua ad alta salinità può essere prodotta semplicemente aggiungendo NaCl all'acqua di mare fino a raggiungere la salinità prevista.
5. Creare un flusso d'acqua delicato con una pipetta per rilasciare i polipi dallo scheletro (passaggio 1.4.).
6. Scambiare lentamente l'acqua in cui sono contenuti i polipi con acqua isosmotica (Fase 1.5.). Quindi, procedere al passaggio 4 o al passaggio 5.

3. Salvataggio del polipo mediante incubazione di acqua di mare priva di calcio

NOTA: Questo metodo è stato adattato da Pang et ^al.24.

1. Preparare la soluzione di acqua di mare artificiale priva di calcio (CaFSW) aggiungendo 26,29 g di NaCl, 0,872 g di KCl, 2,16 g di MgSO₄, 11,94 g di MgCl₂, 3,42 g di Na₂SO₄ e 0,286 g di NaHCO₃ (vedi Tabella dei materiali) a 1 L di acqua deionizzata.
   NOTA: Questa soluzione è stata adattata dai protocolli precedenti per essere più adatta per i coralli adattati a una salinità di 40 PSU. Per i coralli adattati ad altre condizioni di salinità, utilizzare la stessa proporzione di sali ma regolare la massa totale dei soluti per ottenere la salinità più adatta ai coralli in uso.
2. Tagliare piccoli frammenti di coralli come descritto nel passaggio 1.1.
3. Immergere i frammenti di corallo in piastre di Petri riempite con il CaFSW preparato in precedenza (Step 3.1.) e incubarli in incubatori orbitali ad una velocità di rotazione di 80 rpm per 3 h.
   NOTA: Ancora una volta, è importante coprire completamente il frammento con acqua. Se una capsula di Petri non è sufficiente a coprire il frammento, ottimizzare il contenitore e il volume in base alle esigenze sperimentali.
4. Trasferire i frammenti in piastre di Petri o piastre a 6 pozzetti riempite con 20% di Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM) e 100 mg/mL di soluzione di ampicillina (vedi Tabella dei materiali) preparata con acqua di mare artificiale a 40 PSU. Incubare i frammenti a 26 °C e 80 giri/min, scambiando il mezzo ogni giorno fino a quando la digestione dei tessuti è osservabile tra i polipi e i singoli polipi iniziano a staccarsi dallo scheletro.
   NOTA: Nella maggior parte dei casi, la digestione dei tessuti è completa entro 20 ore dall'incubazione in questo mezzo e non sono necessari scambi.
5. Trasferire i polipi in acqua di mare sterilizzata per il recupero iniziale utilizzando una pipetta. Dopo 1 ora di incubazione, procedere al passaggio 4 o al passaggio 5.

4. Manutenzione del polipo nelle piastre di Petri

1. Una volta che i polipi vengono restituiti all'acqua di mare filtrata con salinità non stressante, selezionare polipi vitali osservando l'integrità del tessuto e il movimento causato dal flusso ciliare sotto uno stereomicroscopio.
2. Posizionare i polipi selezionati in una capsula di Petri di vetro o plastica e coprire la capsula di Petri con una rete di plancton (dimensione della maglia di 200 μm, vedere Tabella dei materiali) in modo che i polipi non galleggino lontano dal piatto.
   NOTA: la dimensione della rete a maglie può variare in base alla dimensione dei polipi. È importante notare che le reti devono avere pori più piccoli dei polipi e consentire lo scambio d'acqua e la penetrazione della luce.
3. Posizionare la capsula di Petri all'interno di un acquario con le condizioni appropriate per le specie di corallo utilizzate.
   NOTA: Nel presente studio, le condizioni erano 40 PSU di acqua di mare filtrata a 26 °C e un ciclo di luce di 12 ore.
4. Aprire le piastre di Petri almeno una volta alla settimana per rinnovare l'acqua e pulire le stoviglie. Questo passaggio è importante per eliminare la crescita eccessiva di alghe che possono competere o danneggiare i polipi di corallo rilasciando localmente composti tossici.

5. Manutenzione del polipo negli incubatori

1. Selezionare polipi vitali come descritto nel passaggio 4.1.
2. Posizionare i polipi in palloni a^{75 cm a 2} celle superficiali riempiti con 50 ml di acqua di mare isosmotica utilizzando pipette di trasferimento.
   NOTA: Nel lavoro attuale, l'acqua di mare filtrata raccolta dal Mar Rosso è stata utilizzata per la manutenzione dei polipi. È possibile utilizzare acqua con le stesse caratteristiche di quella utilizzata nel passaggio 1.2.
3. Chiudere i palloni e spostarli negli incubatori. Impostare gli incubatori su cicli di luce di 12 ore a 26 °C e 40 giri/min. Scambia il 50% del volume d'acqua ogni 4 giorni e trasferisci il contenuto in palloni puliti quando / se si riempiono di alghe o biofilm sulle pareti.
   NOTA: Le immagini sono state catturate con un sistema di zoom completamente apocromatico dotato di una telecamera HD (vedi Tabella dei materiali) per i risultati rappresentativi.

Risultati

Il salvataggio di polipi è stato indotto in frammenti di corallo appartenenti a una singola colonia della specie P. verrucosa seguendo tre diversi metodi (Figura 1). Il salvataggio indotto dall'elevata salinità dopo che l'evaporazione dell'acqua è stata completata dopo 24 ore di incubazione di frammenti di corallo in piastre di Petri a temperatura ambiente riempite con acqua inizialmente a 40 PSU, che ha poi raggiunto una salinità finale di 59 PSU una volta terminato il processo (Figura 2A-C,I). Il salvataggio per approvvigionamento di acqua salata è stato raggiunto anche dopo 24 ore di incubazione in acqua inizialmente a 40 PSU che ha raggiunto una salinità di 52 PSU dopo 12 ore e 59 PSU alla fine del processo, dopo 24 ore (Figura 2D-F,I). In entrambi gli esperimenti, un aumento della salinità è stato responsabile dell'induzione della digestione dei tessuti da parte dei polipi. Dopo 12 ore, l'elevata condizione di salinità ha causato la contrazione dei polipi in concomitanza con il graduale assottigliamento del cenosarco, causando infine il distacco finale dei polipi dopo 24 ore. L'induzione del salvataggio attraverso l'incubazione in acqua di mare priva di calcio è stata completata dopo un'incubazione di 3 ore in CaFSW seguita da un'incubazione di 20 ore nel mezzo DMEM al 20% (Figura 2G-H). Il tessuto è stato staccato dallo scheletro in tutti e tre i metodi dopo averlo spinto via con una pipetta fino a quando non sono stati generati polipi di corallo individualizzati (Figura 3A-C) e "sfere di tessuto".

Dopo il distacco, i polipi di tutti e tre i metodi sono stati raccolti e lasciati recuperare in acqua di mare prima di essere assegnati a piastre di Petri coperte da reti o fiaschi cellulari. I polipi ottenuti dall'evaporazione e dai metodi di approvvigionamento idrico sono stati mantenuti in piastre di Petri all'interno di acquari e sono sopravvissuti rispettivamente per 6 settimane e 8 settimane (Figura 3D e Figura 3F). Questi micropropagati hanno mantenuto la solita anatomia dei polipi, presentando tentacoli, dischi basali e bocche¹. I polipi ottenuti attraverso l'incubazione in acqua di mare priva di calcio hanno avuto una breve durata di vita, sopravvivendo fino a 1 giorno, dopo di che il loro tessuto si è dissociato. I polipi ottenuti dal metodo di evaporazione dell'acqua di mare conservati in palloni di coltura cellulare all'interno di incubatori sono sopravvissuti fino a 3 settimane senza dissociazione dei tessuti (Figura 3F). In tutti i casi, anche se i polipi non potevano attaccarsi al substrato, erano visivamente sani e mantenevano il loro colore, con le cellule zooxantelle ancora visibili all'interno dei loro tessuti¹.

Figura 1: Rappresentazione schematica delle tre diverse metodologie testate per l'induzione del salvataggio dei polipi (a sinistra) seguita dall'illustrazione di due metodi per mantenere i polipi acquisiti in condizioni di laboratorio (a destra). (A) Rappresentazione della metodologia per il salvataggio dei polipi mediante evaporazione dell'acqua. (B) Rappresentazione della metodologia per il salvataggio dei polipi mediante l'approvvigionamento di acqua di mare ad alta salinità. (C) Rappresentazione della metodologia per il salvataggio dei polipi mediante incubazione di acqua di mare priva di calcio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Immagini del processo di salvataggio del polipo indotto da tre diverse metodologie utilizzando frammenti della specie corallina P. verrucosa. (A-C) Un frammento di corallo a 0 h, 12 h e 24 h dopo l'incubazione, rispettivamente, in una capsula di Petri usando il metodo di evaporazione dell'acqua. (D-F) Un frammento di corallo a 0 h, 12 h e 24 h dopo l'incubazione, rispettivamente, utilizzando il metodo di approvvigionamento di acqua di mare ad alta salinità. (G,H) Frammenti di corallo esposti al metodo di incubazione dell'acqua di mare priva di calcio prima e dopo, rispettivamente. Le incubazioni in acqua di mare artificiale priva di calcio sono state per 3 ore e in DMEM al 20% per 21 ore. (I) Rappresentazione grafica dei valori di salinità in PSU dell'acqua di mare nel tempo durante l'evaporazione dell'acqua e i metodi di induzione di salvataggio dell'acqua di mare ad alta salinità. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Immagini di polipi di P. verrucosa ottenute dalle tre procedure di induzione del salvataggio dimostrate. (A-C) Le immagini dei polipi ottenute rispettivamente dall'evaporazione, dall'approvvigionamento di acqua salata e dai metodi di acqua di mare priva di calcio sono state catturate immediatamente dopo essere state staccate dallo scheletro. (D) L'immagine di un polipo di corallo ottenuto dal metodo di evaporazione dopo essere sopravvissuto 6 settimane in una capsula di Petri. (E) L'immagine di un polipo di corallo ottenuto dal metodo di approvvigionamento di acqua salata dopo essere sopravvissuto 8 settimane in una capsula di Petri. (F) L'immagine di un polipo di corallo ottenuto dal metodo di evaporazione dopo essere sopravvissuto 3 settimane in un pallone di coltura cellulare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Il tasso di sopravvivenza dei polipi dopo essere stato sottoposto a processi di salvataggio e il tempo necessario per il completamento del processo variano tra^{le ricerche} precedentemente riportate ^25,33,41, il che è probabilmente spiegato dai diversi approcci sperimentali applicati in ogni studio. Ad esempio, diverse specie di coralli, o anche coralli della stessa specie ma acclimatati a diverse condizioni ambientali (ad esempio, coralli del Mar Rosso), presentano soglie diverse ai livelli di salinità. Anche il metodo di salvataggio selezionato e le condizioni di laboratorio/ acquario svolgono un ruolo importante nei risultati. In alcuni casi, il mantenimento dei micropropaghi di corallo in condizioni di laboratorio ha superato il tempo di sopravvivenza delle colture cellulari di corallo raggiungendo mesi di sopravvivenza in azooxanthellato^{3 3,41} e zooxantelato²⁵ coralli. Il tempo per il completamento del processo di salvataggio del polipo è variato anche in diversi studi, che vanno da poche ore^{2 5,2 7,30} a settimane³⁵ di incubazione esposte al fattore di stress responsabile di causare il salvataggio. Un'altra variabile da tenere in considerazione quando si studia il salvataggio dei polipi è il recupero dei polipi dopo l'esposizione allo stress acuto che ne ha innescato il rilascio. È ancora discutibile se i polipi dopo il salvataggio siano in condizioni abbastanza buone da essere utilizzati come modelli per studiare la biologia dei coralli. Il recupero dei loro tessuti dopo la degradazione del cenosarco è motivo di preoccupazione quando si utilizzano questi micropropaghi. Tuttavia, i polipi in molti studi, incluso il presente, sono stati in grado di presentare cellule di zooxantelle all'interno dei loro tessuti e morfologie esterne con polarizzazione orale-aborigena intatta e tentacoli settimane dopo il salvataggio 25,27,32,36. Studi precedenti hanno anche scoperto che, dopo essere stati sollevati dallo stress acuto, i polipi di corallo rilasciati esposti ad acqua di mare altamente salina o riscaldata sono stati in grado di recuperare l'espressione di geni legati a processi come l'apoptosi, la proteolisi e la divisione cellulare a livelli simili a quelli trovati prima del salvataggio^32,36 e persino di aumentare l'espressione di geni legati alla guarigione dei tessuti³⁶.

Per quanto riguarda la differenza di sopravvivenza tra i metodi, è importante evidenziare che questo tempo può variare tra diversi esperimenti anche se vengono utilizzate le stesse tecniche, e può essere correlato alla salute dei frammenti utilizzati e al corretto mantenimento dei polipi dopo il processo di salvataggio. Nel caso del salvataggio attraverso l'incubazione di acqua di mare priva di calcio, la sopravvivenza del polipo è stata limitata a 1 giorno. Pertanto, si può concludere che il metodo non è adatto per la sopravvivenza a lungo termine delle specie studiate, o deve essere fatto un migliore adattamento della tecnica per i coralli P. verrucosa del Mar Rosso. I risultati riportati hanno mostrato che un tempo di sopravvivenza più lungo è stato ottenuto con i metodi basati sul graduale aumento della salinità, quando i polipi sono stati sottoposti al gocciolamento di acqua ad alta salinità. Questo metodo può fornire un aumento più controllato della salinità rispetto al metodo di evaporazione, non essendo allo stesso tempo responsabile di un aumento della concentrazione di altre sostanze presenti nell'acqua di mare, compresi i rifiuti metabolici del corallo, che sono potenzialmente tossici per l'organismo. Per tutti questi motivi, questo metodo è stato suggerito come alternativa più sicura per mantenere polipi^{sani 27}. Sebbene questo metodo sia stato ipotizzato per essere più sicuro per la salute dei polipi e in grado di produrre polipi che vivono più a lungo, un fatto che è stato confermato in questa pubblicazione attuale, sono necessari ulteriori sondaggi per confermarlo. Entrambi gli esperimenti di salvataggio indotti da salinità elevata hanno dimostrato un completo distacco di polipi dopo che la salinità ha raggiunto 59 PSU in 24 ore. Se la salinità viene aumentata oltre il livello al quale il salvataggio è completo, ulteriore stress sarà causato ai polipi, riducendo le loro possibilità di sopravvivere e riprendersi dal trattamento dello stress acuto. Pertanto, non è consigliabile mantenere i polipi più a lungo in tali livelli di salinità. Quando si esegue il metodo di induzione del salvataggio mediante esposizione ad acqua di mare priva di calcio, è stato ottenuto un distacco completo da un'incubazione di 3 ore in acqua di mare artificiale priva di calcio, il che significa che anche un'ulteriore esposizione a questo mezzo non è raccomandata.

Per affrontare i metodi che erano più adeguati per lo studio dei polipi di corallo in indagini di laboratorio / in vitro , questo studio si è concentrato solo su tre procedure che hanno richiesto quasi 24 ore per il completamento del processo di salvataggio e sono state utilizzate in studi che hanno coinvolto il mantenimento a lungo termine dei polipi di corallo da coralli scleractiniani. Altri metodi segnalati per richiedere molto più tempo di questo tempo non sono stati impegnati. L'insediamento di polipi su un substrato non è stato tentato in questo studio, che si è concentrato sulla produzione di polipi che potrebbero essere trasferiti in ambienti diversi o facilmente raccolti per le analisi utilizzando pipette usa e getta. I risultati dimostrano che i polipi della specie di corallo P. verrucosa sono stati mantenuti in vita, con cellule zooxantelle associate, stato visivo sano e una struttura anatomica esterna grossolana conservata, fino a 8 settimane, anche senza attaccamento a un substrato. Questi risultati indicano che più repliche biologiche possono essere generate da singoli frammenti di corallo utilizzando alcune delle tecniche dimostrate in questo studio. Tali repliche biologiche possono essere conservate in ambienti controllati (come piastre di Petri e fiaschi cellulari) e mantenute in condizioni di laboratorio per esperimenti di un mese e utilizzate per diversi scopi.

Dalle prime descrizioni incidentali del salvataggio dei polipi ^42,43, sono stati stabiliti nuovi protocolli per trovare metodi più standardizzati per indurre il rilascio di polipi e mantenere vivi tali polipi, che possono essere utilizzati per future applicazioni di ricerca. Questi includono lo studio di diversi aspetti associati alla fisiologia dell'olobionte del corallo⁴⁴ e alle interazioni ospite-microbioma⁴⁵, i meccanismi molecolari coinvolti nello sbiancamento dei coralli ^5,25 e la salute, la resilienza e la protezione dell'olobionte del corallo 12,13,46,47 . Inoltre, i polipi di corallo rilasciati possono essere utilizzati per applicazioni al di fuori del regno della ricerca e sono stati suggeriti utili per creare propaguli che possono attaccarsi a un substrato e crescere, creando potenzialmente più individui di corallo che possono essere utilizzati per scopi di restauro una volta che i protocolli standardizzati per il salvataggio diventano diffusi²⁸ . Nel complesso, sebbene dovrebbero essere eseguiti esperimenti più approfonditi utilizzando polipi salvati per standardizzare la metodologia, è stato dimostrato che il salvataggio dei polipi è un approccio riproducibile che può essere applicato come strumento nella ricerca sui coralli per diversi scopi.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
5560 Conductivity/Temperature Probe	YSI	5560	Conductivity probe used with the ProQuatro Multiparameter meter
Ace 5 in. Alloy Steel Diagonal Pliers	Ace Hardware	2004083	Used to cut coral fragments
Ampicillin sodium salt	Sigma-Aldrich	A9518	Used in DMEM medium.
DMEM (1x) Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	41965-039	Used for incubating coral fragments in the calcium-free polyp bail-out method
Fisherbrand Petri Dish, Stackable Lid 60 mm x 15 mm Sterile, Polystyrene	Thermo Fisher Scientific	FB0875713A	Petri dish used for bail-out by evaporstion and for keeping polyps inside an aquarium.
Heizer Titanrohr Heizstab SW MW 600 Watt	Schego	548	Heaters used in aquarium
Leica Application Suite Version 4.2	Leica Microsystems	NA	Software used for image capture in demonstrative results
Leica IC80 HD	Leica Microsystems	12730216	Camera used to take demonstrative results pictures
Leica MDG33	Leica Microsystems	10 450 123	Stereoscope stand used to take demonstrative results pictures
Leica Z6 APO	Leica Microsystems	NA	Macroscope used to take demonstrative results pictures
Magnesium Chloride	Thermo Fisher Scientific	7487-88-9	Used for preparing calcium-free artificial seawater.
Magnesium Sulfate Anhydrous	Sigma-Aldrich	7791-18-6	Used for preparing calcium-free artificial seawater.
Masterflex I/P Easy-Load Pump Head for Precision Tubing, White PPS Housing, SS Rotor	Masterflex	HV-77602-10	Peristaltic pump head.
Masterflex L/S Precision Modular Drives with Benchtop Controller	Masterflex	EW-07557-00	Peristaltic pump drive used for pumping high salinity seawater. Can be substituted for any peristaltic pump capable of mainaining water flow as described in protocol.
Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone, L/S 16; 25 ft	Masterflex	HV-96410-16	Tubing for peristaltic pump.
Millex 33 mm PVDF 0.22 µm Sterile RUO	Sigma-Aldrich	SLGVR33RS	Used to filter artificial sea water.
Nunc EasYFlask 75 cm2 Nunclon Delta Surface	Thermo Fisher Scientific	156499	Flask usually used for cell culture used for polyp culture.
Orbital shaker, Advanced 5000, VWR	VWR	444-2916	Shaker used inside incubator.
Percival Incubator - I-22VL	Percival	NA	Incubator used for maintaing corals kept in cell flasks.
Plankton net 200 µm mesh size	KC Denmark	NA	Used for covering petri dishes containing coral polyps.
Potassium Chloride	VWR Chemicals	7447-40-7	Used for preparing calcium-free artificial seawater.
ProQuatro Multiparameter Meter	YSI	606950	Used for measuring salinity thoughout the protocol
RADION XR15 G5 PRO	Ecotech	NA	Lights used in aquarium
Red Sea Salt Premium grade, moderate Alkalinity	Red Sea	NA	Used to prepare 40 PSU artifical sea water.
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	144-55-8	Used for preparing calcium-free artificial seawater.
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S3014	Used for preparing calcium-free artificial seawater.
Sodium Sulfate Anhydrous	VWR Chemicals	7757-82-6	Used for preparing calcium-free artificial seawater.
TRD 112 thermostat	Schego	NA	Thermostat used in aquarium
Turbelle Nanostream 6025	Tunze	6025 000	Pumps used in aquarium