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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui descriviamo un metodo specifico del tempo per manipolare efficacemente i percorsi di sviluppo critici nella placenta del topo in vivo. Questo viene eseguito attraverso l'iniezione e l'elettroporazione di plasmidi CRISPR nelle placente di madri gravide il giorno embrionale 12.5.

Abstract

La placenta è un organo essenziale che regola e mantiene lo sviluppo dei mammiferi in utero. La placenta è responsabile del trasferimento di nutrienti e rifiuti tra la madre e il feto e della produzione e consegna di fattori di crescita e ormoni. Le manipolazioni genetiche placentari nei topi sono fondamentali per comprendere il ruolo specifico della placenta nello sviluppo prenatale. I topi transgenici che esprimono Cre specifici per la placenta hanno un'efficacia variabile e altri metodi per la manipolazione genica placentare possono essere alternative utili. Questo articolo descrive una tecnica per alterare direttamente l'espressione genica placentare utilizzando la manipolazione genica CRISPR, che può essere utilizzata per modificare l'espressione di geni mirati. Utilizzando un approccio chirurgico relativamente avanzato, le madri gravide subiscono una laparotomia al giorno embrionale 12.5 (E12.5) e un plasmide CRISPR viene somministrato da una micropipetta di vetro nelle singole placente. Il plasmide viene immediatamente elettroporato dopo ogni iniezione. Dopo il recupero della madre, la placenta e gli embrioni possono continuare lo sviluppo fino alla valutazione in un secondo momento. La valutazione della placenta e della prole dopo l'uso di questa tecnica può determinare il ruolo della funzione placentare specifica del tempo nello sviluppo. Questo tipo di manipolazione consentirà una migliore comprensione di come la genetica e la funzione placentare influenzano la crescita e lo sviluppo fetale in più contesti patologici.

Introduzione

La placenta è un organo essenziale coinvolto nello sviluppo del feto. Il ruolo principale della placenta è quello di fornire fattori essenziali e regolare il trasferimento di nutrienti e rifiuti da e verso il feto. Le placente dei mammiferi sono composte da tessuto fetale e materno, che costituiscono l'interfaccia fetale-materna e, quindi, la genetica della madre e del feto influisce sulla funzione1. Anomalie genetiche o compromissione della funzione della placenta possono alterare drasticamente lo sviluppo fetale. Lavori precedenti hanno dimostrato che la genetica e lo sviluppo placentare sono associati allo sviluppo alterato di specifici sistemi di organi nel feto. In particolare, le anomalie nella placenta sono legate a cambiamenti nel cervello fetale, nel cuore e nel sistema vascolare 2,3,4,5.

Il trasporto di ormoni, fattori di crescita e altre molecole dalla placenta al feto svolge un ruolo importante nello sviluppo fetale6. È stato dimostrato che alterare la produzione placentare di molecole specifiche può alterare lo sviluppo neurologico. L'infiammazione materna può aumentare la produzione di serotonina alterando l'espressione genica metabolica del triptofano (TRP) nella placenta, che successivamente crea un accumulo di serotonina nel cervello fetale7. Altri studi hanno trovato anomalie placentari accanto a difetti cardiaci. Si ritiene che le anomalie nella placenta contribuiscano a difetti cardiaci congeniti, il difetto alla nascita più comune negli esseri umani8. Uno studio recente ha identificato diversi geni che hanno percorsi cellulari simili sia nella placenta che nel cuore. Se interrotti, questi percorsi potrebbero causare difetti in entrambi gli organi9. I difetti nella placenta possono esacerbare i difetti cardiaci congeniti. Il ruolo della genetica e della funzione placentare sullo sviluppo di specifici sistemi di organi fetali è un campo di studio emergente.

I topi hanno placente emocoriali e altre caratteristiche delle placente umane, il che li rende modelli molto utili per lo studio delle malattie umane1. Nonostante l'importanza della placenta, attualmente mancano manipolazioni genetiche mirate in vivo. Inoltre, ci sono attualmente più opzioni disponibili per knockout o knockdown rispetto alla sovraespressione o alle manipolazioni di guadagno di funzione nella placenta10. Esistono diverse linee transgeniche che esprimono il Cre per la manipolazione placentare-specifica, ognuna in diversi lignaggi di trofoblasti in diversi punti temporali. Questi includono Cyp19-Cre, Ada/Tpbpa-Cre, PDGFRα-CreER, e Gcm1-Cre 11,12,13,14. Mentre questi transgeni Cre sono efficienti, potrebbero non essere in grado di manipolare alcuni geni in punti temporali specifici. Un altro metodo comunemente usato per eliminare o sovraesprimere l'espressione genica placentare è l'inserimento di vettori lentivirali nella coltura di blastocisti, che causa una manipolazione genetica specifica del trofoblasto15,16. Questa tecnica consente un robusto cambiamento nell'espressione genica placentare nelle prime fasi dello sviluppo. L'uso dell'interferenza dell'RNA in vivo è stato scarsamente utilizzato nella placenta. L'inserimento di plasmidi shRNA può essere eseguito in modo simile alla tecnica CRIPSR descritta in questo articolo. Questo è stato fatto a E13.5 per ridurre con successo l'espressione di PlGF nella placenta, con impatti sulla vascolarizzazione cerebrale della prole17.

Oltre alle tecniche utilizzate principalmente per knockout o knockdown, l'induzione della sovraespressione viene comunemente eseguita con adenovirus o l'inserimento di una proteina esogena. Le tecniche utilizzate per la sovraespressione hanno tassi variabili di successo e sono state per lo più eseguite più tardi nella gestazione. Per studiare il ruolo del fattore di crescita insulino-simile 1 (IGF-1) nella funzione placentare, è stato eseguito un trasferimento genico placentare adenovirale-mediato per indurre la sovraespressione del gene IGF-1 18,19. Questo è stato eseguito tardi nella gestazione del topo su E18.5 tramite iniezione placentare diretta. Per fornire ulteriori opzioni e aggirare possibili fallimenti di manipolazioni genetiche placentari stabilite, come i fallimenti della combinazione Cre-Lox, la possibile tossicità degli adenovirus e gli effetti off-target dello shRNA, è possibile utilizzare la manipolazione diretta CRISPR in vivo della placenta20,21,22. Questo modello è stato sviluppato per ovviare alla mancanza di modelli di sovraespressione e per creare un modello con flessibilità.

Questa tecnica si basa sul lavoro di Lecuyer et al., in cui i plasmidi shRNA e CRISPR sono stati mirati direttamente in vivo alle placente di topo per alterare l'espressione di PlGF 17. Questa tecnica può essere utilizzata per alterare direttamente l'espressione genica placentare utilizzando la manipolazione CRISPR in più punti temporali; per questo lavoro è stato selezionato E12.5. La placenta è maturata a questo punto ed è abbastanza grande da manipolare, consentendo l'inserimento di uno specifico plasmide CRISPR su E12.5, che può avere un impatto significativo sullo sviluppo fetale da metà a fine gravidanza23,24. A differenza degli approcci transgenici, ma simile alle induzioni virali o all'interferenza dell'RNA, questa tecnica consente la sovraespressione o il knockout in particolari punti temporali utilizzando un approccio chirurgico relativamente avanzato, evitando così possibili compromissione della placentazione o letalità embrionale da cambiamenti precedenti. Poiché solo poche placente ricevono il plasmide sperimentale o di controllo all'interno di una cucciolata, l'approccio consente due tipi di controlli interni. Questi controlli sono quelli iniettati ed elettroporati con il plasmide di controllo appropriato e quelli che non ricevono alcuna manipolazione diretta. Questa tecnica è stata ottimizzata per creare una sovraespressione del gene IGF-1 nella placenta del topo tramite un plasmide CRISPR mediatore di attivazione sinergica (SAM). È stato scelto il gene IGF-1, poiché IGF-1 è un ormone della crescita essenziale consegnato al feto che viene prodotto principalmente nella placenta prima della nascita25,26. Questa nuova tecnica CRISPR mirata alla placenta consentirà la manipolazione diretta per aiutare a definire la connessione tra la funzione placentare e lo sviluppo fetale.

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Protocollo

Tutte le procedure sono state eseguite in conformità e conformità con le normative federali e la politica dell'Università dell'Iowa e sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali.

1. Animali e allevamento

  1. Tenere gli animali in un ciclo di luce diurna di 12 ore con cibo e acqua ad libitum.
  2. Utilizzare topi femmina CD-1 di età compresa tra 8 e 15 settimane. Utilizzare la presenza di un tappo copulatore per identificare E0.5.
  3. Su E0.5, ospitare singolarmente le madri gravide.

2. Taratura della micropipetta

NOTA: la calibrazione della micropipetta deve essere eseguita prima dell'intervento chirurgico, quando possibile.

  1. Prima di realizzare e calibrare la micropipetta, diluire tutti i plasmidi alla concentrazione raccomandata (0,1 μg/μL) in acqua priva di DNasi. Mescolare il plasmide con colorante Fast Green opportunamente diluito (1 μg/μL in PBS) (concentrazione plasmidica finale: 0,06 μg/μL).
  2. Tirare micropipette utilizzando capillari di vetro da 10 cm con un diametro esterno di 1,5 mm e un diametro interno di 0,86 mm con un estrattore di micropipette.
  3. Rompere con cura la punta di una micropipetta (2-3 mm) con una pinza sterile.
  4. Caricare la micropipetta in una punta microcapillare collegata a un microiniettore. Assicurarsi che il microiniettore sia collegato alla macchina di microiniezione e che vi siano livelli sufficienti di azoto per calibrare la micropipetta.
  5. Una volta che la micropipetta è collegata al microiniettore, caricarla con la soluzione di colorante Fast Green per eseguire la calibrazione (1 μg/μL in PBS). Calibrare la micropipetta per iniettare un volume di circa 3,5 μL. Svuotare ("trasparente") la micropipetta in preparazione per caricare le soluzioni plasmidiche come di seguito.
    NOTA: Ogni micropipetta sarà leggermente diversa. Per evitare di danneggiare la placenta durante l'iniezione, il tempo di iniezione deve essere impostato tra 0,5-1,5 s. La pressione deve essere impostata tra 1-8,5 psi. Calibrare ogni micropipetta separatamente; Se la micropipetta non può essere calibrata entro questi parametri, non deve essere utilizzata.

3. Chirurgia (Figura 1A)

NOTA: Per preparare, pulire le superfici sia delle aree di preparazione che chirurgiche con etanolo al 70%. Posizionare un sottopad assorbente nell'area di preparazione. Nell'area chirurgica, posizionare una piastra elettrica verso il basso, quindi posizionare un sottopad assorbente sopra di esso. Sterilizzare tutti gli strumenti prima dell'intervento chirurgico. Il tempo in cui la diga è sotto anestesia dovrebbe essere inferiore a 1 ora.

  1. Anestetizzazione
    1. Somministrare 5 mg/kg di FANS (meloxicam) o un altro analgesico approvato alla madre gravida da 30 minuti a 1 ora prima dell'intervento chirurgico.
    2. Posizionare la madre gravida in una camera di induzione collegata a un vaporizzatore di isoflurano.
    3. Impostare il vaporizzatore al 4% di isoflurano e 3,5 L/min di ossigeno.
    4. Una volta che l'anestetizzazione è stata confermata dalla mancanza di risposta a un pizzico del piede e da una frequenza respiratoria ridotta, rimuovere la diga dalla camera di induzione all'area di preparazione.
  2. Preparazione chirurgica
    1. Nell'area di preparazione, posizionare la diga supina con un cono nasale.
    2. Ridurre il vaporizzatore al 2% di isoflurano e 3,5 L/min di ossigeno mentre la diga è nel cono del naso.
    3. Rasare accuratamente l'addome della diga e rimuovere la pelliccia in eccesso. Alternare il rivestimento dell'addome rasato con soluzione di povidone e etanolo al 70% tre volte utilizzando applicatori sterili con punta di cotone. Applicare la mano finale di soluzione povidone. Per prevenire l'essiccazione corneale, posizionare un gel lacrimale artificiale su entrambi gli occhi della diga (Figura 2A, B).
    4. Dopo la preparazione, spostare la diga con il cono del naso nell'area chirurgica designata.
  3. Laparotomia uterina
    NOTA: Utilizzare guanti sterili durante tutta la procedura chirurgica. Cambiare i guanti se viene contattata una superficie non sterile.
    1. Nell'area chirurgica, posizionare la diga supina e fissare il cono del naso in posizione con del nastro adesivo. Impostare il termoforo sotto il tampone assorbente a 45 °C.
    2. Usando una pinza e le forbici, praticare un'incisione approssimativa della linea mediana di 2 cm attraverso la pelle. Utilizzare una pinza per tendere la pelle e fare un'incisione verticale nella pelle. Dopo questo, fai un'altra incisione di dimensioni simili attraverso il peritoneo per esporre le corna uterine. Usando una pinza, tenda il peritoneo mentre fai l'incisione verticale (Figura 2C, D).
      NOTA: La mancata corretta tenda durante l'incisione del peritoneo può portare a un'incisione fatale dell'intestino.
    3. Massaggiare delicatamente le corna uterine attraverso l'incisione premendo sui lati dell'addome. Fallo guidando attentamente l'utero senza attrezzi, usando solo le dita per evitare lesioni accidentali. Posizionare l'utero esposto sopra un drappo chirurgico sterile che copra l'addome della madre e mantenerlo umido durante l'intervento chirurgico con gocce di soluzione salina sterile, che può essere riscaldata a 30 °C prima dell'uso secondo necessità (Figura 2E, F).
      NOTA: Le corna uterine possono essere identificate come descritto in Wang et al.27.
    4. Una volta che l'utero è esposto, selezionare tre paia di placente per la manipolazione.
      NOTA: Le placente possono essere identificate come descritto da Elmore et al.24. Per massimizzare la sopravvivenza degli embrioni, non devono essere trattate più di 6 placente. Se sono presenti meno di 12 embrioni, non devono essere iniettate più di 4 placente. Selezionare due placente adiacenti in modo che una riceva un'iniezione di controllo e l'altra riceva il plasmide sperimentale. L'uso di due placente adiacenti consente un migliore confronto delle placente in posizioni simili nell'utero e consente anche un aumento del tasso di sopravvivenza. Le coppie placentari selezionate sono scelte casualmente e distanziate su entrambe le corna uterine (Figura 1B).
    5. Registrare la posizione delle manipolazioni placentari e l'organizzazione degli embrioni all'interno delle corna uterine in modo che gli embrioni e le placente possano essere identificati durante la raccolta, poiché una madre trasporterà sia placente di controllo che placente / embrioni trattati sperimentalmente.
  4. Iniezione placentare ed elettroporazione del plasmide di controllo
    NOTA: Per mantenere una tecnica asettica, sterilizzare le palette di elettroporazione e il microiniettore con uno sterilizzante freddo prima dell'uso. Cambiare i guanti se viene contattata una superficie non sterile.
    1. Utilizzando la micropipetta calibrata, caricare una quantità sufficiente del plasmide di controllo appropriato per tre iniezioni. Eseguire tutte le iniezioni ad una profondità di ~ 0,5 mm lateralmente nella placenta tra la decidua (bianco) e la zona giunzionale (rosso scuro) (Figura 3A-F).
    2. Eseguire iniezioni nelle tre placente di controllo.
      NOTA: Eseguire tutte le iniezioni di plasmidi di controllo prima delle iniezioni sperimentali per evitare la contaminazione incrociata dei plasmidi con la micropipetta. Ciò consentirà di utilizzare la stessa micropipetta, poiché la sostituzione delle micropipette e il tempo di calibrazione aumentano drasticamente il tempo di intervento chirurgico e riducono la sopravvivenza della madre.
    3. Eseguire l'elettroporazione delle placente iniettate con plasmide di controllo entro 2 minuti dall'iniezione.
    4. Per l'elettroporazione, utilizzare una coppia di pale da 3 mm collegate a una macchina per elettroporazione. Per garantire l'efficienza di incorporazione di CRISPR e la vitalità degli embrioni, utilizzare le seguenti impostazioni di elettroporazione: 2 impulsi, 30 V, impulso 30 ms, impulso off 970 ms, unipolare.
    5. Dopo l'iniezione ma immediatamente prima dell'elettroporazione, rivestire i punti di contatto con soluzione salina sterile, applicando la soluzione salina precisamente ai tre siti sulla parete uterina e le pale con un contagocce o una siringa.
    6. Premere delicatamente le palette di elettroporazione sui lati laterali della placenta. Posizionare la paletta dell'anodo sul sito di iniezione e sul catodo direttamente di fronte (Figura 4A-C).
    7. Premere l'impulso sulla macchina per elettroporazione e attendere il completamento dei due impulsi prima di rimuovere le palette di elettroporazione.
      NOTA: Una piccola quantità di schiuma bianca è spesso vista tra le pagaie e la placenta durante gli impulsi. Se ciò non si verifica, controllare la tensione dalle pale con un voltmetro prima di un ulteriore utilizzo. Se la lettura sul voltmetro non corrisponde all'impostazione della tensione di elettroporazione, le palette non funzionano.
  5. Iniezione placentare ed elettroporazione del plasmide sperimentale
    1. Seguire le stesse istruzioni del punto 3.4.1. al punto 3.4.2. utilizzando il plasmide sperimentale invece del plasmide di controllo.
    2. Eseguire l'elettroporazione di tutte e tre le placente iniettate sperimentali entro 2 minuti dall'iniezione. Questo deve essere eseguito nello stesso modo di quelli iniettati con i plasmidi di controllo. Seguire il passaggio 3.4.4. al punto 3.4.7.
  6. Completamento dell'intervento chirurgico
    1. Una volta completata la manipolazione placentare, massaggiare delicatamente le corna uterine all'interno della cavità addominale usando solo le dita (Figura 5A).
    2. In primo luogo, eseguire suture singole a doppio nodo sullo strato di peritoneo utilizzando suture solubili rivestite e intrecciate lunghe 45 cm con una lega di aghi 3/8c da 13 mm. Distanziare le suture di 2-3 mm l'una dall'altra (Figura 5B).
    3. Dopo aver suturato lo strato di peritoneo, suturare la pelle con punti di sutura solubili. Triplo nodo le singole suture a 2-3 mm di distanza per garantire che la diga non possa annullare la sutura (Figura 5C).
    4. Una volta completata la sutura, impostare l'isoflurano all'1% e l'ossigeno a 3,5 L/min e applicare l'adesivo tissutale alle suture sulla pelle (Figura 5D).
      NOTA: L'adesivo tissutale è facoltativo ma consigliato per evitare la riapertura dell'incisione a causa della masticazione della diga.
    5. Quando l'adesivo si è asciugato, spegnere il vaporizzatore e rimuovere la diga dall'area chirurgica. Posiziona la diga in una gabbia di supporto sul dorso.

4. Assistenza e monitoraggio post-operatorio

  1. Lasciare che la madre gravida si riprenda in una gabbia pulita sotto supervisione per un minimo di 30 minuti per garantire che non ci siano complicazioni immediate dell'intervento. Osserva fino a quando non è completamente deambulante e può capovolgersi sui suoi piedi senza assistenza. Ospitare singolarmente la diga post-operatoria.
  2. Seguire le cure post-operatorie istituzionali e il monitoraggio fino al prelievo embrionale. Registrare il peso della diga e monitorare quotidianamente le suture e il sito di incisione.

5. E14.5 raccolta placentare

  1. Su E14.5, anestetizzare profondamente la diga con un cocktail ketamina / xilazina (1 mg / ml di ketamina e 0,1 mg / ml di xilazina), quindi dislocare cervicamente la diga.
  2. Fai un'incisione a forma di V nell'addome della diga con le forbici e rimuovi l'utero. Posizionare immediatamente su una capsula di Petri di 5 cm su ghiaccio. Usando una pinza, rimuovere con cura l'embrione e la placenta corrispondente dall'utero.
    NOTA: Tenere un registro della posizione dell'embrione e della placenta corrispondente nelle corna uterine per determinare quale ha ricevuto la manipolazione diretta durante l'intervento chirurgico.
  3. Registra i pesi placentari. Usando pinze e rasoi privi di RNAsi, tagliare la placenta a metà lungo la linea mediana. Mettere una metà in PFA al 4% a 4 °C. Tagliare nuovamente la metà rimanente a metà e conservare i restanti due quarti a -80 °C in due provette, una con reagente di stoccaggio dell'RNA.
    NOTA: Gli embrioni e gli altri tessuti materni possono essere conservati dalla raccolta a -80 °C per un uso futuro.

6. Analisi dell'espressione genica placentare

  1. Utilizzare il quarto della placenta immagazzinato a -80 °C nel reagente di stoccaggio dell'RNA.
  2. Elaborare le placente per la qPCR come descritto in Elser et al. utilizzando il metodo Trizol per l'isolamento dell'RNA, uno spettrofotometro per la concentrazione di RNA, un kit di sintesi del cDNA e qPCR con SYBR Green Master Mix28. Al posto del kit Turbo DNAfree DNAse a cui si fa riferimento in Elser et al., utilizzare un kit RNAcleanup dopo l'isolamento dell'RNA Trizol per garantire che i campioni non contengano contaminanti28.
    NOTA: leggere la scheda di sicurezza dei materiali (MSDS) per Trizol e utilizzarla in una cappa aspirante chimica.
  3. Valutare l'inserimento plasmidico del plasmide di controllo con primer GFP e del plasmide sperimentale con primer BLAST (primer elencati nella Tabella Supplementare 1). Utilizzare il valore CT per determinare la presenza del plasmide.
    NOTA: i valori CT superiori a 35 sono falsi positivi e solo quelli inferiori a 35 devono essere considerati un indicatore positivo che il plasmide è stato inserito con successo.
  4. Valutare l'espressione placentare di IGF-1 normalizzata al gene housekeeping 18s (primer elencati nella Tabella supplementare 1). Utilizzare il metodo ddCT per calcolare il cambiamento di piega e quindi calcolare il cambiamento di piega normalizzato dei campioni sperimentali al cambiamento medio di piega dei campioni di controllo.

7. Analisi del livello proteico placentare

  1. Utilizzare il quarto della placenta che è stato conservato a -80 °C. Omogeneizzare il tessuto in una soluzione tampone composta da 11,5 mM Tris HCl, 5 mM MgCl 2 e 10 mM di inibitore della proteasi in diH2O con un pH finale di 7,4. Utilizzare un omogeneizzatore portatile e un pestello per rompere il tessuto.
    Nota : il campione non deve superare il 10% del volume del buffer.
  2. Diluire i campioni omogeneizzati nel tampone a 1:12, in modo che rientrino nell'intervallo rilevabile di un kit di analisi dell'acido bicinconinico (BCA). Eseguire il test BCA secondo le istruzioni del produttore e quantificare la proteina totale utilizzando un lettore di piastre.
  3. Dopo aver eseguito il test BCA, normalizzare tutti i campioni alla stessa concentrazione proteica totale di 2 mg / ml per l'ELISA IGF-1, come fatto in Gumusoglu et al.29.
  4. Eseguire l'ELISA IGF-1 secondo le istruzioni del produttore e quantificare i livelli di proteina IGF-1 con un lettore di piastre utilizzando una curva di concentrazione standard.

8. Verifica CRIPSR spaziale mediante etichettatura ibridazione fluorescente in situ

  1. Dopo che le metà placentari sono state opportunamente fissate in PFA al 4% a 4 °C per 1-3 giorni, spostarle in saccarosio al 20% a 4 °C prima di congelarle nel composto a temperatura di taglio ottimale (OCT).
  2. Sezionare in serie le metà della placenta incorporata nell'OCT in un criostato a -20 °C in sezioni da 10 μm e posizionarle su vetrini da etichettare. Sezione la placenta si dimezza in modo che tutte e tre le sottoregioni siano visibili. Conservare i vetrini a -80 °C fino all'uso per l'ibridazione in situ .
  3. Eseguire l'etichettatura di ibridazione in situ a fluorescenza (FISH) seguendo i protocolli del produttore. Ibridare un vetrino con una sonda dCas9-3xNLS-VP64 e un secondo vetrino "sorella" della stessa placenta con una sonda Prl8a8.
    NOTA: La sonda dCas9-3xNLS-VP64 rileva la presenza del plasmide di sovraespressione. La sonda Prl8a8 evidenzia gli spongiotrofoblasti della zona giunzionale, che consente di identificare le sottoregioni della placenta. Queste due sonde sono etichettate su vetrini "fratelli" separati per evitare interferenze di fluorescenza multicanale con l'autofluorescenza verde nella placenta.
  4. Etichettare entrambe le sonde con il colorante di rilevamento (Opal 620). Dopo aver completato il protocollo del produttore per FISH, applicare il supporto di montaggio DAPI e posizionare un coprivetrino sulla slitta. Sigillare la copertina con smalto trasparente.
  5. Immagina i vetrini su un microscopio a fluorescenza composto verticale ed elaborali utilizzando un software di elaborazione delle immagini appropriato. Qui è stato utilizzato il software CellSens.

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Risultati

Risultati generali della procedura (Figura 6)
Nello studio, c'erano tre gruppi manipolati. Questi includevano placente iniettate con un plasmide di controllo generale CRISPR Cas9 (Cas9 Control), un plasmide CRISPR di controllo dell'attivazione (Act Control) o un plasmide di attivazione IGF-1 SAM (Igf1-OE). Il controllo Cas9 è più adatto per i plasmidi knockout e il controllo di attivazione è più adatto per i plasmidi di sovraespressione/attiv...

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Discussione

La placenta è un regolatore primario della crescita fetale e, come notato in precedenza, i cambiamenti nell'espressione o nella funzione genica placentare possono avere un impatto significativo sullo sviluppo fetale6. Il protocollo qui descritto può essere utilizzato per eseguire una manipolazione CRISPR mirata in vivo della placenta del topo utilizzando un approccio chirurgico relativamente avanzato. Questa tecnica consente una resa significativa di embrioni vitali e delle loro placent...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Gli autori riconoscono le seguenti fonti di finanziamento: R01 MH122435, NIH T32GM008629 e NIH T32GM145441. Gli autori ringraziano i laboratori del Dr. Val Sheffield e del Dr. Calvin Carter presso l'Università dell'Iowa per l'uso della loro sala operatoria e delle attrezzature, così come il Dr. Eric Van Otterloo, il Dr. Nandakumar Narayanan, e il Dr. Matthew Weber per la loro assistenza con la microscopia. Gli autori ringraziano anche la dottoressa Sara Maurer, Maya Evans e Sreelekha Kundu per la loro assistenza con gli interventi chirurgici pilota.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 ml TubesUSA Scientific Inc1615-5500
4% Paraformeldhyde (PFA) in PBSThermo Fisher ScientificJ61899.AP
96 Well plateCornings3598For BCA kit
Absorbent UnderpadsFisher Scientific14-206-62
Activation Control PlasmidSanta Cruz Biotechnologysc-437275Dnase-free water provided for dilution
AMV Reverse TranscriptaseNew England BiolabsM0277LUse for cDNA synthesis
Anesthetic Gas VaporizorVetamacVAD-601TTVAD-compact vaporizer
Artifical Tear GelAkornNDC 59399-162-35
BCA Protein Assay KitThermo Fisher Scientific23227Protein quantification
BiovortexerBellco Glass, Inc.198050000Hand-held tissue homogenizer
CellSens SoftwareOlympusV4.1.1Image processing to FISH images.
Centrifuge 5810EppendorfEP022628168Plate centrifuge
ChloroformThermo Fisher ScientificJ67241-APRNA isolation
Cotton Tipped ApplicatorsProAdvantage77100Sterilize before use
CRISPR/Cas9 Control PlasmidSanta Cruz Biotechnologysc-418922Dnase-free water provided for dilution
CryoStatLeicaCM1950
Dissection MicroscopeLeicaM125 CUsed for post-necroscopy imaging
Dissolvable SuturesMed Vet InternationalJ385H
Distilled WaterGibco15230162
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)Thermo fisher Scientific14190144(-) Calcium; (-) Magnesium
ECM 830 Electro Electroporator (Electroporation Machine)BTX Harvard Apparatus45-0662Generator only
Electric RazorWahlCL9990Kent Scientific
Electroporation paddles/TweezertrodesBTX Harvard Apparatus45-04873 mm diameter paddles; wires included
Embedding Cassette: 250 PKGrainger21RK94Placenta embedding cassettes
EthanolThermo Fisher Scientific268280010
F-Air CanistersPenn Veterinary Supply IncBIC80120Excess isoflurane filter
Fast Green Dye FCFSigmaF7252-5GDissolve to 1 μg/ml and filter; protect from light
Filter-based microplate photometer (plate reader)Fisher Scientific14377576Can be used for BCA and ELISA
ForcepsVWR82027-386Fine tips, straight, serrated
Formalin solution, neutral buffered, 10%Sigma AldrichHT501128
Glass Capillaries - Borosilicate Glass (Micropipette)Sutter InstrumentB150-86-10O.D.: 1.5 mm, I.D.: 0.86 mm, 10 cm length
Halt Protease and Phosphotase inhibitor cocktail (100x)Thermo Scientific1861281Protein homogenization buffer
Heating PadThermotechS766DDigitial Moist Heating Pad
HemostatsVWR10806-188Fully surrated jaw; curved
Hot Water BathFisher Scientific20253Isotemp 205
Igf-1 SAM Plasmid (m1)Santa Cruz Biotechnologysc-421056-ACTDnase-free water provided for dilution
Induction ChamberVetamac941443No specific liter size required
IsofluranePiramal Pharma LimitedNDC 66794-013-25
Isoproponal/2-ProponalFisher ScientificA451-4RNA isolation
Ketamine HCl 100mg/mlAkornNDC 59399-114-10
MgCl2/Magneisum ChlorideSigma Aldrich63069-100ML1M. Protein homogenization buffer
MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate with BarcodeFisher Scientific4309849Barcoded plates not required
Microcapillary TipEppendorf5196082001Attached to BTX Microinjector
MicroinjectorBTX Harvard Apparatus45-0766Stainless Steel Pipette Holder, 130 mm Length, for 1 to 1.5 mm Pipettes
Microject 1000A (Injection Machine)BTX Harvard Apparatus45-0751MicroJect 1000A Plus System
Micropipette Puller Model P-97Sutter InstrumentP-97Flaming/Brown type micropipette puller
Microplate Mixer (Plate Shaker)scilogex822000049999
Mouse/Rat IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISA KitR & D SystemsMG100
NeedlesBD - Becton, Dickson, and Company30510630 Gx 1/2 (0.3 mm x 13 mm)
Nitrogen TankLinde7727-37-9Any innert gas
Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug (NSAID)Norbrook Laboratories LimitedNDC 55529-040-10Analesgic such as Meloxicam
Nose ConeVetamac9216099-14 mm
Opal 620 detection dyeAkoya BiosciencesSKU FP1495001KTUsed for FISH
Optimal Cutting Temperature (O.C.T) CompoundSakura4583
Oxygen TankLinde7782 - 44 - 7Medical grade oxygen
PestlesUSA Scientific Inc14155390
Povidone-Iodine Solution, 5%Avrio Health L.P.NDC 67618-155-16
Power SYBR™ Green PCR Master MixThermo Fisher Scientific4367659Use for qPCR
Random Hexamers (Random Primers)New England BiolabsS1330SUse for cDNA synthesis
Razor BladeGrainger26X080
RNA Cleanup Kit & ConcentratorZymo ResearchR1013
RNALaterThermo Fisher ScientificAM7021
RNAscope kit v.2.5Advanced Cells Diagnostics323100Contains all reagents required for fluorescent in situ hybridization. Probes sold separately.
RNAscope™ Probe- Mm-Prl8a8-C2Advanced Cells Diagnostics 528641-C2
RNAscope™ Probe- Vector-dCas9-3xNLS-VP64Advanced Cells Diagnostics527421
Roto-Therm MiniBenchmarkR2020Dry oven for in situ hybridization
ScissorsVWR82027-578Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4¹/?
Sodium Chloride (Saline)HospraNDC 0409-4888-03Sterile,  0.9%
Sodium Citrate, Trisodium Salt, Dihydrate, [Citric Acid, Trisodium Dihydrate]Research Product International03-04-6132
Sodium Hydroxide 1N Concentrate, Fisher ChemicalFisher ScientificSS277Protein homogenization buffer
SteamerBellaB00DPX8UBA
Sterile Surgical DrapeBusse696Sterilize before use
Superfrost Plus Microscope SlidesFisher Scientific12-550-15
Surgipath Cover Glass 24x60Leica3800160
SyringesBD - Becton, Dickson, and Company309659BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use, 1 mL
Thermo Scientific™ Invitrogen™ Nanodrop™ One Spectrophotometer with WiFi and Qubit™ 4 FluorometerFisher Scientific13-400-525This configuration comes with Qubit 4 fluorometer.  Qubit quantification not required.
Tissue Adhesive3M1469SBVetBond
Tris HClThermo Fisher Scientific155680251M. Protein homogenization buffer
TRIzol™ ReagentThermo Fisher Scientific15596018RNA isolation
TSA Buffer PackAdvanced Cells Diagnostics322810Used to dilute Opal 620 detection dye
Universal F-CircuitVetamac40200Attached to vaporizer and vaporizer accessories
Upright Compound Fluorescence MicroscopeOlympusBX61VSUsed for FISH imaging
Vectorshield with DAPIVector LaboratoriesH-1200Coverslip mounting media
ViiA™ 7 Real-Time PCR System with 384-Well BlockThermo Fisher Scientific4453536This is for SYBR 384-well block detection.  TaqMan and/or smaller blocks available
Wet n Wild Nail Polish Wild Shine, Clear Nail Protector, Nail ColorAmazonC450B
Xylazine 20mg/mlAnased343730_RX

Riferimenti

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