Isolamento non acquoso e arricchimento di tricomi ghiandolari e sessili da Cannabis sativa

Riepilogo

Viene presentato un protocollo per l'isolamento e l'arricchimento conveniente e ad alto rendimento dei tricomi ghiandolari e sessili da Cannabis sativa. Il protocollo si basa su un'estrazione secca e non tampone di tricomi utilizzando solo azoto liquido, ghiaccio secco e setacci di nylon ed è adatto per l'estrazione dell'RNA e l'analisi trascrittomica.

Abstract

Questo articolo presenta un protocollo per l'isolamento e l'arricchimento conveniente e ad alto rendimento dei tricomi ghiandolari capitati e sessili da Cannabis sativa. Le vie biosintetiche per il metabolismo dei cannabinoidi e dei terpeni volatili sono localizzate principalmente nei tricomi della cannabis e i tricomi isolati sono utili per l'analisi del trascrittoma. I protocolli esistenti per isolare i tricomi ghiandolari per la caratterizzazione trascrittomica sono scomodi e forniscono teste di tricoma compromesse e una quantità relativamente bassa di tricomi isolati. Inoltre, si basano su costosi apparati e mezzi di isolamento contenenti inibitori proteici per evitare la degradazione dell'RNA. Il presente protocollo suggerisce di combinare tre singole modifiche per ottenere una grande quantità di dimostri ghiandolari isolati e tricomi sessili rispettivamente dalle infiorescenze femminili mature e dalle foglie a ventaglio di C. sativa. La prima modifica prevede la sostituzione dell'azoto liquido per il mezzo di isolamento convenzionale per facilitare il passaggio dei tricomi attraverso i microsetacci. La seconda modifica prevede l'uso di ghiaccio secco per staccare i tricomi dalla fonte vegetale. La terza modifica prevede il passaggio consecutivo del materiale vegetale attraverso cinque micro-setacci di dimensioni dei pori decrescenti. L'imaging microscopico ha dimostrato l'efficacia della tecnica di isolamento per entrambi i tipi di tricomi. Inoltre, la qualità dell'RNA estratto dai tricomi isolati era appropriata per l'analisi trascrittomica a valle.

Introduzione

I tricomi ghiandolari sono strutture simili a capelli presenti nelle piante che contengono molti metaboliti secondari¹ e rappresentano una preziosa banca di nuovi geni ed enzimi biosintetici². Nella Cannabis, la biosintesi degli importanti metaboliti secondari, cannabinoidi³ e terpeni⁴, è localizzata nei tricomi. Considerando il ruolo dei tricomi nel determinare la qualità della cannabis sia per usi medicinali che ricreativi, lo studio dell'espressione genica dei tricomi è interessante. Per caratterizzare l'espressione di geni specifici del tricomi, i tricomi di interesse devono prima essere isolati. I protocolli di isolamento dei tricomi sono stati descritti per la prima volta già nel 1992⁵ e i loro ultimi sviluppi sono stati recentemente rivisti². In generale, i protocolli per l'estrazione dei tricomi ghiandolari per la caratterizzazione trascrittomica possono essere suddivisi in due fasi sequenziali distinte. Il primo passo prevede un'accurata separazione fisica dei tricomi dal tessuto vegetale. Questo passaggio può essere eseguito utilizzando ghiaccio secco⁵, perle di vetro con un apparato commerciale^6,7, macinando il materiale vegetale contro un setaccio a maglie⁸ o vorticando il tessuto vegetale in un tampone di isolamento⁹. La seconda fase prevede una separazione più raffinata dei tricomi di interesse dal residuo vegetale microscopico e / o da altri tipi di tricomi. Questo passaggio può essere eseguito utilizzando centrifugazione a gradiente di densità ^8,10 o setacci di varie dimensioni ^7,9. A causa dell'estrema sensibilità dell'RNA nei tessuti trasformati agli agenti degradanti, queste due fasi sequenziali sono solitamente condotte nel mezzo di isolamento ghiacciato, spesso in presenza di inibitori proteici⁴.

I protocolli convenzionali di isolamento dei tricomi richiedono, oltre alle temperature gelide, grandi quantità di mezzo di isolamento per garantire una procedura di estrazione efficiente. La combinazione di questi componenti si traduce in un processo di isolamento arduo e dispendioso in termini di tempo che ostacola l'elevata produttività. Presentare un protocollo alternativo di isolamento dei tricomi semplice e intuitivo è, quindi, probabile che sia utile per vari aspetti associati alla caratterizzazione dei tricomi. Il presente articolo mira a offrire un protocollo alternativo per isolare i tricomi ghiandolari peduncolari e sessili dalla Cannabis sativa combinando e integrando diversi elementi dei protocolli convenzionali. Questi elementi includono il ghiaccio secco⁵, il passaggio dei tricomi attraverso diversi micro-setacci con dimensioni dei pori decrescenti ^7,9 e la sostituzione dell'azoto liquido (LN) per il mezzo di isolamento⁸.

La novità dell'attuale protocollo di isolamento dei tricomi, rispetto ai protocolli convenzionali, si presenta in diversi modi. Questo protocollo è conveniente, in quanto non richiede componenti pericolosi. La procedura può essere condotta in laboratorio con precauzioni minime e facilita l'elevata produttività. La sostituzione di LN per il mezzo di isolamento liquido standard garantisce l'integrità dei tricomi durante tutto il processo di isolamento, consentendo una successiva analisi trascrittomica. Dopo la sublimazione del LN e del ghiaccio secco, i tricomi isolati vengono lasciati liberi da residui nocivi. Inoltre, la propensione di LN a sublimare a temperatura ambiente ne consente l'uso generoso in tutto il protocollo. Al contrario, l'utilizzo di grandi volumi di mezzi di isolamento convenzionali genera difficoltà pratiche nella sua gestione. Infine, il protocollo riduce la separazione della cellula del disco dalla restante fragile struttura della testa del tricoma ghiandolare, consentendo la conservazione del contenuto dello spazio di testa.

Questo protocollo è presentato in modo dettagliato passo-passo progettato per aiutare la pratica tecnica di isolamento dei tricomi capitati ghiandolari di C. sativa. Il protocollo fornisce un flusso di lavoro gestibile che si traduce in tricomi isolati con un'alta concentrazione e purezza che sono appropriati per l'analisi molecolare a valle.

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Protocollo

NOTA: Il materiale vegetale utilizzato in questo studio consisteva in quattro ceppi di C. sativa ARO-Volcani (CS-11, CS-12, CS-13 e CS-14) che sono stati coltivati nel Volcani Center, Israele, come descritto altrove¹¹. I tricomi ghiandolari capitati sono stati isolati dalle infiorescenze a fioritura matura e i tricomi ghiandolari capitati sono stati isolati da grandi foglie a ventaglio di piante madri mature non fiorite. Tutto il materiale vegetale è stato raccolto di fresco e immediatamente conservato a -80 °C.

ATTENZIONE: ghiaccio secco e LN sono utilizzati in tutto il protocollo. Queste sostanze sono estremamente pericolose. I tricomi isolati possono contenere particelle di ghiaccio secco che possono creare una pericolosa pressione di gas quando vengono inserite in tubi sigillati; Pertanto, tutti i tappi devono essere perforati con ago. Si consiglia vivamente l'uso di occhiali protettivi, abbigliamento da laboratorio appropriato e guanti per la manipolazione a temperature estremamente basse.

1. Impostazione per la separazione iniziale dei tricomi dal materiale vegetale

1. Schiacciare un blocco di ghiaccio secco in piccoli fiocchi fini usando un martello e un oggetto piatto duro in un contenitore di plastica da 5 litri.
2. Setacciare i fiocchi di ghiaccio secco fine (più piccoli di 5 mm) dal ghiaccio secco non frantumato con un colino grande (attraverso pori più piccoli di 5 mm) in un altro contenitore di plastica da 5 L. Versare circa 200 cm³ (200 mL) dei fiocchi di ghiaccio secco in un becher di vetro verticale da 1 L.
3. Aggiungere fino a 10 g di infiorescenze congelate di C. sativa (d'ora in poi denominate materiale vegetale) sul primo strato di ghiaccio secco tritato e coprire con un ulteriore strato di 200 cm³ di ghiaccio secco finemente tritato.
4. Coprire l'apertura del becher di vetro da 1 litro con due o tre strati di zanzariera da 1 mm e fissarla ai lati esterni della tazza di vetro con elastici (Figura 1).
5. Versare LN in un grande contenitore di acciaio inossidabile a fondo tondo (vedi Tabella dei materiali), dove verranno raccolti i tricomi isolati.
6. Inserire una maglia da 350 μm in un sifatto/colino setaccio per coprire la rete del setaccio della farina dal basso (Figura 2). Se è disponibile un setaccio per farina con un anello di plastica staccabile, inserire la maglia da 350 μm in modo che sia fissata sotto la rete del setaccio della farina. In caso contrario, fissare la maglia da 350 μm alla circonferenza del setaccio di farina con elastici.
7. Posizionare il setaccio della farina sopra il grande contenitore di acciaio inossidabile a fondo tondo riempito con LN (Figura 3). Assicurarsi che la larghezza del contenitore superi quella del setaccio della farina per ridurre al minimo la perdita della massa setacciata all'esterno del contenitore in acciaio inossidabile a fondo tondo.

2. Separazione dei tricomi dal materiale vegetale

1. Agitare il bicchiere da 1 litro con l'apertura rivolta verso il basso verso il setaccio della farina come se si utilizzasse una grande saliera (Figura 4).
2. Mettere da parte il becher di vetro da 1 L ogni 2-3 minuti per consentire la setacciatura del ghiaccio secco tritato e del materiale vegetale accumulato sul setaccio della farina.
3. Setacciare orizzontalmente il setaccio della farina per facilitare il passaggio del materiale vegetale nel LN nel contenitore in acciaio inossidabile a fondo tondo sottostante.
4. Aggiungere LN al contenitore in acciaio inossidabile e ghiaccio secco frantumato al becher di vetro da 1 L quando i loro livelli si esauriscono. Reintegrare il materiale vegetale usato nel becher di vetro con altri 10 g di materiale vegetale fresco quando il materiale vegetale sul setaccio della farina è esaurito. Il rifornimento di solito non deve essere ripetuto più di due volte.
5. Ripetere i passaggi 2.1-2.4 fino a quando una quantità sufficiente di tricomi arricchiti è stata raccolta nel contenitore di acciaio inossidabile a fondo tondo. Generalmente, 20 g di materiale vegetale fresco sono sufficienti per l'estrazione dell'RNA e l'analisi del trascrittoma.
6. Verificare che ci sia una sostanza bianca simile alla polvere (costituita da detriti vegetali, tricomi ghiandolari e ghiaccio secco frantumato) sul fondo del contenitore di acciaio inossidabile immerso nel LN. Un'osservazione microscopica aiuterà a determinare se è stata raccolta una quantità sufficiente di tricomi; Tuttavia, questo passaggio potrebbe ostacolare il flusso del protocollo. Di solito, 10-20 g di materiale vegetale iniziale sono sufficienti per la maggior parte degli isolamenti; Tuttavia, ci possono essere differenze nella densità dei tricomi delle piante.
   NOTA: da questo punto, l'esperimento può essere sospeso e riavviato in seguito. In caso di pausa per un breve periodo, è necessario aggiungere quantità adeguate di LN in modo che i tricomi rimangano sommersi. In alternativa, i tricomi possono essere raccolti e conservati a -80 °C per un massimo di 3 mesi per un uso successivo, come descritto nella fase 5.

3. Separazione dei tricomi capitati ghiandolari (peduncoli e sessili) da altri tipi di tricomi, come tricomi bulbosi e cistolitici e detriti

1. Aggiungere una piccola quantità di LN in un piccolo contenitore pulito in acciaio inossidabile a fondo rotondo.
2. Piegare due volte un microsetaccio da 40 cm x 40 cm con maglie da 150 μm per ottenere una piega di 20 cm x 20 cm e aprirlo. Assicurati che assomigli a una forma a cono (Figura 5).
3. Fissare il cono di rete al bordo del contenitore in acciaio inossidabile a fondo rotondo con una o due mollette in modo che la parte aperta del cono sia in posizione verticale e la sua parte appuntita sia parzialmente immersa nel LN.
4. Versare delicatamente il LN e la sostanza bianca simile alla polvere dal punto 2.6 nel cono micro-setaccio.
5. Applicare delicatamente un pennello largo per raccogliere e trasferire il materiale vegetale rimanente dal primo contenitore nel cono a maglie da 150 μm.
6. Aggiungere altro LN al primo contenitore e ripetere il movimento di spazzolatura fino a quando tutto il materiale vegetale viene trasferito al cono micro-setaccio.
7. Staccare con attenzione la molletta dal coperchio del contenitore e aprire il cono di micro-setaccio in modo che i tricomi si trovino nel mezzo del micro-setaccio aperto. Tenere insieme tutti e quattro gli angoli del microsetaccio in modo che la parte centrale contenente i tricomi rimanga immersa nel LN (Figura 6).
8. Mentre si tengono tutti e quattro gli angoli del micro-setaccio, immergere delicatamente e agitare il micro-setaccio nel LN nel contenitore di acciaio come se si stesse infondendo una bustina di tè. Continuare questo movimento di immersione/agitazione (verticale e orizzontale) per 1 minuto. C'è un compromesso tra la qualità e la quantità dell'isolamento. Movimenti di immersione più lunghi possono comportare maggiori quantità di tricomi, ma il loro grado di isolamento può essere più scarso. Nel complesso, 1 min è raccomandato come adeguato sia per la qualità che per la quantità.
   NOTA: questo movimento di setacciatura è la parte più critica del protocollo e deve essere eseguito di conseguenza.
9. Facoltativo: raccogliere i detriti vegetali non setacciati e i tricomi più grandi (ancora immersi nel LN) che sono avvolti al centro del microsetaccio in una provetta da 13 ml o 50 ml e conservare a -80 ° C per un uso futuro.
   ATTENZIONE: Per evitare l'accumulo di gas sotto pressione (dal ghiaccio secco e dai residui di LN), forare un foro nel cappuccio della provetta con un ago sterilizzato. Il tappo può essere sostituito una volta che la pressione si è ridotta, che di solito è dopo 24 h.

4. Passaggio di tricomi attraverso micro-setacci di dimensione dei pori decrescente

1. Trasferire sequenzialmente i tricomi setacciati immersi nel LN sul fondo del piccolo contenitore in acciaio inossidabile a fondo tondo attraverso microsetacci con dimensioni dei pori decrescenti (105 μm, 80 μm, 65 μm e 50 μm), nello stesso modo presentato nella fase 3.

5. Raccolta dei tricomi desiderati

1. Rimuovere i tricomi desiderati immersi nel LN e avvolti nel microsetaccio da 50 μm utilizzando un cucchiaio pre-refrigerato (in LN). Mettili su un piatto pulito.
   NOTA: In questa fase finale di isolamento, i tricomi desiderati vengono raccolti dal setaccio.
2. Trasferire rapidamente i tricomi simili a polvere in un tubo marcato pre-raffreddato da 1,5 mL tramite una spatola pre-refrigerata o una scoopula inserita nel tubo (Figura 7). Conservare immediatamente le provette a -80 °C per ulteriori studi.
   NOTA: nella Figura 8 viene fornito un grafico schematico del flusso di lavoro che illustra l'intero protocollo di isolamento.

6. Osservazione e analisi dei tricomi purificati

1. Posizionare una piccola quantità (10 mg) di tricomi isolati su un vetrino da microscopio usando una spatola pre-raffreddata (tramite LN). Aggiungi una goccia d'acqua e osserva direttamente su un microscopio ottico senza macchiare. Valutare il grado complessivo di isolamento e contaminazione utilizzando ingrandimenti bassi (10x) e alti (40x). L'arricchimento è stimato visivamente dalla quantità relativa di tricomi rispetto al tessuto non tricomico, come mostrato nella Figura 9.
2. Eseguire l'estrazione dell'RNA e l'analisi della qualità da 50 mg di tricomi isolati ghiandolari capitati e sessili isolati di C. sativa.
   NOTA: Per l'estrazione dell'RNA è stato utilizzato un kit di estrazione commerciale (vedi Tabella dei materiali) che impiega una strategia basata su poli-A di purificazione dell'mRNA.
   1. Risospendere 50 mg dei tricomi isolati nella soluzione di lisi, vortice per 30 s, sonicare in un'unità di pulizia ad ultrasuoni ghiacciata a 35 kHz per 5 minuti ed estrarre l'mRNA dai campioni secondo il protocollo del produttore (vedi Tabella dei materiali).
   2. Per stimare l'integrità dell'RNA estratto dai tricomi, determinare la concentrazione di RNA, la quantità totale e i valori del numero di integrità dell'RNA (RIN) utilizzando un sistema lab-on-a-chip (vedi Tabella dei materiali).
   3. Eseguire l'analisi RNAseq delle frazioni di tricomi (opzionale). L'analisi RNAseq e le analisi bioinformatiche delle letture sequenziate possono essere eseguite da servizi di outsourcing standard

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Risultati

La principale modifica inclusa in questo protocollo rispetto ai protocolli convenzionali di isolamento tricomico è la sostituzione del mezzo di isolamento standard con LN. L'utilizzo di LN come mezzo di isolamento consente un flusso di lavoro rilassato, perché finché i campioni sono immersi in LN, è improbabile che si verifichi degradazione metabolica. Inoltre, poiché il protocollo evita i componenti pericolosi (cioè acido aurintricarbossilico e β-mercaptoetanolo) utilizzati nel tradizionale mezzo di isolamento de...

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Discussione

Rispetto ai protocolli di isolamento tricomico attualmente disponibili, due modifiche principali sono descritte nel presente protocollo. Questi includono il distacco dei tricomi dal materiale vegetale utilizzando ghiaccio secco nella fase iniziale e la sostituzione di LN per il mezzo tampone liquido comunemente usato. La prima modifica per la purificazione dei tricomi di C. sativa si basa su un protocollo precedente che ha introdotto l'uso di ghiaccio secco tritato per staccare i tricomi dai pedicelli di geranio...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bioanalyzer RNA Pico 6000 chip	Agilent, Germany	Reorder number 5067-1513	Lab-on-a-chip system
Transsonic-310	Elma, Germany	D-78224	Ultrasonic cleaning unit
TruSeq RNA Sample Prep Kit v2	Illumina, USA	RS-122-2001	Sample preperation for RNA sequencing library
Spectrum Plant Total RNA Kit	SIGMA-ALDRICH, USA	STRN50-1KT	Plant Total RNA Kit
Nylon micro-sieve with a mesh size of 350 µm (40 x 40 cm or larger than the circumference of the flour sifter)	Sinun Tech, Israel	r0350n350210	Nylon screen aperture
Nylon micro-sieve with mesh size of 150 µm (size of 30 x 30 cm)	Sinun Tech, Israel	r0150n360465	Nylon screen aperture
Nylon micro-sieve with mesh size o 105 µm (size of 30 x 30 cm)	Sinun Tech, Israel	r0105n320718	Nylon screen aperture
Nylon micro-sieve with mesh size o 80 µm (size of 30 x 30 cm)	Sinun Tech, Israel	r0080n370465	Nylon screen aperture
Nylon micro-sieve with mesh size o 65 µm (size of 30 x 30 cm)	Sinun Tech, Israel	r0065n340715	Nylon screen aperture
Nylon micro-sieve with mesh size o 50 µm (size of 30 x 30 cm)	Sinun Tech, Israel	r0080n370465	Nylon screen aperture
Up to 10 g of frozen plant material (stored in -80 oC or liquid nitrogen)
Suitable gloves for handling low temperatures
Safety goggles
1 mm screen door (mosquito) mesh (strip of 30 x 100 cm)
Large strainer (colander) with holes approximately 5 mm
1 L glass beaker
1 block of dry ice (0.5-1 kg)
Hammer and hard flat object
Two 5 L plastic containers
Rubber bands
Large flour sifter or sieve strainer- preferably one with a detachable plastic ring on the circumference
Several large and small round bottom stainless steel containers. One of them should be larger than the flour sifter's circumference (approximately 40 cm in diameter), to minimize the loss of the sifted mass outside the round bottome stainless steel container
Pre-chilled (via liquid nitrogen) stainless steel spoon, spatula, and scoopula
Clean plate
Several clothespins
Pre-chilled (via liquid nitrogen) labeled 1.5 mL tubes with holes poked on the lid with a sterile needle
Two containers of liquid nitrogen
1 cm wide painting brush