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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo protocollo di previsione della modellazione dell'omologia degli anticorpi è seguito dal docking Pyrx del recettore anticorpo e dalla simulazione dinamica molecolare. Questi tre metodi primari vengono utilizzati per visualizzare con precisione le aree di legame anticorpo-recettore e la stabilità di legame della struttura finale.

Abstract

Gli anticorpi a frammentazione variabile a catena singola (scFv) sono stati precedentemente costruiti con catene leggere e pesanti variabili unite da un linker (Gly4-Ser) 3. Il linker è stato creato utilizzando un software di modellazione molecolare come struttura ad anello. Qui, introduciamo un protocollo per l'analisiin silico di un anticorpo scFv completo che interagisce con il recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR). La modellazione dell'omologia, con Pyrx del docking proteina-proteina e la simulazione dinamica molecolare dell'anticorpo scFv interagente e dell'EGFR In primo luogo, gli autori hanno utilizzato un programma di modellazione della struttura proteica e Python per la modellazione dell'omologia, e la struttura dell'anticorpo scFv è stata modellata per l'omologia. I ricercatori hanno scaricato il software Pyrx come piattaforma nello studio di attracco. La simulazione dinamica molecolare è stata eseguita utilizzando un software di modellazione. I risultati mostrano che quando la simulazione MD è stata sottoposta a minimizzazione dell'energia, il modello proteico aveva l'energia di legame più bassa (-5,4 kcal/M). Inoltre, la simulazione MD in questo studio ha mostrato che l'anticorpo EGFR-scFv agganciato era stabile per 20-75 ns quando il movimento della struttura aumentava bruscamente a 7,2 Å. In conclusione, è stata eseguita l'analisi in silicoe le simulazioni di docking molecolare e dinamica molecolare dell'anticorpo scFv hanno dimostrato l'efficacia del farmaco immuno-terapeutico scFv come terapia farmacologica specifica per l'EGFR.

Introduzione

I cambiamenti conformazionali nella proteina (ligando e recettore) si verificano sempre in base a funzioni basate sulla struttura. Lo studio dei possibili solchi di legame della proteina e la previsione dell'interazione di legame stabile è un metodo avanzato per preparare farmaci per un migliore utilizzo nel corpo umano. La modellazione dell'omologia seguita dal docking e dalla simulazione dinamica molecolare è un metodo semplice per la previsione accurata delle interazioni stabili di legame tra i residui dei recettori e gli anticorpi costruiti che vengono utilizzati come medicina personalizzata specifica 1,2. La struttura del modello previsto può mostrare cambiamenti conformazionali e riarrangiamenti nei siti di legame ligando-recettore, in particolare all'interfaccia anticorpo-recettore. Ci sono molte ragioni per questi cambiamenti, come la rotazione delle catene laterali, la trasformazione strutturale globale o modifiche più complesse. La ragione principale per la modellazione dell'omologia è distinguere la struttura terziaria di una proteina dalla sua struttura primaria 2,3.

Un recettore tirosin-chinasico chiamato recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) svolge molti ruoli biologici nelle cellule tumorali, tra cui l'apoptosi 4,5, la differenziazione 6,7, la progressione del ciclo cellulare 8,9, lo sviluppo 9,10 e la trascrizione11. L'EGFR è uno dei bersagli terapeutici più noti per il cancro al seno12. La sovraespressione dell'attività chinasica regolare come l'EGFR di solito porta alla progressione delle cellule tumorali, che può essere repressa da molti tipi di inibitori del cancro13. Il recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) è stato utilizzato come recettore per la variabile del frammento a catena singola appositamente costruita per lavorare contro questo recettore. La sua struttura prevista è stata utilizzata per testare l'attività di legame degli anticorpi.

In questo articolo, la struttura dell'anticorpo scFv è stata modellata utilizzando un software di modellazione con script Python e il metodo di modellazione dell'omologia14,15. Un modello di omologia può essere costruito dalle sequenze proteiche e amminoacidiche di recettori e ligandi16,17. Inoltre, sono state impiegate tecnologie bioinformatiche avanzate come il docking molecolare per prevedere come i ligandi di piccole molecole si legheranno al corretto sito di legame del bersaglio. L'attracco bilancerebbe lo sviluppo di nuovi farmaci diretti contro molteplici malattie. Viene preso in considerazione il comportamento di associazione 5,18.

Inoltre, il docking molecolare è una tecnica fondamentale per facilitare e accelerare lo sviluppo del legame ligando-recettore. L'aggancio molecolare consente agli scienziati di esaminare virtualmente una libreria di ligandi contro una proteina bersaglio e di prevedere le conformazioni e le affinità di legame dei ligandi con la proteina del recettore bersaglio. La simulazione dinamica molecolare (MNS) dimostra come i residui si muovono nello spazio, simula i movimenti degli anticorpi verso i loro recettori e infine informa gli sforzi di progettazione degli anticorpi. Questo studio è una nuova previsione delle dimensioni della grid box che ha deciso come l'anticorpo scFv si lega all'EGFR e il rilevamento dell'energia e del tempo di tale legame nella simulazione MD.

Protocollo

1. Predizioni della struttura secondaria di una proteina a singola variabile di frammento di catena (scFv)

  1. Costruisci la struttura 3D della proteina scFv (single-chain fragment variable) con la banca dati delle proteine BLAST (PDB), la numerazione KABAT e il software di modellazione. L'scFv è costituito da un linker (Gly4-Ser) che collega una catena pesante variabile (VH) e una catena leggera variabile (VL).
  2. Utilizzare il software di modellazione molecolare per costruire il linker come una struttura ad anello ed eseguire tutti questi metodi come descritto negli studi precedenti 2,19,20.

2. Selezione del modello e previsione della struttura 3D scFv ed EGFR e modellazione dell'omologia

  1. Scegli il modello 1ivo per le strutture EGFR (in base alla sua alta risoluzione). Scaricare il file 1ivo.pdb dal sito Web pdb, come illustrato nella Figura 1B.
  2. Preparare il file di input 1ivo.pdb come descritto di seguito.
    1. Nel file 1ivo.pdb, rimuovere tutti i ligandi esterni aprendo il sito Web pdb.org e selezionando 1ivo. Struttura, e cercando il nome dei ligandi sotto il titolo della piccola molecola nella pagina della struttura 1ivo del sito web pdb.
    2. Trova il nome del ligando NAG. Apri il file 1ivo.pdb scaricato dal sito web di pdb e trova il residuo di terminazione (TER.).
    3. Eliminare i residui dei leganti esterni nella struttura 1ivo, partendo dal residuo dopo la TER e prima che il residuo finisca. Salvare il file 1ivo.pdb nel sistema.
  3. Preparare il file 1ivo.pdb salvato come descritto di seguito.
    1. Scaricare il software di aggancio Autodock (autodock.scripps.edu) dall'area di selezione della finestra. Fare clic su Apri file 1ivo.pdb.
    2. Utilizzare il comando Modifica per scegliere Aggiungi idrogeno > Aggiungi, quindi selezionare Solo polare, quindi premere Ok.
    3. Utilizzare il comando Modifica per aggiungere le spese di Kollman (Figura 1 supplementare). Utilizzare il comando Modifica per eliminare l'acqua. Salvare il file 1ivo.pdb sul pc.
  4. Ridurre al minimo l'energia della struttura 1ivo.pdb come descritto di seguito.
    1. Scarica SPDBV. software da http://spdbv.vital-it.ch/disclaim.html. Aprire il file 1ivo.pdb.
    2. Seleziona tutto. Selezionare il comando Perf > Minimizzazione dell'energia > Ok (Figura 2 supplementare). Salva il file 1ivo sul pc.
  5. Preparare l'scFv del modello completo utilizzando la modellazione per omologia come descritto di seguito.
    1. Scarica il software di modellazione17 e la shell dello script Python 3.7.9 da Window-64. Conservare i file del software scaricato nell'unità D.
  6. Preparare i file di input come descritto di seguito.
    1. Caricare il file scFv Pdb in formato fasta dal sito NCBI e rinominare il file TARGET.ali. come descritto nel file di codifica supplementare 1. Scegliere il modello utilizzando la sezione Blast in NCBI, incollare il file sequenziato, selezionare in formato pdb 7det.pdb come descritto in File di codifica supplementare 2, quindi inviare. Quindi, utilizza il sito Web pdb.org per ottenere il file modello.
    2. Preparare il terzo file di input come align2d.py (Python) come descritto nel file di codifica supplementare 3, che si apre come illustrato nella Figura 3A supplementare. Premi l'opzione Mostra altro, quindi vai su Modifica con IDLE > Modifica con EDLE (64 bit). Eseguire utilizzando il comando run module 5 nel align2d.py per ottenere due file di output: Tar- 7det.ali e Tar- 7det.pap.
  7. Completare i tre passaggi precedenti per utilizzare il comando nell'ultimo file di input.
  8. Aggiungere un nuovo file di input model-single.py (file python di comando) come mostrato nel file di codifica supplementare 4 e come descritto di seguito.
    1. Premi l'opzione Mostra altro, quindi vai su Modifica con IDLE > Modifica con EDLE3.7 (64 bit). Eseguire utilizzando il comando (run module 5) come illustrato nella Figura 3B supplementare.
      NOTA: I file di output risultanti sono i sei file dei modelli di omologia mostrati nella Figura 3C supplementare.

3. Previsione e valutazione della struttura secondaria del recettore

  1. Rileva la correzione e l'accuratezza dei modelli di omologia come descritto di seguito.
    1. Crea il grafico di Ramachandran per i modelli scFv e EGFR scaricando lo strumento di visualizzazione da https://discover.3ds.com/discovery-studio-visualizer-download.
    2. Aprire il file, quindi fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare la sequenza di visualizzazione (Figura 4 supplementare). Copiare la sequenza e incollarla nel database pittorico delle strutture 3D (pdbsum) www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/pdbsum/.
    3. Seleziona Cerca per sequenza, incolla la copia della sequenza, quindi inviala. Create il grafico come mostrato nella Figura 1B, D.

4. Docking proteina-proteina

  1. Scarica il software dello strumento di screening virtuale.
  2. Vai su File> Leggi molecole > carica 1ivo.pdb. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla proteina nel pannello autodock per creare una macromolecola. Fare nuovamente clic con il pulsante destro del mouse per creare un ligando (Figura supplementare 5).
  3. Fare clic nel pannello autodock per selezionare la proteina , quindi selezionare il ligando.
  4. Apri l'elenco delle proteine. Quindi, dall'elenco, selezionare scFv Protein.
  5. Vai su Attiva/disattiva selezione sfere. Regolare la scatola della griglia al centro del recettore. Fare clic su Avanti quando viene visualizzato il pulsante rosa rotondo.
  6. Per preparare i file pdbqt sia per le strutture degli anticorpi scFv che per quelle dell'EGFR (1ivo), attenersi alla seguente procedura.
    1. Vai su C Drive > Programmi (86) > Utenti, quindi scegli il file pyrx che contiene le macromolecole e i file di output delle proteine che sono stati salvati come file pdbqt.
    2. Quindi, salvare il file dell'anticorpo pdbqt scFv (single-chain fragment variable).
  7. Scarica il software PyMOL su PyMOL | pymol.org. Utilizzare il software PyMOL per mostrare le configurazioni dell'EGFR dell'anticorpo-recettore scFv.
    1. Vai al file e apri C:\Users\ilham\.mgltools\PyRx\Macromolecules\protein. Preparare le configurazioni di docking del anticorpo scFvvinteragendo con il recettore nella Figura 2A come descritto di seguito.
      1. Utilizzare l'opzione di visualizzazione per mostrare il file del recettore (1ivo) come residui di sequenza con uno sfondo bianco mostrato nella Figura 6 supplementare.
      2. Visualizza il file di configurazione dell'aggancio con una risoluzione più alta per vedere il colore del ligando nei colori dei residui verdi e rossi. Visualizza la superficie rigida del recettore (1ivo) in giallo.
  8. Preparare le configurazioni di docking dell'anticorpo scFvantibodyche interagisce con il recettore nella Figura 2B, come descritto di seguito.
    1. Scaricare il software di aggancio dall'area di selezione della finestra. Utilizzare Autodock per mostrare le configurazioni e le conformazioni dell'EGFR del recettore anticorpo scFv.
      1. In Autodock, scegli l'opzione Analizza, quindi apri il risultato Autodock Vina. Vai su File e apri C:\Users\ilham\.mgltools\PyRx\Macromolecules\protein.
      2. Selezionare il file pdb del recettore proteico, quindi selezionare l'area della configurazione del ligando (struttura dell'anticorpo scFv). Collegare la superficie rigida del recettore con la configurazione della struttura agganciata e nascondere il resto del recettore. Nascondere i residui lontani del recettore dai residui collegati al ligando, come mostrato nella Figura 2B.
    2. Il complesso proteina-proteina è stato quindi considerato pronto per eseguire la simulazione MD.

5. Simulazione dinamica molecolare (simulazione MD) del complesso di docking degli anticorpi EGFR-scFv

  1. Scarica il software di simulazione MD e usalo come segue.
    1. Preparare il file pdb EGFR (1ivo) utilizzando la procedura guidata di riparazione come nella Figura 7A supplementare. Utilizzate la sezione di pre-elaborazione per perfezionare il file. Inviare il file raffinato da impostare nel system builder.
    2. Caricare il software di simulazione di dinamica molecolare dalla directory di lavoro. Aggiungere gli ioni e aggiornare il file raffinato per raggiungere 20 Å per inviare il lavoro (Tabella 1), mostrato anche nella Figura 7B supplementare.
    3. Caricare il pdb EGFR (1ivo) dal file importato, quindi scegliere i timesteps di 100 ns per eseguirlo (Figura 7C supplementare).
  2. Avviare l'analisi della simulazione dopo il completamento della simulazione MD come descritto di seguito.
    1. Crea una cartella di lavoro e salvala nel file cms . Caricare il file cms per eseguire questo passaggio nella simulazione MD.
    2. Creare una directory di lavoro per le cartelle di progetto e riportare i valori energetici. Utilizzare S.I.D. pdf per segnalare la simulazione, come mostrato nella Figura 3A, e il diagramma di interazione e il legame H, come mostrato nella Figura 3B.
    3. Carica il file pdf di cms navigando dalla cartella e utilizza TIP3P come modello per la minimizzazione del volume dei file.
    4. Creare il file di solvatazione per eseguire questo passaggio mostrato nella Figura 7D supplementare. Salva il file pdf tramite il software e analizza i dati, ottenendo la Figura 4, la Figura 5 e la Figura 6.
  3. Generare un'impostazione di finalizzazione MDsimulation creando il file di risoluzione. Individuare i risultati nel riquadro di delimitazione, come illustrato nella Figura 7.

Risultati

Utilizzando la tecnologia del phage display, il gene scFv anti-EGFR è stato creato dalla linea di ibridoma a cellule B di topo C3A820,21. I modelli di struttura a frammento variabile a catena singola (scFv) delle strutture VH e VL sono stati costruiti separatamente, secondo Chua et al.22. Successivamente, i modelli sono stati visibili come nastri prodotti utilizzando RasMol. Quindi, utilizzando un softwar...

Discussione

L'EGFR è il principale recettore bersaglio del cancro al seno. La sovraespressione di EGFR aumenta i casi di cancro al seno in tutto il mondo. Nel frattempo, gli anticorpi specifici come le variabili a frammento di catena singola sono anticorpi che si muovono facilmente attraverso la circolazione sanguigna e hanno un rapido tasso di eliminazione nel corpo. Gli anticorpi sono una soluzione saggia e un efficace farmaco immunoterapico37. Pertanto, la progettazione d...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Nessuno.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Autodock softwareCenter for Computational structural Biology AutoDock (scripps.edu)
Desmond Maestro 19.4 software Schrodingerwww.schrodinger.com 
Download Discovery Studio 2021  Dassault Systems https://discover.3ds.com/discovery-studio-visualizer-download.
Modeler Version 9.24[17] University of Californiahttps://salilab.org/modeller/9.24/release.html
Pictorial database of 3D structures (pdbsum)EMBL-EBI www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/pdbsum/
PyMOL software SchrodingerPyMOL | pymol.org
Pyrx software Sourceforge Download PyRx - Virtual Screening Tool (sourceforge.net)
Python script 3.7.9 shell from the window (64)PythonPython Release Python 3.7.9 | Python.org
SPDBV software Expasyhttp://spdbv.vital-it.ch/disclaim.html

Riferimenti

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