Controllo della frazione di particelle in scaffold di particelle ricotto microporose per colture cellulari 3D

Riepilogo

Ridurre al minimo la variabilità della frazione di particelle all'interno di scaffold granulari facilita la sperimentazione riproducibile. Questo lavoro descrive i metodi per generare scaffold granulari con frazioni di particelle controllate per applicazioni di ingegneria tissutale in vitro .

Abstract

I microgel sono gli elementi costitutivi degli scaffold di particelle ricotto microporose (MAP), che fungono da piattaforma sia per la coltura cellulare in vitro che per la riparazione dei tessuti in vivo . In questi scaffold granulari, la porosità innata generata dallo spazio vuoto tra i microgel consente l'infiltrazione e la migrazione cellulare. Il controllo della frazione di vuoto e della frazione di particelle è fondamentale per la progettazione dello scaffold MAP, poiché la porosità è un segnale bioattivo per le cellule. I microgel sferici possono essere generati su un dispositivo microfluidico per dimensioni e forma controllate e successivamente liofilizzati utilizzando metodi che impediscono la fratturazione della rete polimerica. Dopo la reidratazione, i microgel liofilizzati portano a frazioni di particelle controllate negli scaffold MAP. L'implementazione di questi metodi per la liofilizzazione dei microgel ha portato a studi riproducibili che mostrano l'effetto della frazione particellare sulla diffusione delle macromolecole e sulla diffusione cellulare. Il seguente protocollo coprirà la fabbricazione, la liofilizzazione e la reidratazione di microgel per il controllo della frazione di particelle negli scaffold MAP, nonché la ricottura dei microgel attraverso la reticolazione bio-ortogonale per la coltura cellulare 3D in vitro.

Introduzione

Gli scaffold di particelle ricotto microporose (MAP) sono una sottoclasse di materiali granulari in cui i blocchi di costruzione del microgel (μgel) sono interconnessi per formare un'impalcatura porosa e di massa. Con la microarchitettura unica di questi scaffold granulari, la porosità innata generata dallo spazio vuoto tra microgel sferici interconnessi supporta l'infiltrazione e la migrazione accelerata delle cellule¹. Gli elementi costitutivi in microgel degli scaffold MAP possono essere fabbricati da polimeri sia sintetici che naturali con modifiche chimiche². I metodi qui descritti evidenziano specificamente l'uso d....

Protocollo

1. Fabbricazione di dispositivi microfluidici

1. Litografia morbida
   NOTA: Questo protocollo descrive la fabbricazione di un dispositivo microfluidico focalizzato sul flusso progettato da de Wilson et ^al.9. Tuttavia, questo protocollo può essere utilizzato con qualsiasi progetto di dispositivo su un wafer SU-8. Il wafer può essere collegato a una capsula di Petri e quindi deve essere silanizzato per impedire l'aderenza del PDMS alle caratteristiche del wafer¹⁵.
   1. Miscelare la base di elastomero di polidimetilsilossano (PDMS) con l'agente di polimerizzazione (vedere la tabella dei ma....

Risultati

Lo scopo di questo protocollo è dimostrare la preparazione di scaffold di particelle ricotto microporose (MAP) con uno schema di reticolazione bio-ortogonale e frazioni di particelle controllate per la coltura cellulare 3D. In primo luogo, l'HA è stato modificato con gruppi pendenti norbornene da utilizzare sia nella formazione di microgel che nell'interconnessione per formare scaffold MAP. Utilizzando questi metodi, circa il 31% delle unità ripetute HA sono state modificate con successo con una maniglia funzionale no.......

Discussione

È stato dimostrato che la produzione microfluidica di microgel HA-NB genera microgel con una gamma più ristretta di distribuzione dimensionale rispetto alla produzione di lotti di emulsione ^3,9. I microgel descritti in questo protocollo sono stati formulati utilizzando un reticolante con scissione MMP (AC-GGRDGPQGIWGQDRCG-NH₂) per supportare la degradazione del materiale. Tuttavia, i microgel HA-NB possono anche essere reticolati utilizzando un link.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Luer-Lok syringe sterile, single use, polycarbonate	BD	309628
5 mL Luer-Lok syringe sterile, single use, polycarbonate	BD	309646
Alexa Fluor 488 C5 maleimide	Invitrogen	A10254	For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
Alexa Fluor 647 Phalloidin	Invitrogen	A22287	For staining cell culture samples
Aluminum foil	VWR	89107-726
Biopsy punch with plunger, 1.0 mm	Integra Miltex	69031-01
Biopsy punch, 4 mm	Integra Miltex	33-34
Blunt needle, 23 G 0.5", Non-Sterile, Capped	SAI Infusion Technologies	B23-50
Bottle-top vacuum filter, 0.22 μm	Corning	CLS430521
Calcium chloride	VWR	1B1110	For microgel washing buffer
Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 1000 μL max. volume	Rainin	17008609
Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 25 μL max. volume	Rainin	17008605
Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 250 μL max. volume	Rainin	17008608
Countess Cell Counting Chamber Slides	Invitrogen	C10228
Countess II FL Automated Cell Counter	Invitrogen	AMQAF1000
Centrifuge tube, 15 mL	CELLTREAT	667015B
Centrifuge tube, 50 mL	CELLTREAT	229421
Chloroform, ACS grade, Glass Bottle	Stellar Scientific	CP-C7304	For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
Corona plasma gun, BD-10A High Frequency Generator	ETP	11011
CryoTube Vials, Polypropylene, Internal Thread with Screw Cap	Nunc	368632
D1 mouse mesenchymal cells	ATCC	CRL-12424	Example cell line for culture in MAP gels
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	For staining cell culture samples
Deuterium oxide, 99.9 atom% D	Sigma-Aldrich	151882	For NMR spectroscopy
Dialysis tubing, regenerated cellulose membrane, 12-14 kDa molecular weight cut-off	Spectra/Por	132703	For purifying HA-NB and HA-Tet
Diethyl ether	VWR	BDH1121-4LPC	For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
Dimethylformamide	Sigma-Aldrich	277056	For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride (DMTMM)	TCI-Chemicals	D2919	For modifying HA
Dithiothreitol (DTT)	Thermo Scientific	R0861	Non-degradable dithiol linker (substitute for MMP-cleavable peptide)
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, w/ 4500 mg/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture	Sigma-Aldrich	D6429-500ML	For D1 cell culture
EMS Paraformaldehyde, Granular	VWR	100504-162	For making 4% PFA
Ethanol absolute (200 proof)	KOPTEC	89234-850
Fetal bovine serum (FBS)	ATCC	30-2020	For D1 cell culture
Heating Plate	Kopf Instruments	HP-4M
Hemacytometer with coverglass	Daigger Scientific	EF16034F
2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (HEPES)	Sigma-Aldrich	H3375
Sodium hyaluronate, 79 kDa average molecular weight, produced in bacteria Streptococcus zooepidemicus, pharmaceutical grade, microbial contamination <100 CFU/g, bacterial endotoxins <0.050 IU/mg	Contipro	N/A	79 kDa average molecular weight was used for HA-Tet synthesis, but these methods could be adapted for other molecular weights.
IMARIS Essentials software package	Oxford Instruments	N/A	Microscopy image analysis software
Infusion pump, dual syringe	Chemyx	N/A
Kimwipe	Kimberly-Clark	34120
Laboratory stand with support lab clamp	Geyer	212100
Liquid nitrogen	Airgas	NI 180LT22
Lithium Phenyl(2,4,6-trimethylbenzoyl)phosphinate	TCI-Chemicals	L0290
Lyophilizer	Labconco	N/A	Labconco FreeZone 6 plus has been discontinued, but other lab grade console freeze dryers could be used for this protocol.
Methyltetrazine-PEG4-maleimide	Kerafast	FCC210	For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES)	Fisher Scientific	BP300-100	For modifying HA
Micro cover glass, 24 x 60 mm No. 1	VWR	48393-106
Microfluidic device SU8 master wafer	FlowJem		Custom design made either in-house in clean room or outsourced
Mineral oil, heavy	Sigma-Aldrich	330760
MMP-cleavable dithiol crosslinker peptide (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2)	GenScript	N/A
5-Norbornene-2-methylamine	TCI-Chemicals	95-10-3	For HA-NB synthesis
Packing tape	Scotch	3M 1426
Parafilm	Bemis	PM996
PEG(thiol)2	JenKem Technology USA	A4001-1	For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
Penicillin-Streptomycin, 10,000 units/mL	Thermo Fisher Scientific	15140122	For D1 cell culture
Petri dish, polystyrene, disposable, Dia. x H=150 x 15 mm	Corning	351058
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443	For washing HMPs
Phosphate buffered saline (PBS) 1x	Gibco	10010023
RainX water repellent glass treatment	Grainger	465D20	Synthetic hydrophobic treatment solution for microfluidic device treatment
RGD peptide (Ac-RGDSPGERCG-NH2)	GenScript	N/A
Rubber bands	Staples	112417
Sodium chloride	Chem-Impex	30070	For dialysis
Span 80 for synthesis	Sigma-Aldrich	1338-43-8
Sylgard 184 Silicone Elastomer	Electron Microscopy Science	4019862	polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer for making microfluidic devices and tissue culture devices
Syringe filter, Whatman Uniflo, 0.2 μm PES, 13 mm diameter	Cytvia	09-928-066
Tetraview LCD digital microscope	Celestron	44347
Tetrazine-amine HCl salt	Chem-Impex	35098	For HA-Tet synthesis
Triethylamine	Sigma-Aldrich	471283	For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)	Millipore Sigma	51805-45-9
Triton X-100	VWR	97063-864
Trypan blue solution, 0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250061
Trypsin EDTA (0.25%), Phenol red	Fisher Scientific	25-200-056	For lifting adherent cells to seed in MAP gels
Tygon ND-100-80 Non-DEHP Medical Tubing, Needle Gauge=23, Wall Thickness=0.020 in, Internal diameter = 0.020, Outer diameter = 0.060 in	Thomas Scientific	1204G82
UV curing system controller, LX500 LED	OmniCure	010-00369R
UV curing head, LED spot UV	OmniCure	N/A
UV light meter, Traceable	VWR	61161-386
Vacuum dessicator	Bel-Art	08-594-15C
X-Acto Z Series Precision Utility Knife	Elmer's	XZ3601W