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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

L'attuale studio descrive un protocollo per monitorare i cambiamenti nelle cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) durante l'infezione virale utilizzando un sistema di analisi cellulare in tempo reale (RTCA).

Abstract

Le cellule endoteliali rivestono la superficie interna di tutti i vasi sanguigni e linfatici, creando una barriera semipermeabile che regola lo scambio di fluidi e soluti tra il sangue o la linfa e i tessuti circostanti. La capacità di un virus di attraversare la barriera endoteliale è un meccanismo importante che facilita la diffusione del virus nel corpo umano. Molti virus alterano la permeabilità endoteliale e/o causano l'interruzione della barriera cellulare endoteliale durante l'infezione, che è in grado di causare perdite vascolari. L'attuale studio descrive un protocollo di analisi cellulare in tempo reale (RTCA), utilizzando un analizzatore cellulare in tempo reale commerciale per monitorare l'integrità endoteliale e i cambiamenti di permeabilità durante l'infezione da virus Zika (ZIKV) delle cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC). I segnali di impedenza registrati prima e dopo l'infezione da ZIKV sono stati tradotti in valori di indice cellulare (CI) e analizzati. Il protocollo RTCA consente di rilevare effetti transitori sotto forma di cambiamenti morfologici cellulari durante un'infezione virale. Questo saggio potrebbe anche essere utile per studiare i cambiamenti nell'integrità vascolare degli HUVEC in altre configurazioni sperimentali.

Introduzione

Le cellule endoteliali (EC) rivestono la superficie interna di tutti i vasi sanguigni e linfatici. Sono collegati da aderenti, giunzioni a fessura stretta, che creano una barriera semipermeabile tra il sangue o la linfa e i tessuti circostanti 1,2. Le giunzioni endoteliali intatte cellula-cellula sono fondamentali per regolare il trasporto di macromolecole, soluti e fluidi, cruciali per le attività fisiologiche dei tessuti e degli organi corrispondenti3. La barriera endoteliale è dinamica e modulata da stimoli specifici4. L'interruzione o la perdita della funzione della barriera endoteliale è un segno distintivo della fisiopatologia della malattia nell'infiammazione acuta e cronica nella patogenesi di molte malattie 5,6,7, inclusa l'infezione virale 8,9,10,11. Per i flavivirus, è stato riscontrato che la proteina non strutturale NS1 può alterare la permeabilità endoteliale, ad esempio, attraverso la rottura dello strato simile al glicocalice endoteliale a seguito dell'aumento dell'espressione e dell'attivazione della catepsina L, delle sialidasi e dell'endoglicosidasi eparinasi9. Nello stato di malattia, l'integrità del monostrato endoteliale è compromessa e le giunzioni cellula-cellula sono interrotte, il che può portare a lesioni e disfunzioni endoteliali12 e, infine, a manifestazioni patologiche diffuse in più sistemi di organi13,14. L'infezione virale delle EC provoca cambiamenti nelle vie di segnalazione cellulare e nel profilo di espressione genica cellulare, che possono influenzare le funzioni di barriera dei fluidi, causare l'interruzione delle EC e indurre perdite vascolari10,15. È stato riscontrato che l'infezione da virus Zika (ZIKV) delle EC interrompe l'integrità giunzionale che causa cambiamenti nella permeabilità vascolare e porta a disfunzione della barriera endoteliale, con conseguente perdita vascolare10,15. Gli studi hanno dimostrato che ZIKV è legato a gravi difetti alla nascita; Tuttavia, non si sa molto sull'esatto meccanismo attraverso il quale ciò avviene16,17. Comprendere i cambiamenti della barriera endoteliale durante un'infezione è quindi fondamentale per comprendere il meccanismo della malattia.

Le EC sono attualmente utilizzate come un importante sistema sperimentale di modelli vascolari in vitro per vari processi fisiologici e patologici 18,19,20,21. Le cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) sono state ampiamente utilizzate come sistema cellulare primario e non immortalizzato per studiare l'endotelio vascolare e la biologia vascolare in vitro 22,23,24,25. Gli HUVEC sono stati isolati per la prima volta per la coltura in vitro all'inizio degli anni '70 dalla vena ombelicale del cordone ombelicale umano26. Gli HUVEC hanno una morfologia simile a quella di un ciottolo che viene facilmente fatta proliferare in laboratorio. A causa dello sforzo di taglio dopo essere stato mantenuto per lunghi periodi allo stato confluente, si osserva un allungamento della forma cellulare. Le HUVEC possono essere caratterizzate dalla presenza di corpi di Weibel e Palade (WPB), vescicole pinocitiche, piccole quantità di fibrille situate vicino al nucleo, mitocondri con forme tubolari che raramente mostrano ramificazioni, un nucleo ellissoide con un sottile pattern granulare di cromatina condensata e da uno a tre nucleoli presenti in ciascun nucleo27. Sebbene gli HUVEC mostrino numerose caratteristiche morfologiche, l'identificazione degli HUVEC non può essere ottenuta con il solo esame ottico. I saggi, come la colorazione in immunofluorescenza dell'endotelio vascolare (VE)-caderina, sono comunemente usati per il monitoraggio dell'integrità vascolare negli HUVEC 28,29,30,31.

Questo studio descrive il protocollo di analisi cellulare in tempo reale (RTCA) dell'infezione da HUVEC. Il sistema RTCA utilizza speciali piastre rivestite in oro contenenti microelettrodi che forniscono una superficie conduttiva per l'attacco della cella. Quando le cellule si attaccano alla superficie del microelettrodo, si forma una barriera che impedisce il flusso di elettroni attraverso i microelettrodi. La misurazione dell'impedenza generata dai microelettrodi può essere utilizzata per ottenere informazioni su alcuni processi cellulari, tra cui l'attaccamento cellulare, la proliferazione e la migrazione32. Il test riportato è un test cellulare basato sull'impedenza che, abbinato a un analizzatore cellulare in tempo reale, fornisce una misurazione continua della proliferazione delle cellule vive, dei cambiamenti morfologici (come il restringimento cellulare) e della qualità dell'attacco cellulare in modo non invasivo e privo di marcatura. In questo studio, l'analizzatore cellulare in tempo reale viene utilizzato per monitorare l'integrità endoteliale e i cambiamenti morfologici degli HUVEC durante l'infezione da ZIKV. In breve, lo strumento misura il flusso di elettroni trasmesso in piastre specializzate per microtitolazione rivestite con microelettrodo in oro in presenza di un terreno di coltura (soluzione elettricamente conduttiva). L'aderenza delle cellule o i cambiamenti nel numero e nella morfologia delle cellule disturbano il flusso di elettroni e causano variazioni di impedenza che possono essere catturate dallo strumento (Figura 1 supplementare). La differenza tra la crescita, la proliferazione e l'aderenza di HUVEC prima e dopo l'infezione da ZIKV viene registrata in tempo reale da un segnale di impedenza elettrica e quindi tradotta in valore dell'indice cellulare (CI). Il valore di CI della pre-infezione viene utilizzato come linea di base per la normalizzazione del valore di CI. Le variazioni dei valori di CI riflettono i cambiamenti morfologici cellulari o la perdita di aderenza cellulare in seguito all'infezione33. I risultati dello studio mostrano che il protocollo RTCA consente di rilevare effetti transitori o cambiamenti morfologici cellulari durante l'infezione virale rispetto a un test endpoint, come la colorazione in immunofluorescenza della VE-caderina. Il metodo RTCA potrebbe essere utile per analizzare i cambiamenti dell'integrità vascolare HUVEC in seguito all'infezione da parte di altri virus.

Protocollo

1. Preparazione delle cellule

  1. Preparazione di HUVEC
    1. Coltivare 7,5 x 105 cellule HUVEC/mL in un matraccio di coltura cellulare da 75cm2 (rivestito con 20 μg/mL di collagene di tipo 1) contenente 12 mL di terreno endoteliale (ECM) integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS), 0,01% di integratore per la crescita delle cellule endoteliali (ECGS) che contiene fattori di crescita, ormoni e proteine necessari per la coltura di HUVEC, e 0,01% penicillina-streptomicina (P/S). Incubare le cellule in un incubatore per colture cellulari a 37 °C con il 5% di CO2 (Figura 1).

2. Messa a punto dell'esperimento RTCA

  1. Verifica del resistore eseguita su RTCA
    1. Fare doppio clic sull'icona del software RTCA sul desktop per avviare l'applicazione. Apparirà una finestra di accesso, digita il nome utente e la password per accedere.
    2. Posizionare una piastra resistiva RTCA a 96 pozzetti con il pozzetto A1 rivolto verso l'interno nella stazione RTCA situata nell'incubatore per colture cellulari.
    3. Nella scheda Note esperienza del software RTCA, digitare il nome dell'esperimento, il numero di serie del dispositivo e il tipo di dispositivo (piastra QC).
    4. Nella scheda Layout sotto la scheda Cella del software RTCA, evidenziare tutti i pozzetti e fare clic con il pulsante destro del mouse sui pozzetti evidenziati per assicurarsi che tutti i pozzetti siano accesi (disattivati).
    5. Nella scheda Pianificazione del software RTCA, fare clic su Step_1. Immettere Sweep: 10 e Intervallo: 30 s. Fare clic su Applica. Fare clic su Start/Continua nell'angolo in alto a sinistra del software per avviare l'esecuzione della verifica.
      NOTA: Assicurarsi che il collegamento dei pozzetti alla stazione RTCA sia corretto osservando "Scansione su piastra. Connessioni OK" in fondo alla pagina.
  2. Esecuzione di verifica del resistore per l'analisi dei dati
    1. Nella scheda Indice cella controllare i dati al termine dell'esecuzione. Tutti i valori CI devono essere inferiori a 0,063.
    2. Nella parte inferiore della scheda Indice cella , controllare i dati di scansione grezzi. I dati di analisi non elaborati devono presentare modelli di valori ripetuti di 40,0 ± 2,0 (righe A e H), 67,5 ± 2,5 (righe B e G), 93,6 ± 2,9 (righe C e F) e 117,6 ± 3,2 (righe D ed E).
    3. Per interrompere l'esecuzione della verifica, fare clic su Piastra > Piastra di rilascio. La piastra del resistore RTCA a 96 pozzetti è ora pronta per essere rimossa dalla stazione RTCA.
  3. Ottenere la lettura di base su RTCA
    1. Lavare la piastra con microelettrodo in oro specializzato rivestita di collagene di tipo 1 (rivestita con 20 μg/mL di collagene di tipo 1) con 60 μL/pozzetto di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS; con bicarbonato di sodio, senza cloruro di calcio e solfato di magnesio) 2 volte.
    2. Scartare l'HBSS rimanente e aggiungere 50 μL/pozzetto di ECM. Posizionare la piastra specializzata in microelettrodo d'oro contenente ECM con il pozzetto A1 rivolto verso l'interno nella stazione RTCA situata nell'incubatore per colture cellulari.
    3. Nella scheda Note esperienza del software RTCA, digitare il nome dell'esperimento, il numero di serie del dispositivo e il tipo di dispositivo (formato a 96 pozzetti).
    4. Nella scheda Layout sotto la scheda Cella del software RTCA, evidenziare i pozzetti che verranno utilizzati e fare clic con il pulsante destro del mouse sui pozzetti evidenziati per assicurarsi che tutti i pozzetti siano accesi (in grigio).
    5. Nella scheda Pianificazione del software RTCA, fare clic su Step_1 e fare clic su Avvia/Continua nell'angolo in alto a sinistra del software per ottenere una lettura di base.
      NOTA: Assicurarsi che il collegamento dei pozzetti sia corretto osservando "Scansione della piastra. Connessioni OK" in fondo alla pagina.
    6. Una volta ottenuta la lettura di fondo, la piastra specializzata in oro-microelettrodo è ora pronta per la semina cellulare e pronta per essere rimossa dalla stazione RTCA.
  4. Preparazione di HUVEC nella piastra specializzata per microelettrodi in oro
    1. Seminare gli HUVEC nella piastra specializzata del microelettrodo in oro con 50 μL/pozzetto di terreno condizionato, 1 x 104 cellule/pozzetto (terreno condizionato: ECM integrato con 10% di FBS, 0,01% di ECGS e 0,01% di P/S). Riposizionare la piastra nella stazione RTCA con il pozzetto A1 rivolto verso l'interno per l'incubazione notturna in un incubatore per colture cellulari a 37 °C con il 5% di CO2 .
      NOTA: È stato eseguito un conteggio cellulare sulla sospensione cellulare con un fattore di diluizione di due utilizzando un emocitometro.
    2. Nella scheda Pianificazione , fai clic su Aggiungi un passaggio nell'angolo in alto a sinistra. Fare clic su Step_2 e modificare le sweep: 601 e l'intervallo: 2 min. Fare clic su Applica. Fare clic su Step_2 e fare clic su Start/Continua nell'angolo in alto a sinistra del software.
    3. Dopo 20 ore di incubazione e quando i valori di CI nella scheda Grafico pozzetti mostrano un plateau, la piastra è pronta per l'infezione. Nella scheda Pianificazione del software RTCA, fare clic su Interrompi passaggio.
    4. La piastra specializzata in microelettrodo d'oro è ora pronta per essere rimossa dalla stazione RTCA per le fasi successive.

3. Infezione virale negli HUVEC

  1. Diluizione del virus
    1. La coltura del brodo ZIKV viene mantenuta a -80 °C. Per questo studio, rimuovere lo stock di virus conservato nelle fiale criogeniche e diluire lo stock di ZIKV con ECM senza siero in provette da centrifuga da 1,5 mL per ottenere una molteplicità di infezioni (MOI) di 0,1 e 1.
      NOTA: Il brodo ZIKV è stato precedentemente preparato eseguendo la propagazione in cellule Vero e raccogliendo il surnatante ZIKV34.
  2. Infezione del monostrato cellulare
    1. Rimuovere ed eliminare il terreno condizionato (ECM integrato con il 10% di FBS, lo 0,01% di ECGS e lo 0,01% di P/S) da ciascun pozzetto. Risciacquare ogni pozzetto con 60 μL di HBSS 2x. Inserire l'HBSS con l'ausilio del lato del pozzetto; Non sparare al monostrato di celle.
    2. Procedendo dalla diluizione più alta a quella più bassa, aggiungere 40 μL di ciascun campione di virus diluito in ECM senza siero nel pozzetto. Triplicare il pozzetto per ogni diluizione e mantenere sei pozzetti senza infezione (controllo negativo e controllo positivo trombina). Non sparare al monostrato cellulare; Invece, aggiungi il virus diluito con l'aiuto del lato del pozzetto. Utilizzare un puntale di pipetta nuovo per ogni inserimento.
      NOTA: La trombina è stata scelta come controllo positivo in quanto può aumentare rapidamente la permeabilità endoteliale degli HUVEC.
    3. Incubare la piastra in un incubatore per colture cellulari a 37 °C con il 5% di CO2 per consentire l'adsorbimento del virus. Agitare la piastra 5 volte ogni 15 minuti per consentire l'adsorbimento del virus in tutto il monostrato cellulare.
  3. Aggiunta del terreno di coltura cellulare di copertura
    1. Dopo 1 ora di incubazione, rimuovere ed eliminare la sospensione virale dalla concentrazione più bassa a quella più alta.
    2. Lavare le cellule infette con 60 μL di HBSS 2x. Sovrapporre il pozzetto con ECM integrato con FBS al 2%. Per i pozzetti di controllo positivo, diluire la trombina a 20 U/mL con ECM integrata con FBS al 2% e sovrapporre i pozzetti con terreno ECM contenente trombina. Non sparare al monostrato cellulare; Invece, aggiungi il supporto di sovrapposizione con l'aiuto del lato del pozzetto.
  4. Posizionamento della piastra specializzata infetta con microelettrodo d'oro nella stazione RTCA
    1. Nella scheda Pianificazione , fai clic su Aggiungi un passaggio nell'angolo in alto a sinistra. Fare clic su Step_3 e modificare le sweep: 3.601 e l'intervallo: 2 min. Fare clic su Applica.
    2. Fare clic su OK nella finestra pop-up visualizzata. Posizionare la piastra specializzata in microelettrodo d'oro infetto con il pozzetto A1 rivolto verso l'interno nella stazione RTCA situata nell'incubatore per colture cellulari.
    3. Fare clic su Step_3 e fare clic su Start/Continua nell'angolo in alto a sinistra del software.

4. Analisi ed esportazione dei dati

  1. Aggiunta di informazioni sperimentali di ogni pozzo
    1. Nella scheda Layout , fare clic sulla scheda Cella (Figura 2A). Per immettere le informazioni sulla cella di destinazione e determinare il tipo di pozzetto per ciascun pozzetto, evidenziare il pozzetto e digitare il nome, il numero e il colore della cella di destinazione nella parte inferiore del software. Fare clic su Applica (Figura 2B).
    2. Per selezionare e determinare il tipo di pozzetto per ciascun pozzetto nella scheda Cella , evidenziare il pozzetto, selezionare il tipo di pozzetto (campione, controllo positivo o controllo negativo) e fare clic su Imposta.
    3. Nella scheda Layout , fare clic sulla scheda Trattamento (Figura 2C). Per inserire le informazioni sul trattamento, evidenziare il pozzetto e digitare il nome del trattamento, la concentrazione del trattamento, l'unità e il colore. Fare clic su Applica (Figura 2D).
    4. Per selezionare e determinare il tipo di pozzetto per ciascun pozzetto nella scheda Trattamento , evidenziare il pozzetto, selezionare il tipo di pozzetto (campione, controllo positivo o controllo negativo) e fare clic su Imposta.
      NOTA: Per ogni selezione, è possibile evidenziare più pozzetti contemporaneamente.
  2. Normalizzazione del valore CI
    1. Fare clic con il pulsante destro del mouse a destra della scheda Analisi dati e selezionare Indice cella normalizzato dalla casella a discesa Asse Y (Figura 3A). Nella sezione Asse X in basso, selezionare il tempo normalizzato come ultimo punto temporale misurato in cui la piastra del microelettrodo d'oro specializzato è stata rimossa per l'infezione (Figura 3B).
      NOTA: Il processo di normalizzazione effettuato dal software rimuove la maggior parte della variabilità dovuta alle differenze di semina e attaccamento del pozzo, purché il punto di normalizzazione scelto sia prima dell'aggiunta del virus e/o del trattamento. Pertanto, il punto temporale di normalizzazione ottimale dovrebbe essere l'ultimo punto temporale prima dell'aggiunta del virus e/o del trattamento. Il punto temporale da normalizzare può essere controllato nella scheda Pianificazione in Step_2. Il tempo totale indicato è il punto di tempo per la normalizzazione (Figura 3C).
  3. Rappresentazione grafica dei dati ottenuti con il software RTCA
    1. Nella scheda Analisi dati , selezionare i pozzetti da aggiungere al grafico evidenziando i pozzetti e facendo clic << Aggiungi. L'indice di cella normalizzato rispetto al grafico temporale è ora pronto per essere copiato ed esportato. Assicurati di selezionare la casella di controllo Media .
  4. Esportazione dei dati con il software RTCA
    1. Nell'angolo in alto a sinistra del software RTCA, fare clic su Piastra > Esporta informazioni sull'esperimento.... Selezionare la casella per selezionare i dati da esportare. Fare clic su OK.
      NOTA: i dati grezzi (valori CI grezzi) possono essere esportati quando l'opzione Indice cella > Tutto è selezionata.
    2. Selezionare la cartella in cui salvare il file di esportazione. Fare clic su SALVA. Apparirà una finestra pop-up che indica l'esportazione delle informazioni sperimentali. Una volta terminata l'esportazione, verrà visualizzata un'altra finestra che indica che le informazioni dell'esperimento esportate sono pronte per essere visualizzate.

Risultati

Prima dell'infezione da ZIKV, l'IC registrato per il monostrato HUVEC coltivato su una piastra microtitolante rivestita con microelettrodo in oro era superiore a 8, suggerendo forti proprietà di aderenza. Le piastre o i pozzetti con un indice CI inferiore a 8 devono essere scartati. Gli HUVEC sono stati quindi infettati con ZIKV a un MOI di 0,1 e 1 e l'impedenza cellulare è stata registrata per 7 giorni. Il valore di CI degli HUVEC infettati con ZIKV P6-740 a un MOI di 0,1 (linea azzurra) ha iniziato a scendere a 15 or...

Discussione

L'infezione virale citocida nelle cellule permissive è solitamente associata a cambiamenti sostanziali nella morfologia e nella biosintesi cellulare36. I cambiamenti morfologici cellulari indotti dal virus, come il restringimento cellulare, l'allargamento cellulare e/o la formazione di sincizi, sono anche noti come effetti citopatici (CPE), caratteristici di alcune infezioni virali37. Nelle EC, la CPE è stata descritta come la distruzione delle cellule e la rottura delle ...

Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Riconoscimenti

Questa ricerca ha ricevuto il sostegno del Ministero dell'Istruzione Superiore della Malesia nell'ambito del programma Higher Institution Centre of Excellence (HICoE) (MO002-2019) e il finanziamento nell'ambito del Long-Term Research Grant Scheme (LRGS MRUN Phase 1: LRGS MRUN/F1/01/2018).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microcentrifuge tubeNest615601
37 °C incubator with 5% CO2SanyoMCO-18AIC
75 cm2 tissue culture flask Corning430725U
Antibiotic solution penicillin-streptomycin (P/S)Sciencell0503
Biological safety cabinet, Class IIHoltenHB2448
Collagen Type 1SIgma-AldrichC3867
Endothelial cell growth supplement (ECGS)Sciencell1052
Endothelial cell medium (ECM)Sciencell1001
E-plate 96Agilent Technologies, Inc.05232368001
Fetal bovine serum (FBS)Sciencell0025
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)Sigma-AldrichH9394
HemocytometerLaboroptik LTDNeubauer improved
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs)Sciencell8000
Inverted microscopeZEISSTELAVAL 31
Latitude 3520 LaptopDell -
Multichannel micropipette (10 - 100 µL)Eppendorf3125000036
Multichannel micropipette (30 - 300 µL)Eppendorf3125000052
Reagent reserviorTarsonsT38-524090
RTCA resistor plate 96Agilent Technologies, Inc.05232350001
RTCA Software Pro (Version 2.6.1)Agilent Technologies, Inc.5454433001
Single channel pipettes (10 - 100 µL)Eppendorf3123000047
Single channel pipettes (100 - 1000 µL)Eppendorf3123000063
Single channel pipettes (20 - 200 µL)Eppendorf3123000055
xCELLigence Real-time cell analyzer SP (Model: W380)Agilent Technologies, Inc.00380601030https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-analysis/rtca-analyzers/xcelligence-rtca-sp-single-plate-741232

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