Rilevamento di Candidatus liberibacter asiaticus distribuibile sul campo utilizzando l'amplificazione della polimerasi ricombinasi combinata con CRISPR-Cas12a

Riepilogo

In questo lavoro, è stato sviluppato un metodo di rilevamento rapido, sensibile e portatile per Candidatus Liberibacter asiaticus basato sull'amplificazione della polimerasi ricombinasi combinata con CRISPR-Cas12a.

Abstract

La diagnosi precoce di Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) da parte degli agrumicoltori facilita l'intervento precoce e previene la diffusione della malattia. Qui viene presentato un semplice metodo per la diagnosi rapida e portatile di Huanglongbing (HLB) che combina l'amplificazione della polimerasi ricombinasi e un reporter fluorescente che utilizza l'attività nucleasica del sistema 12a (CRISPR-Cas12a) associato a CRISPR regolarmente intervallato. La sensibilità di questa tecnica è molto più alta della PCR. Inoltre, questo metodo ha mostrato risultati simili alla qPCR quando sono stati utilizzati campioni di foglie. Rispetto ai metodi di rilevamento CLas convenzionali, il metodo di rilevamento qui presentato può essere completato in 90 minuti e funziona in una condizione isotermica che non richiede l'uso di macchine PCR. Inoltre, i risultati possono essere visualizzati attraverso un dispositivo di rilevamento fluorescente portatile sul campo.

Introduzione

Huanglongbing (HLB) è una delle malattie degli agrumi più problematiche in tutto il mondo¹. L'HLB è causata dai batteri filocolonizzatori e fastidiosi Candidatus Liberibacter spp., tra cui Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), Ca. L. africanus e Ca. L. americanus ². La specie associata all'HLB più diffusa in Cina e negli Stati Uniti è CLas, che viene trasmessa dalle psillidi asiatiche degli agrumi (Diaphorina citri) o attraverso l'innesto³. Dopo essere stati infettati da CLas, gli alberi di agrumi mostrano un declino della crescita fino alla morte². I sintomi comuni delle foglie di agrumi infettate da CLas sono chiazze chiazzate, isole verdi (piccoli punti circolari verde scuro), vene di sughero sollevate su foglie più spesse e coriacee e germogli ingialliti non uniformi². Inoltre, i frutti infetti da CLas appaiono piccoli e sbilenchi².

Poiché nessuna varietà di agrumi è resistente all'HLB e non esiste una cura terapeutica per l'HLB, la prevenzione dell'HLB richiede la quarantena e l'isolamento degli alberi di agrumi CLas-positivi ^2,3. Pertanto, la diagnosi precoce è fondamentale per il monitoraggio e la quarantena per prevenire la diffusione di CLas e ridurre al minimo le perdite economiche³. Inoltre, è necessario rilevare CLas sensibili a causa del basso titolo di CLas nelle piante durante la fase iniziale dell'infezione³. In Cina, il rilevamento di CLas viene solitamente condotto da alcuni centri di test certificati. Tuttavia, il processo di rilevamento richiede in genere almeno 1 settimana e la tassa di rilevamento è costosa. Pertanto, per aiutare a monitorare l'incidenza di HLB

Varie tecnologie sono state applicate per diagnosticare HLB 4,5,6,7,8,9. La reazione a catena della polimerasi (PCR) e la PCR quantitativa (qPCR) sono gli strumenti più utilizzati per la rilevazione di CLas grazie alla loro elevata sensibilità e specificità ^4,5. Tuttavia, queste tecnologie si basano fortemente su strumenti costosi e personale altamente qualificato. Inoltre, diversi metodi di amplificazione isotermica, come l'amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP), sono stati sviluppati come alternative interessanti ai metodi PCR convenzionali grazie alla loro semplicità, rapidità e basso costo ^8,9,10. Tuttavia, è difficile applicarli per rilevare con precisione i CLas a causa dei segnali di amplificazione non specifici, che possono causare risultati falsi positivi.

Il rilevamento dell'acido nucleico basato su endonucleasi CRISPR / Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated) guidato da RNA è stato sviluppato come tecnologia di diagnostica molecolare di nuova generazione grazie alla sua elevata sensibilità, specificità e affidabilità^11,12,13,14. Queste tecnologie diagnostiche CRISPR/Cas si basano sull'attività di nucleasi collaterale delle proteine Cas per scindere il DNA a singolo filamento (ssDNA) modificato con un reporter fluorescente e un quencher di fluorescenza a ciascuna estremità degli oligonucleotidi, nonché un dispositivo di rilevamento della fluorescenza per catturare il reporter fluorescente rilasciato^11,12 . L'attività nucleasica di diversi effettori Cas attivati dal duplex bersaglio dell'RNA CRISPR (crRNA) può scindere indiscriminatamente il circostante ssDNA¹¹ non bersaglio. CRISPR-Cas12a (chiamato anche Cpf 1), un sistema CRISPR/Cas di classe 2 di tipo V-A, dimostra diversi vantaggi rispetto a Cas9, come una minore tolleranza al mismatch e una maggiore specificit๳. Il sistema Cas12a/crRNA è stato applicato per la rilevazione sensibile e specifica degli acidi nucleici di patogeni umani e fitopatogeni 14,15,16,17,18. Pertanto, l'utilizzo del sistema Cas12a/crRNA dovrebbe consentire la rilevazione accurata e sensibile dell'acido nucleico di CLas.

Cas12a da solo non è teoricamente abbastanza sensibile da rilevare bassi livelli di acidi nucleici. Pertanto, per migliorare la sua sensibilità di rilevamento, il rilevamento CRISPR-Cas12a è tipicamente combinato con un passo di amplificazione isoterma^14,15. L'amplificazione della polimerasi ricombinasi (RPA) consente un'amplificazione del DNA isoterma sensibile e rapida in un intervallo di temperatura da 37 °C a 42 °C¹⁹.

Una piattaforma di rilevamento chiamata DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter) che combina l'attività DNasi di Cas12a con RPA e una lettura della fluorescenza è stata recentemente ideata¹² e ha dimostrato di rilevare l'acido nucleico con una maggiore sensibilità²⁰. Inoltre, il segnale di fluorescenza emesso dai campioni positivi può essere osservato attraverso un dispositivo portatile di rilevamento della fluorescenza sul campo.

Poiché abbiamo amplificato il DNA con RPA, progettato crRNA mirato al gene nrdB (subunità della ribonucleotide reduttasi β-subunità) a cinque copie specifico di CLas²¹ e impiegato l'attività DNasi della proteina Cas12a, abbiamo chiamato questo metodo di rilevamento CLas CLas-DETECTR. Rispetto ai metodi di rilevamento CLas esistenti, CLas-DETECTR è veloce, accurato, sensibile e implementabile.

Protocollo

1. Costruzione del CLas-DETECTR

NOTA: La costruzione di CLas-DETECTR è un processo in quattro fasi: preparazione della soluzione, isolamento totale del DNA degli agrumi, amplificazione isotermica del DNA e visualizzazione dei risultati. Lo schema del test CLas-DETECTR è illustrato nella Figura 1A.

1. Preparazione della soluzione
   1. Preparare il tampone A: 20 mM NaOH in PEG 200 al 6%. Per 100 ml, aggiungere 113 mg di NaOH e 6 g di PEG 200 in 80 ml di H₂O in un flacone. Incubare il flacone a bagnomaria a 60 °C fino a quando tutto il PEG 200 è sciolto. Quindi, aggiungere H₂O a un volume di 100 ml.
   2. Preparare la soluzione B: Per ogni reazione, aggiungere 10 μL di tampone RPA, 0,8 μL di F-RPA-RNRf, 0,8 μL di R-RPA-RNRr e 3,9 μL di ddH₂O ad un volume finale di 15,5 μL.
      NOTA: F-RPA-RNRf e R-RPA-RNRr sono i primer utilizzati nel test contro il gene nrdB . Vedere la tabella 1 per la sequenza.
   3. Preparare la soluzione C: Per ogni reazione, aggiungere 1 μL di ssDNA reporter, 3 μL di tampone NEB 3.1, 1 μL di crRNA, 4 μL di Cas12a e 11 μL di ddH₂O ad un volume finale di 20 μL.
      NOTA: Se vi sono molti campioni da rilevare, effettuare un grande volume di soluzione B e soluzione C e aliquote in seguito.
2. Isolamento totale del DNA degli agrumi
   NOTA: Per risparmiare tempo e rendere questo metodo adatto per la rilevazione di CLas di campo, è stato utilizzato l'approccio basato sul glicole polietilenico alcalino (PEG) per ottenere estratti vegetali grezzi per l'amplificazione del DNA^22,23
   1. Le foglie di agrumi sono state utilizzate in questo protocollo. Per prima cosa, punzona, punzonate cinque dischi fogliari da una foglia. Quindi, inserire i dischi fogliari in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml e aggiungere 200 μL di tampone A.
      NOTA: Sul campo, pulire prima le foglie se c'è polvere che le copre. I dischi fogliari possono essere tagliati utilizzando il coperchio del tubo da 1,5 ml per evitare la contaminazione incrociata. Altri tessuti di agrumi, come radici, steli, frutti e fiori, possono anche essere utilizzati in questo protocollo.
   2. Macinare manualmente i dischi fogliari fino a lisci con un'asta di plastica.
   3. Lasciare il tubo indisturbato per 10 minuti. Quindi, utilizzare il surnatante per l'amplificazione del DNA.
      NOTA: Il test può essere messo in pausa qui e gli estratti vegetali grezzi estratti con il metodo alcalino-PEG possono essere conservati a -20 °C per almeno 1 anno. Gli alberi di Newhall (Citrus sinensis Osbeck var. Newhall) mostrati nel video sono stati coltivati in un vaso riempito con un mix di 9/3/1 (v / v / v) terreno di torba / vermiculite / perlite e mantenuto in una serra situata nel campus della Gannan Normal University, Jiangxi, Cina. Gli alberi infetti da HLB sono stati inoculati mediante innesto con gemme Newhall CLas-positive. Gli alberi infetti da HLB e non infetti da HLB sono stati confermati dalla PCR. La CLas è stata rilevata utilizzando la coppia di primer (F-RPA-RNRf/R-RPA-RNRr) mirata al gene marcatore specifico CLas nrdB. D'altra parte, i sintomi caratteristici di HLB, la chiazza macchiata e le foglie ingiallite possono essere trovati su CLas-positivi ma non su alberi CLas-negativi.
3. Amplificazione isotermica del DNA
   1. Aggiungere 1 μL di surnatante della fase 1.2.3 e 1 μL di MgOAc (concentrazione finale di 14 mM) nella soluzione B e mescolare bene.
   2. In laboratorio, incubarli in una semplice incubatrice a 37 °C per 15 minuti.
      NOTA: Sul campo, tenere i tubi in mano per 15 minuti. Si consiglia inoltre di incubare i tubi in un semplice incubatore a 37 °C per 15 minuti se le condizioni lo consentono.
4. Visualizzazione dei risultati
   1. Aggiungere 10 μL della miscela del punto 1.3.2 nella soluzione C e mescolare bene.
   2. Incubarli in un'incubatrice a 37 °C per 60 minuti.
   3. Indossare occhiali e osservare il segnale di fluorescenza verde rilasciato dal reporter ssDNA etichettato con 5' 6-Fluoresceina a 5' e il quencher di fluorescenza a 3' attraverso un dispositivo di rilevamento fluorescente portatile (lunghezza d'onda di eccitazione: 440 nm, lunghezza d'onda di emissione: 500 nm).
      NOTA: il segnale di fluorescenza verde può durare diversi giorni, è meglio
      ATTENZIONE: La luce emessa dal dispositivo di rilevazione a fluorescenza è dannosa per gli occhi. Assicurati di indossare occhiali prima di osservare i risultati.

2. Test di specificità

NOTA: Per testare la specificità di CLas-DETECTR, il batterio della rizosfera Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) e Burkholderia stabilis ceppo 1440 isolato in laboratorio²⁴ sono stati sottoposti al test CLas-DETECTR.

NOTA: Candidatus Liberibacter (CLas) non può essere coltivato. Si può ottenere DNA CLas solo dall'estrazione di DNA genomico da tessuti di agrumi infettati da CLas. Xcc è l'agente causale di un'altra importante malattia degli agrumi, il cancro degli agrumi. Burkholderia stabilis ceppo 1440 è un batterio anti-Xcc isolato in laboratorio. Pertanto, sono stati utilizzati ceppi puri per tutti e tre questi batteri.

1. Estrarre il DNA genomico batterico (gDNA) utilizzando un kit di estrazione del DNA genomico batterico seguendo il protocollo del produttore. Usa l'acqua come controllo negativo.
2. Eseguire la PCR utilizzando strisce tubolari PCR da 0,2 ml con cappucci ottici in una miscela di reazione da 25 μL contenente 1 μL di F-RPA-RNRf, 1 μL di R-RPA-RNRr, 12,5 μL di Ex Taq Versione 2.0 più colorante, 1 μL di modello di DNA e 9,5 μL di H₂O.
   1. Utilizzare le seguenti condizioni di reazione del ciclo termico: 1 min a 98 °C; seguiti da 35 cicli di 10 s a 98 °C, 30 s a 55 °C, 15 s a 72 °C; poi 10 min a 72 °C; e tenere a 16 °C.
   2. Eseguire i prodotti PCR su gel di agarosio all'1% a 120 V per 15 minuti.
3. Eseguire la qPCR in una miscela di reazione da 20 μL contenente 0,8 μL di F-RPA-RNRf, 0,8 μL di R-RPA-RNRr, 10 μL di 2x TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus), 1 μL del modello di DNA e 7,4 μL di H₂O.
   1. Utilizzare le seguenti condizioni di reazione del ciclo termico: 30 s a 95 °C; seguiti da 45 cicli di 5 s a 95 °C e 32 s a 60 °C; e poi uno stadio di curva di fusione di 15 s a 95 °C, 1 min a 60 °C e 15 s a 95 °C.
   2. Includi tre ripetizioni tecniche in ogni ripetizione.
4. Eseguire il metodo CLas-DETECTR seguendo i passaggi da 1.1 a 1.4.

3. Confronto della sensibilità

1. Per testare la sensibilità di CLas DETECTR, rilevare una serie di diluizioni di frammenti di DNA CLas utilizzando PCR, CLas-DETECTR e qPCR, come descritto sopra.
2. Amplificare un segmento di DNA con una lunghezza di 1.060 bp da nrdB utilizzando il primer set F-RNR e R-RNR in una miscela di reazione da 100 μL contenente 4 μL di F-RNR, 4 μL di R-RNR, 50 μL di PrimeSTAR Max Premix, 2 μL di DNA template e 40 μL di H₂O, seguendo le condizioni di reazione del ciclo termico (30 s a 98 °C; seguiti da 35 cicli di 10 s a 98 °C, 15 s a 55 °C, 30 s a 72 °C; poi 10 min a 72 °C; e tenere a 16 °C).
   NOTA: Il gene nrdB (subunità della ribonucleotide reduttasi β-) è specifico per CLas²¹. Si può facilmente ottenere l'amplicone nrdB dal gDNA di agrumi CLas-positivo usando il primer set F-RNR e R-RNR. Il primer set F-RNR e R-RNR amplifica un frammento nrdB da 1.060 bp, mentre il primer set F-RPA-RNR e R-RPA-RNR amplifica un frammento di 104 bp del gene nrdB, che è la parte del frammento nrdB da 1.060 bp.
3. Purificare i prodotti PCR con un kit di estrazione del gel di DNA seguendo il manuale del produttore.
4. Diluire i prodotti PCR contenenti gli ampliconi nrdB con ddH₂O sterilizzato.
5. Calcola il numero di copie del gene nrdB utilizzando il numero di copia del DNA online disponibile in commercio e il calcolatore di diluizione.
6. Preparare diluizioni del DNA contenenti 2,01 × 10⁶ copie/μL, 2,01 × 10⁵ copie/μL, 2,01 × 10⁴ copie/μL, 2,01 × 10³ copie/μL, 2,01 × 10 2 copie/μL, 2,01 × 10¹ copie/μL, 2,01 × 10⁰ copie/μL e^2,01 × 10⁻¹ copie/μL di frammenti di DNA CLas.

4. Rilevamento del campione

NOTA: Dopo il test di specificità e sensibilità, il metodo CLas-DETECTR è stato utilizzato per rilevare la presenza di CLas nei campioni di foglie di campo raccolti dagli aranci dolci di Newhall coltivati nel vivaio di risorse di germoplasma nel campus della Gannan Normal University, Jiangxi, Cina. È stata eseguita una qPCR per verificare i risultati.

1. Prova un totale di 15 alberi. Usa l'acqua come controllo negativo.
2. Eseguire i metodi CLas-DETECTR e qPCR come descritto in precedenza.
   NOTA: A causa delle caratteristiche di distribuzione non uniforme delle CLas negli agrumi, le foglie che mostrano sintomi di HLB sono state raccolte in via prioritaria. Se un albero sembrava sano, le foglie sono state raccolte in modo casualeIl sistema CLas-DETECTR funziona correttamente.

Risultati

Qui, abbiamo descritto una piattaforma portatile, CLas-DETECTR, che combina i sistemi RPA e CRISPR-Cas12a per diagnosticare HLB sul campo. Lo schema di CLas-DETECTR è illustrato nella Figura 1A.

Quando campioni di foglie provenienti dagli alberi di Newhall infetti da HLB e non infetti da HLB (Figura 1B), per i quali la presenza di CLas è stata confermata dalla PCR (Figura 1C), sono stati sottoposti al test CLas-DETECTR, è stato osservato un segnale di fluoresce...

Discussione

Questo studio presenta un metodo rapido e portatile per rilevare CLas chiamato CLas-DETECTR, che combina i sistemi RPA e CRISPR-Cas12a. Il flusso di lavoro è illustrato nella Figura 1. CLas-DETECTR rileva CLas con specificità e sensibilità (Figura 2 e Figura 3). Inoltre, utilizzando campioni di foglie di Newhall, CLas-DETECTR rileva CLas con la stessa sensibilità della qPCR (Figura 4

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
AxyPrep DNA Gel Extraction Kit	Corning	09319KE1	China
Bacterial Genomic DNA Extraction Kit	Solarbio	D1600	China
EnGen LbCas12a	TOLOBIO	32104-01	China
Ex Taq Version 2.0 plus dye	TaKaRa	RR902A	China
Handheld fluorescent detection device	LUYOR	3415RG	China
Hole puncher	Deli	114	China
Magnesium acetate, MgOAc	TwistDx	TABAS03KIT	UK
NaOH	SCR	10019718	China
NEB buffer 3.1	NEB	B7203	USA
PCR strip tubes	LABSELECT	PST-0208-FT-C	China
PEG 200	Sigma	P3015	USA
PrimeSTAR Max DNA Polymeras	TaKaRa	R045A	China
Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder	New England Biolabs	N0550S	USA
TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)	TaKaRa	RR820B	China
TwistAmp Basic	TwistDx	TABAS03KIT	UK