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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Presentiamo due kit RT-qPCR one-step basati su sonde per i virus respiratori comuni. Il primo test è per SARS-CoV-2 (N), influenza A (H1N1 e H3N2) e influenza B. Il secondo è per SARS-Cov-2 (N) e MERS (UpE e ORF1a). Questi saggi possono essere implementati con successo in qualsiasi laboratorio specializzato.

Abstract

La sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) che causa la malattia da Coronavirus 2019 (COVID-19) è una seria minaccia per la salute pubblica. Durante le stagioni influenzali, la diffusione del SARS-CoV-2 e di altri virus respiratori può causare un carico di malattie respiratorie a livello di popolazione che è difficile da gestire. Per questo, i virus respiratori SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B e sindrome respiratoria del Medio Oriente (MERS-CoV) dovranno essere attentamente monitorati nelle prossime stagioni autunnali e invernali, in particolare nel caso di SARS-CoV-2, Influenza A e Influenza B, che condividono fattori epidemiologici simili come popolazioni suscettibili, modalità di trasmissione e sindromi cliniche. Senza saggi specifici per il bersaglio, può essere difficile distinguere tra i casi di questi virus a causa delle loro somiglianze. Di conseguenza, un test multiplex sensibile e mirato, in grado di differenziare facilmente tra questi bersagli virali, sarà utile per gli operatori sanitari. In questo studio, abbiamo sviluppato un test basato sulla PCR con trascrittasi inversa in tempo reale utilizzando un kit RT-qPCR R3T one-step sviluppato internamente per il rilevamento simultaneo di SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B e SARS-CoV-2, MERS-CoV. Con un minimo di 10 copie dei loro RNA sintetici, possiamo identificare con successo i bersagli di SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B e MERS-CoV contemporaneamente con una specificità del 100%. Questo test è risultato accurato, affidabile, semplice, sensibile e specifico. Il metodo sviluppato può essere utilizzato come test diagnostico ottimizzato per SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B e SARS-CoV-2, MERS-CoV in ospedali, centri medici e laboratori diagnostici, nonché per scopi di ricerca.

Introduzione

La pandemia della malattia da coronavirus 2019 (COVID-19) in corso è causata dal nuovo coronavirus noto come sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2)1. A causa della forte contagiosità e della capacità di trasmissione rapida del SAR-CoV-2, la pandemia di COVID-19 è emersa nella città di Wuhan, in Cina, e si è diffusa rapidamente in tutto il mondo. Questo alla fine ha portato all'inizio di segni di distress respiratorio e persino alla morte 2,3,4. Il COVID-19 è stato dichiarato pandemia in più di 213 paesi, prevedendo un forte aumento del numero di casi confermati, come evidenziato dai documenti pubblicati da diversi studi di ricerca 3,5. Il COVID-19 si trasmette principalmente attraverso piccole goccioline respiratorie che le persone infette rilasciano nell'ambiente e quindi vengono esposte a persone vulnerabili attraverso l'inalazione o il contatto ravvicinato con superfici contaminate. Quando queste goccioline entrano in contatto con la mucosa degli occhi, della bocca o del naso, una persona può essere infettata6. Le statistiche pubblicate dall'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) mostrano che ci sono stati più di 76 milioni di casi confermati di pandemia in tutto il mondo, con l'incredibile cifra di 7 milionidi morti. Pertanto, le Nazioni Unite hanno classificato la pandemia causata dalla malattia COVID-19 come un disastro a causa del suo impatto diretto sulla vita di miliardi di persone in tutto il mondo e ha avuto effetti economici, ambientali e sociali di vasta portata.

Le iniziative di salute pubblica, tra cui test approfonditi, diagnosi precoce, tracciamento dei contatti e isolamento dei casi, si sono dimostrate cruciali per tenere sotto controllo questa pandemia 8,9,10,11. I mesi invernali aumenteranno la circolazione di altri virus respiratori come l'influenza A e B con sintomi simili al COVID-19 che rendono difficile identificare, rintracciare e isolare precocemente i casi di COVID-19. Ogni anno, l'epidemia di influenza A e B inizia nel tardo autunno o all'inizio di gennaio con una stagionalità prevedibile12. Numerosi tratti epidemiologici sono condivisi dai virus SARS-CoV-2 e influenzali. Inoltre, condividendo somiglianze nelle popolazioni suscettibili che includono bambini, anziani, immunocompromessi e individui con comorbidità croniche come asma, broncopneumopatia cronica ostruttiva, insufficienza cardiaca e renale o diabete12,13. Questi virus non solo condividono popolazioni vulnerabili, ma anche vie di trasmissione di contatto e goccioline respiratorie14. Si prevede che i pazienti possano probabilmente contrarre più di uno di questi virus respiratori conl'avvicinarsi della stagione influenzale. Per questo, lo screening del SARS-CoV-2 e dei virus dell'influenza deve essere eseguito su pazienti sintomatici prima che vengano isolati. L'esecuzione di test separati per i tre virus (SARS-CoV-2, Influenza A e Influenza B) non è possibile a causa della mancanza globale di risorse per l'estrazione e la diagnostica degli acidi nucleici. Per esaminarli tutti in un'unica reazione, è necessario sviluppare un metodo o un test.

La sindrome respiratoria del Medio Oriente (MERS)-CoV è un membro della famiglia del coronavirus umano (CoV). I primi isolati del virus MERS-CoV provenivano da un paziente ricoverato in Arabia Saudita che era morto nel settembre 2012 a causa di problemi respiratori acuti15. Ci sono prove che suggeriscono che un importante ospite serbatoio per MERS-CoV sono i dromedari. È stato dimostrato che i virus dei dromedari infetti sono zoonotici e quindi possono infettare l'uomo16,17. Gli esseri umani infettati da questo virus possono diffonderlo ad altri attraverso il contatto ravvicinato18. Al 26 gennaio 2018, ci sono stati 2143 casi confermati in laboratorio di infezione da MERS-CoV, inclusi 750 decessi a livello globale19. I sintomi più tipici della MERS-CoV sono tosse, febbre e mancanza di respiro. È stato anche segnalato che le infezioni da MERS-CoV mostrano sintomi di polmonite, diarrea e malattie gastrointestinali20. Attualmente, non è disponibile alcun vaccino commerciale o trattamento specifico per MERS-CoV. Pertanto, una diagnosi tempestiva e precisa è essenziale per prevenire le diffuse epidemie di MERS-CoV e differenziare la malattia MERS-CoV dalla malattia SARS-CoV-2.

Ad oggi, sono stati proposti molti approcci per rilevare questi virus, come RT-PCR multiplex 21,22,23,24,25, CRISPR/Cas1226,27, CRISPR/Cas928 e CRISPR/Cas329, test immunologico a flusso laterale30, sensori biomolecolari cartacei31, test SHERLOCK in one pot32, aptamero del DNA33, isoterma mediata da loop amplificazione (LAMP)19,34, ecc. Ognuno dei metodi sopra menzionati presenta vantaggi e svantaggi unici in termini di sensibilità e specificità. Tra questi metodi, il test basato sull'amplificazione degli acidi nucleici: qRT-PCR multiplex, è il più comune ed è considerato il gold standard per la diagnosi di SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B e MERS-CoV.

In questo studio, abbiamo progettato e valutato varie combinazioni di primer e sonde per il rilevamento efficace, accurato e simultaneo di SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B e SARS-CoV-2, MERS-CoV utilizzando RNA virali sintetici a torsione standard. I test multiplexati sviluppati per i geni bersaglio di MERS-CoV o SARS-CoV-2 sono raccomandati dall'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS). Questi geni generalmente codificano proteine e complessi che contribuiscono alla formazione di un complesso di replicazione/trascrizione (RTC)35 come la regione all'interno del frame di lettura aperto 1a (ORF1a) utilizzato per il test MERS-CoV. Inoltre, le proteine strutturali sono codificate dai geni utilizzati nei saggi diagnostici come il gene della regione a monte dell'involucro (upE) e il gene del nucleocapside (N) che vengono utilizzati rispettivamente per i saggi MERS-CoV e SARS-Cov-235,36. Abbiamo utilizzato il kit RT-qPCR R3T one-step interno per stabilire la RT-qPCR per il rilevamento dei virus37. Il rilevamento dei virus, la sensibilità, la specificità e la gamma dinamica del nostro kit RT-qPCR R3T one-step e dei set di primer sono stati testati e valutati utilizzando diluizioni seriali di 10 volte degli RNA sintetici twist standard. Il limite di rilevamento pratico più basso era di circa 10 copie di trascrizioni per reazione. Di conseguenza, il kit RT-qPCR one-step R3T e i set di primer/sonde possono essere utilizzati e implementati con successo per la diagnosi simultanea di routine di SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B e SARS-CoV-2, MERS-CoV.

Protocollo

1. Espressione e purificazione della Taq polimerasi

  1. Costruire un plasmide con un tag esa-istidina separabile all'estremità C dell'enzima.
  2. Trasformare 50 ng del vettore di espressione nel ceppo di E. coli BL21-(DE3) seguendo il protocollo standard38.
  3. Inoculare le cellule trasformate in quattro matracci da 6 L contenenti ciascuno 2 L di brodo di terreno 2YT a 37 °C agitando a 170 giri/min fino a raggiungere il OD 600 di 0,8 o il numero di cellule 6,4 x 108 .
  4. Indurre l'espressione della Taq polimerasi con 0,5 mM di isopropil-β-d-tiogalattopiranoside (IPTG) e incubare ulteriormente a 16 °C per 18 ore con agitazione.
  5. Raccogliere le cellule facendole girare a 4 °C a 7808 x g per 10 min. Risospendere i pellet in 200 mL di un tampone di lisi Taq polimerasi ghiacciato (Tabella 1) in 5 mL/g di pellet cellulare.
  6. Incubare le cellule con lisozima (2 mg/mL di tampone di lisi) e inibitori della proteasi per 45 minuti, quindi far passare il lisato attraverso un interferente cellulare a 30 kPsi e centrifugare a 22.040 x g per 30 minuti a 4 °C per separare i detriti cellulari.
  7. Riscaldare il surnatante per 15 minuti a 85 °C. Centrifugare a 95.834 x g per 1 h a 4 °C. Raccogliere il surnatante e filtrarlo su ghiaccio utilizzando un filtro da 0,45 μm.
  8. Eseguire la purificazione delle proteine utilizzando la cromatografia liquida rapida delle proteine (FPLC) facendo passare prima il campione attraverso una colonna Ni-NTA HP da 5 mL a una velocità di flusso di 4 mL/min utilizzando il tampone Taq polimerasi A (Tabella 2; Figura 1A).
  9. Lavare con 10 volumi di colonna (CV) di tampone Taq polimerasi A e 4% di tampone Taq polimerasi B (Tabella 2). Eluire la proteina legata con un gradiente lineare utilizzando il tampone Taq polimerasi B oltre 20 CV in un flacone da 100 ml.
  10. Far passare l'eluente nel flacone da 100 mL attraverso una colonna a scambio cationico da 5 mL a 4 mL/min utilizzando il tampone Taq polimerasi C (Tabella 2; Figura 1A).
  11. Lavare con 20 CV di tampone Taq polimerasi 100% C e tampone Taq polimerasi Taq D al 5% (Tabella 2).
  12. Eluire con un gradiente lineare utilizzando il tampone Taq polimerasi D (Tabella 2) a partire dal 5% al 100%.
  13. Controllare le frazioni eluite eseguendo l'elettroforesi su gel SDS-PAGE 39 seguita da colorazione con gel 40 come descritto in precedenza. In breve, prelevare 10 μL di ciascuna frazione e aggiungere un volume uguale di 2x colorante di carico SDS. Denaturare il campione a 90oC per 10 min. Caricare i campioni su gel SDS-PAGE al 10% e far scorrere il gel per 25 minuti a 200 V. Colorare il gel con Coomassie Brilliant Blue e poi decolorare.
  14. Raccogliere tutte le frazioni che contengono Taq polimerasi purificata e dializzarle con il tampone di conservazione della taq polimerasi (Tabella 3) a 4 °C. Preparare brevemente 2 L del tampone di conservazione e immergere la cassetta di dialisi nel tampone per 2 minuti per idratare. Iniettare le frazioni raccolte con un ago nella cassetta di dialisi e lasciarle per una notte nel tampone di dialisi a 200 giri/min sull'agitatore.
  15. Dopo la dialisi, misurare la concentrazione proteica con uno spettrofotometro, fare aliquote di 10 μL, congelare in azoto liquido e conservare a -80 °C.
    NOTA: Filtrare tutti i tamponi per la purificazione utilizzando un filtro da 0,45 μm prima di caricarli nel sistema FPLC.

2. Espressione di MMLV-RT nel sistema di espressione e purificazione delle cellule di insetto

  1. Generazione e isolamento del DNA bacmidico
    1. Clonare la sequenza di MMLV-RT con un tag TEV-8xHis-Strep c-terminale con scissione C, come descritto in precedenza41.
    2. Miscelare 100 ng del vettore di espressione in 50 μL di cellule DH10Bac e mescolare delicatamente picchiettando la provetta.
    3. Incubare le cellule su ghiaccio per 15 min. Eseguire uno shock termico delle celle per 1 minuto a 42 °C.
    4. Trasferire immediatamente su ghiaccio e aggiungere 400 μL di terreno S.O.C. Incubare a 37 °C agitando per 4 ore.
    5. Piastra da 10 μL e 15 μL della miscela su piastre LB Agar contenenti tre antibiotici; 50 μg/mL di Kanamicina, 10 μg/mL di Tetraciclina e 7 μg/mL di Gentamicina insieme a 40 μg/mL di IPTG e 100 μg/mL di X-Gal per la selezione blu-bianca.
    6. Incubare le piastre a 37 °C per 48 ore. Raccogli diverse colonie bianche e una colonia blu come controllo e ri-striale su piastre di agar LB fresche contenenti gli antibiotici di cui sopra. Incubare le piastre per una notte a 37 °C.
    7. Dopo aver confermato il fenotipo bianco, prelevare un paio di colonie e inocularle in 10 mL di terreno LB contenente 50 μg/mL di Kanamicina, 10 μg/mL di tetraciclina e 7 μg/mL di gentamicina in provette da 50 mL.
    8. Incubare la coltura a 37 °C agitando a 170 giri/min per una notte. Pellet le cellule facendole girare a 22.040 x g per 10 min.
    9. Decantare il surnatante e risospendere il pellet in 250 μL di soluzione di risospensione dal kit miniprep (questa soluzione deve essere maneggiata secondo le istruzioni del produttore), quindi trasferire la soluzione in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL.
    10. Aggiungere 250 μL di soluzione di lisi, mescolare delicatamente e incubare per 3 minuti. Aggiungere 350 μL di soluzione neutralizzante, capovolgere 2x-3x e centrifugare a 22.040 x g per 10 min.
    11. Trasferire il surnatante in una provetta fresca e aggiungere un volume uguale di isopropanolo ghiacciato e incubare per 30 minuti a -20 °C.
    12. Pellet lungo il DNA precipitato ruotando a 22.040 x g per 10 min. Scartare il surnatante e lavare il pellet con 700 μL di etanolo ghiacciato al 70%, 2x.
    13. Rimuovere il surnatante con una pipetta senza toccare il pellet. Lasciare asciugare il pellet all'aria nella cappa a flusso laminare per 5-10 minuti o fino a quando non si vede più liquido nel tubo. Sciogliere il pellet in 100 μL di tampone EB.
  2. Trasfezione bacmidica e amplificazione del virus
    1. Preparazione del virus P1
      1. In una piastra di coltura tissutale a 6 pozzetti, seminare ~ 9 x 105 cellule/pozzetto in 2 mL di terreno di coltura di cellule di insetto.
      2. Incubare la piastra per ~30 minuti a temperatura ambiente per consentire alle cellule di attaccarsi.
      3. Preparare la miscela Bacmid/Fugene come segue: mescolare 1 μg di DNA Bacmid e 300 μL di terreno di coltura di cellule di insetto in una provetta. In un'altra provetta, mescolare 8 μL di reagente di trasfezione e 300 μL di terreno per cellule di insetto. Miscelare entrambe le miscele mediante pipettaggio delicato e lasciare agire per ~30 minuti a temperatura ambiente per la formazione del complesso reagente bacmid/trasfezione.
      4. Aggiungere la miscela di complesso bacmidico (~210 μL) a ciascun pozzetto goccia a goccia e sigillare la piastra con una pellicola trasparente.
      5. Incubare la piastra a 27 °C per 3-4 giorni.
      6. Prelevare il terreno che contiene il virus, aggiungere FBS (concentrazione finale 2%), filtrare con filtro da 0,45 μm e conservare al buio a 4°C come riserva di virus P1.
    2. Preparazione del virus P2
      1. Trasfettare 50 mL di cellule di insetto a 2 x 106 cellule/mL con 3 mL di virus P1 in un pallone di coltura.
      2. Incubare a 27 °C con agitazione a 100 rpm per 4-6 giorni fino a quando la percentuale di cellule morte raggiunge il 25%-30%.
      3. Centrifugare a 300 x g per 10 min e raccogliere il surnatante che contiene il virus.
      4. Aggiungere FBS a una concentrazione finale del 2%, filtrare attraverso un filtro da 0,45 μm e un'aliquota da 1 mL ciascuno e conservare a -80 °C come riserva di virus P2.
    3. Preparazione del virus P3
      1. Trasfettare 100 mL di cellule di insetto a 2 x 106 cellule/mL con 2 mL di virus P2 in un pallone di coltura.
      2. Incubare a 27 °C agitando a 100 rpm per 3-4 giorni fino a quando la percentuale di cellule morte raggiunge il 15%-20%.
      3. Centrifugare le cellule a 300 x g per 10 min e raccogliere il surnatante che contiene il virus.
      4. Aggiungere FBS ad una concentrazione finale del 2%. Filtrare attraverso un filtro da 0,45 μm. Può essere conservato al buio a 4 °C per 1 mese.
  3. Espressione e purificazione di MMLV-RT in cellule di insetto
    1. Aggiungere 5 mL di virus P3 alle cellule fresche di insetto ad una densità di 2 x 106 cellule/mL (700 mL/2L di pallone) in un totale di 6 palloni.
    2. Raccogliere le cellule dopo 55-60 h di post-trasfezione facendo filare a 7808 x g per 10 min.
    3. Risospendere i pellet cellulari in 200 mL di tampone di lisi MMLV-RT (Tabella 4). Far passare il lisato attraverso un disgregatore cellulare a 15 kPsi e centrifugare a 22.040 x g per 30 minuti a 4 °C.
    4. Trasferire il surnatante in nuove provette e centrifugare nuovamente a 95,834 x g a 4 °C per 1 h. Raccogliere il surnatante e filtrarlo su ghiaccio utilizzando un filtro da 0,45 μm.
    5. Avviare la purificazione delle proteine utilizzando FPLC facendo passare prima il campione attraverso la colonna Ni-NTA Excel da 5 mL (Figura 1B) a una velocità di flusso di 4 mL/min utilizzando il tampone MMLV-RT A (Tabella 5).
    6. Lavare la colonna con 10 CV di tampone MMLV-RT A e 4% di tampone MMLV-RT B (Tabella 5) ed eluire la proteina con il gradiente lineare del tampone MMLV-RT B su 20 CV in un flacone da 100 ml.
    7. Far passare il campione eluito attraverso la colonna Strep 5 mL (Figura 1B) bilanciata con il tampone MMLV-RT C (Tabella 5).
    8. Lavare la colonna con 10 CV di tampone C 100% MMLV-RT ed eluire la proteina con un gradiente lineare con 20 CV di tampone D (Tabella 5).
    9. Controllare le frazioni eluite eseguendo SDS-PAGE come nei passaggi 1.13.-1.14. e raccogliere le frazioni che contengono MMLV-RT purificate da dializzare rispetto al tampone di conservazione MMLV-RT (Tabella 6) a 4 °C.
    10. Misurare la concentrazione proteica utilizzando Nanodrop, aliquota, congelare istantaneamente in azoto liquido e conservare a -80 °C.
      NOTA: Filtrare tutti i tamponi per la purificazione utilizzando un filtro da 0,45 μm prima di caricarli nel sistema FPLC.

3. Preparazione dei componenti del kit RT-qPCR multisala R3T one-step in-house

  1. Preparazione della miscela tampone
    1. Preparare il tampone 2x per la reazione RT-qPCR che contiene i reagenti precedentemente mostrati in37. Preparare tutti i reagenti in acqua priva di DNasi/RNasi e la miscela tampone conservata in un congelatore a -20 °C.
  2. Set di primer e sonde e preparazione della miscela di primer
    NOTA: Le sonde e i primer utilizzati sono elencati nella Tabella 7. Il kit multiplexato per l'influenza e il SARS-CoV-2 contiene 3 sonde e 4 set di primer diretti e inversi. Le sonde sono etichettate alle estremità 5′ utilizzando i reporter 6-carbossifluoresceina (FAM) per InfA, Texas Red-XN per SARS-CoV-2 (gene N) e Yakima Yellow per InfB. Il kit multiplexato MERS-CoV e SARS-CoV-2 contiene 3 sonde e 3 set di primer diretti e inversi. Le sonde sono anche marcate alle estremità 5′ utilizzando i reporter Texas Red-XN per MERS-CoV (gene ORF1a), VIC per MERS-CoV (gene UpE) e 6-carbossifluoresceina (FAM) SARS-CoV-2 (gene N).
    1. Preparare una miscela di primer contenente tutti i primer e le sonde elencati nella Tabella 7 con una concentrazione finale di 6,7 μM per ciascun primer diretto e inverso e 1,25 μM per ciascuna sonda in una provetta da 1,5 mL. Conservare la miscela di primer nel congelatore a -20 °C. Utilizzare il tampone di eluizione per ottenere il volume richiesto.
  3. Preparazione della miscela enzimatica
    1. Preparare la miscela enzimatica Taq polimerasi (30 U/μL) e MMLV-RT (60 ng/μL) nel tampone di conservazione della Taq polimerasi come mostrato nella Tabella 3 per ottenere il volume richiesto. Eseguire questo passaggio su ghiaccio e conservare la miscela enzimatica a -20 °C.
  4. Modello di RNA
    1. Risospendere separatamente gli RNA sintetici di SARS-CoV-2, Influenza A H1N1, Influenza A H3N2, Influenza B e MERS-CoV in 100 μL di 1x tampone Tris-EDTA (10 mM Tri-Cl e 1 mM EDTA (pH 8,0) per ottenere una scorta di 1 x 106 copie di RNA/μL.
    2. Miscelare RNA sintetici per RT-qPCR nelle seguenti configurazioni: 1) SARS-CoV-2, influenza A e influenza B aggiungendo 5 μL di ciascun stock virale a un volume di 50 μL per ottenere 1 x 105 copie di RNA/μL; 2) SARS-CoV-2, MERS-CoV aggiungendo 5 μL di ciascun ceppo virale a un volume di 50 μL per ottenere 1 x 105 copie di RNA/μL. Effettuare diluizioni seriali di 10 volte di ciascuna miscela di RNA sintetico che vanno da 1 x 105 copie di RNA/μL a 10 copie di RNA/μL.
      NOTA: Assicurarsi di utilizzare acqua ghiacciata priva di DNasi/RNasi per preparare la diluizione seriale dei modelli.

4. Test RT-qPCR in un'unica fase di SARS-CoV-2, influenza A, influenza B e SARS-CoV-2 multiplexato in-house

NOTA: Disinfettare le superfici della workstation e utilizzare un modello di piastra a 96 pozzetti per pianificare il layout della piastra PCR.

  1. Preparazione della piastra a 96 pozzetti
    1. Scongelare 2 volte il tampone e la miscela di primer. Tenere la miscela di enzimi sul ghiaccio.
    2. A ciascun pozzetto, aggiungere 10 μL di miscela tampone 2x, 1,5 μL della miscela primer, 1 μL di miscela enzimatica, 6,5 μL di acqua priva di DNasi/RNasi e 1 μL della corrispondente miscela di RNA che deve essere testata. Il volume finale in ogni pozzetto è di 20 μL. Fare riferimento al layout preparato per assistenza in questo passaggio.
      NOTA: Si consiglia di creare una miscela master in base al numero di reazioni che contengono tutti i reagenti tranne il campione di RNA per evitare distorsioni di pipettaggio. Inoltre, eseguire le reazioni in duplicato o triplice per evitare errori tecnici.
    3. Sigillare la piastra con un sigillo adesivo per piastre PCR e centrifugare brevemente per 1 minuto per raccogliere tutto il liquido sul fondo della piastra. Assicurarsi che ogni pozzetto abbia lo stesso volume di liquido e sia privo di bolle prima di trasferire i campioni alla macchina qPCR.
      NOTA: Tutte le reazioni PCR devono essere impostate su ghiaccio.
  2. Programma PCR
    1. Aprire il programma della macchina qPCR in tempo reale e scegliere le seguenti proprietà sperimentali:
      Il tipo di blocco: Fast a 96 pozzetti (0,1 mL)
      Impostazione dell'esperimento: Curva standard
      Reagenti: Reagenti TaqMan
      Proprietà esecuzione: Standard.
    2. Definire tutti i bersagli genici e il loro colorante reporter come presentato nella Tabella 7. Inoltre, definire i nomi dei campioni per ogni reazione da testare per facilitare l'analisi delle curve di amplificazione.
    3. Assegnare target e campioni al layout della piastra del programma in base alla piastra a 96 pozzetti.
    4. Impostare il seguente programma di ciclo nello strumento PCR come segue:
      55 °C per 10 min
      40 cicli: 94 °C per 1 min
      94 °C per 10 s
      68 °C per 10 s
      68 °C per 20 s; qui acquisiscono la fluorescenza.
    5. Trasferire la piastra alla macchina qPCR in tempo reale e posizionarla nel supporto assicurandosi del corretto orientamento della piastra e avviare la corsa.
    6. Scegliere il percorso del file in cui salvare i dati sperimentali.
  3. Analisi dei dati
    1. È essenziale esaminare prima i diagrammi di amplificazione prodotti dal programma qPCR. Analizzare il limite di rilevamento per valutare la concentrazione minima di RNA che può essere rilevata.
    2. Tracciare il log del numero di copie di RNA sull'asse x e il corrispondente valore medio di Ct sull'asse y per valutare la sensibilità del saggio. La pendenza e l'R2 indicano l'affidabilità e l'efficienza della reazione.

Risultati

Negli ultimi anni, ci sono stati progressi significativi nell'approccio diagnostico per rilevare i virus respiratori comuni utilizzando gli approcci PCR 21,22,23,24,25. Tuttavia, nonostante questi progressi, l'approccio multiplexato, che consente di rilevare più virus in un singolo test, non è stato ampiamente implementato, in particolare nella piattaforma R...

Discussione

Il sistema sanitario di tutto il mondo è gravoso dal pesante onere economico derivante dagli elevati tassi di infezione e mortalità dovuti alla diffusione di virus respiratori comuni come le varianti SARS-CoV-2, Influenza A/B e MERS-CoV 12,19,20. Motivati dal senso di responsabilità verso l'alleggerimento di questo onere, ci siamo resi conto della necessità di un test diagnostico rapido, preciso e accessibile come la RT-qPCR...

Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalla King Abdullah University of Science and Technology attraverso il finanziamento di base e il National Term Grand Challenge (NTGC) a SMH.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
0.45 μm filter cupsThermo Scientific291-4545
10X Tris-Glycine SDS running bufferNovexLC2675
6-well tissue culturing platesCorning353046
Ammonium sulfateFisher ScientificA701-3
AmpicillinCorning61-238-RH
Cation exchange (HiTrap SP HP) 5 mLCytiva17-1152-01
D-(+)-Biotin, 98+%Thermo ScientificA14207.60
DH10Bac competent cellsFisher Scientific10361012
Dialysis bag (Snakeskin 10,000 MWC)Thermo Scientific68100
Dithiothreitol (DTT)Thermo ScientificR0862
Dnase/Rnase Free Distilled WaterAmbionAM9930
dNTPsThermo ScientificR0192
E. coli BL21(DE3) competent cellsInvitrogenC600003
EDTAFisher ScientificBP120-1
Elution BufferQiagen19086
ESF 921 insect cell culture medium (Insect cells media)Expression Systems96-001-01
FBS SolutionGibcoA38400-01
Fugene (transfection reagent)PromegaE2311
GentamicinFisher Scientific15750060
GlycerolSigma AldrichG5516-500
IGEPAL CA-630Sigma AldrichI8896-100ml
ImidazoleSigma Aldrich56750-1Kg
Influenza A (H1N1) synthetic RNATwist Bioscience103001
Influenza A (H3N2)  synthetic RNATwist Bioscience103002
Influenza B synthetic RNATwist Bioscience103003
IPTGGold BiotechnologyI3481C100
KanamycinGibco11815-032
LB AgarFisher ScientificBP1425-500
LB Broth mediaFisher ScientificBP1426-500
LysozymeSigma AldrichL6876-10G
Magnesium ChlorideSigma Aldrich13152-1Kg
MERS-CoV synthetic RNATwist Bioscience103015
MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction plates with Barcode (0.1 mL)Applied Biosystems10310855
Mini- PROTEAN TGX Precast GelBio-Rad456-1093
Miniprep kitQiagen27106
Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mLCytiva17-3712-06
Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mLCytiva17-5248-02
Optical Adhesice Covers (PCR Compatible,DNA/Rnase/PCR Inhibitors FreeApplied Biosystems4311971
Potassium ChlorideFisher BioreagentsBP366-1
Primers and ProbesIntegrated DNA Technologies, Inc.
Protease Inhibitor Mini tablets EDTA-FreeThermo ScientificA32955
Protein markerFermentas26616
RT-qPCR machine (QuantStudio 7 Flex)Applied Biosystems
S.O.C mediumFisher Scientific15544034
SARS-CoV-+A2:C442 synthetic RNATwist Bioscience102024
Sf9 insect cellsGibcoA35243
Sodium ChlorideSigma AldrichS3014-1Kg
StrepTrap XT 5 mLCytiva29401323
TetracyclineIBI ScientificIB02200
Tris Base Molecular Biology GradePromegaH5135
Tris-HClAffymetrix22676
Tween 20Sigma AldrichP1379-100ml
X-GalInvitrogenB1690

Riferimenti

  1. Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19. Nat Rev Microbiol. 19 (3), 141-154 (2021).
  2. Zhu, N., et al. A novel Coronavirus from patients with Pneumonia in China, 2019. N Engl J Med. 382 (8), 727-733 (2019).
  3. Huang, C., et al. Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China. Lancet. 395 (10223), 497-506 (2020).
  4. Wu, F., et al. A new coronavirus associated with human respiratory disease in China. Nature. 579 (7798), 265-269 (2020).
  5. Yang, S., et al. Deep learning for detecting corona virus disease 2019 (COVID-19) on high-resolution computed tomography: a pilot study. Ann Transl Med. 8 (7), 450 (2020).
  6. El Hassan, M., et al. A review on the transmission of COVID-19 based on cough/sneeze/breath flows. Eur Phys J Plus. 137 (1), 1 (2022).
  7. . WHO Coronavirus (COVID-19) Dashboard Available from: https://covid19.who.int (2023)
  8. Kucharski, A. J., et al. Effectiveness of isolation, testing, contact tracing, and physical distancing on reducing transmission of SARS-CoV-2 in different settings: a mathematical modelling study. Lancet Infect Dis. 20 (10), 1151-1160 (2020).
  9. Reddy, K. P., et al. Cost-effectiveness of public health strategies for COVID-19 epidemic control in South Africa: a microsimulation modelling study. Lancet Glob Health. 9 (2), e120-e129 (2021).
  10. Cheng, H. Y., et al. Contact tracing assessment of COVID-19 transmission dynamics in Taiwan and risk at different exposure periods before and after symptom onset. JAMA Intern Med. 180 (9), 1156-1163 (2020).
  11. Kretzschmar, M. E., et al. Impact of delays on effectiveness of contact tracing strategies for COVID-19: a modelling study. Lancet Public Health. 5 (8), e452-e459 (2020).
  12. Krammer, F., et al. Influenza. Nat Rev Dis Primers. 4 (1), 3 (2018).
  13. Yang, J., et al. Prevalence of comorbidities and its effects in patients infected with SARS-CoV-2: a systematic review and meta-analysis. Int J Infect Dis. 94, 91-95 (2020).
  14. Lansbury, L., Lim, B., Baskaran, V., Lim, W. S. Co-infections in people with COVID-19: a systematic review and meta-analysis. J Infect. 81 (2), 266-275 (2020).
  15. Zaki, A. M., van Boheemen, S., Bestebroer, T. M., Osterhaus, A. D., Fouchier, R. A. Isolation of a novel coronavirus from a man with pneumonia in Saudi Arabia. N Engl J Med. 367 (19), 1814-1820 (2012).
  16. Azhar, E. I., et al. Evidence for camel-to-human transmission of MERS coronavirus. N Engl J Med. 370 (26), 2499-2505 (2014).
  17. Ling, Y., Qu, R., Luo, Y. Clinical analysis of the first patient with imported Middle East respiratory syndrome in China. Zhonghua Wei Zhong Bing Ji Jiu Yi Xue. 27 (8), 630-634 (2015).
  18. Nazer, R. I. Outbreak of Middle East Respiratory Syndrome-Coronavirus causes high fatality after cardiac operations. Ann Thorac Surg. 104 (2), e127-e129 (2017).
  19. Huang, P., et al. A rapid and specific assay for the detection of MERS-CoV. Front Microbiol. 9, 1101 (2018).
  20. Ezhilan, M., Suresh, I., Nesakumar, N. SARS-CoV, MERS-CoV and SARS-CoV-2: A diagnostic challenge. Measurement (Lond). 168, 108335 (2021).
  21. Ulloa, S., et al. A simple method for SARS-CoV-2 detection by rRT-PCR without the use of a commercial RNA extraction kit. J Virol Methods. 285, 113960 (2020).
  22. Kudo, E., et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA by multiplex RT-qPCR. PLoS Biol. 18 (10), e3000867 (2020).
  23. Norz, D., Hoffmann, A., Aepfelbacher, M., Pfefferle, S., Lutgehetmann, M. Clinical evaluation of a fully automated, laboratory-developed multiplex RT-PCR assay integrating dual-target SARS-CoV-2 and influenza A/B detection on a high-throughput platform. J Med Microbiol. 70 (2), 001295 (2021).
  24. Yun, J., et al. Evaluation of three multiplex real-time reverse transcription PCR assays for simultaneous detection of SARS-CoV-2, Influenza A/B, and Respiratory Syncytial virus in nasopharyngeal swabs. J Korean Med Sci. 36 (48), e328 (2021).
  25. Lu, X., et al. Real-time reverse transcription-PCR assay panel for Middle East respiratory syndrome coronavirus. J Clin Microbiol. 52 (1), 67-75 (2014).
  26. Broughton, J. P., et al. CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nat Biotechnol. 38 (7), 870-874 (2020).
  27. Ali, Z., et al. iSCAN: An RT-LAMP-coupled CRISPR-Cas12 module for rapid, sensitive detection of SARS-CoV-2. Virus Res. 288, 198129 (2020).
  28. Ali, Z., et al. Bio-SCAN: A CRISPR/dCas9-based lateral flow assay for rapid, specific, and sensitive detection of SARS-CoV-2. ACS Synth Biol. 11 (1), 406-419 (2022).
  29. Yoshimi, K., et al. CRISPR-Cas3-based diagnostics for SARS-CoV-2 and Influenza virus. iScience. 25 (2), 103830 (2022).
  30. Chen, Z., et al. Rapid and sensitive detection of anti-SARS-CoV-2 IgG, using Lanthanide-doped nanoparticles-based lateral flow immunoassay. Anal Chem. 92 (10), 7226-7231 (2020).
  31. Kasetsirikul, S., et al. Detection of the SARS-CoV-2 humanized antibody with paper-based ELISA. Analyst. 145 (23), 7680-7686 (2020).
  32. Joung, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 with SHERLOCK One-Pot testing. N Engl J Med. 383 (15), 1492-1494 (2020).
  33. Chen, Z., Wu, Q., Chen, J., Ni, X., Dai, J. A DNA aptamer based method for detection of SARS-CoV-2 nucleocapsid protein. Virol Sin. 35 (3), 351-354 (2020).
  34. Jang, W. S., et al. Development of a multiplex Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) assay for on-site diagnosis of SARS CoV-2. PLoS One. 16 (3), e0248042 (2021).
  35. McBride, R., Fielding, B. C. The role of Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS)-Coronavirus accessory proteins in virus pathogenesis. Viruses-Basel. 4 (11), 2902-2923 (2012).
  36. AlBalwi, M. A., et al. Evolving sequence mutations in the Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV). J Infection Public Health. 13 (10), 1544-1550 (2020).
  37. Takahashi, M., et al. Quick and easy assembly of a One-Step qRT-PCR Kit for COVID-19 diagnostics using In-House enzymes. ACS Omega. 6 (11), 7374-7386 (2021).
  38. Sambrook, J., Fritsch, E. R., Maniatis, T. . Molecular cloning: A laboratory manual (2nd ed.). , (1989).
  39. Simpson, R. J. SDS-PAGE of Proteins. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
  40. Simpson, R. J. Staining proteins in gels with Coomassie blue. CSH Protoc. 2007, (2007).
  41. Takumi Yano, J. M. L., et al. Expression of the thermostable Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase by silkworm-baculovirus expression system. J Asia-Pac Entomol. 22 (2), 453-457 (2019).
  42. van Kasteren, P. B., et al. Comparison of seven commercial RT-PCR diagnostic kits for COVID-19. J Clin Virol. 128, 104412 (2020).
  43. Shu, B., et al. Multiplex Real-Time reverse transcription PCR for Influenza A virus, Influenza B virus, and Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2. Emerg Infect Dis. 27 (7), 1821-1830 (2021).
  44. Engelke, D. R., Krikos, A., Bruck, M. E., Ginsburg, D. Purification of Thermus aquaticus DNA polymerase expressed in Escherichia coli. Anal Biochem. 191 (2), 396-400 (1990).
  45. Pabbaraju, K., Wong, A. A., Ma, R., Zelyas, N., Tipples, G. A. Development and validation of a multiplex reverse transcriptase-PCR assay for simultaneous testing of Influenza A, Influenza B and SARS-CoV-2. J Virol Methods. 293, 114151 (2020).
  46. Hirotsu, Y., et al. Analysis of COVID-19 and non-COVID-19 viruses, including Influenza viruses, to determine the influence of intensive preventive measures in Japan. J Clin Virol. 132, 104634 (2020).
  47. Sellner, L. N., Coelen, R. J., Mackenzie, J. S. Reverse-Transcriptase inhibits Taq Polymerase-Activity. Nucleic Acids Res. 20 (7), 1487-1490 (1992).

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