Isolamento delle cellule primarie di Müller gliali retiniche di topo

Riepilogo

Questo manoscritto descrive un protocollo dettagliato per isolare le cellule di Müller gliali retiniche dagli occhi di topo. Il protocollo inizia con l'enucleazione e la dissezione degli occhi di topo, seguita dall'isolamento, dalla semina e dalla coltura delle cellule di Müller.

Abstract

La principale cellula di supporto della retina è la cellula gliale retinica di Müller. Coprono l'intera superficie retinica e sono in prossimità sia dei vasi sanguigni retinici che dei neuroni retinici. A causa della loro crescita, le cellule di Müller svolgono diversi compiti cruciali in una retina sana, tra cui l'assorbimento e il riciclaggio di neurotrasmettitori, composti dell'acido retinoico e ioni (come il potassio K+). Oltre a regolare il flusso sanguigno e a mantenere la barriera emato-retinica, regolano anche il metabolismo e l'apporto di sostanze nutritive alla retina. In questo manoscritto viene presentata una procedura consolidata per l'isolamento delle cellule primarie di Müller di topo. Per comprendere meglio i processi molecolari sottostanti coinvolti nei vari modelli murini di disturbi oculari, l'isolamento delle cellule di Müller è un approccio eccellente. Questo manoscritto delinea una procedura dettagliata per l'isolamento delle cellule di Müller dai topi. Dall'enucleazione alla semina, l'intero processo dura circa poche ore. Per 5-7 giorni dopo la semina, il terreno non deve essere cambiato per consentire alle cellule isolate di crescere senza ostacoli. La caratterizzazione cellulare utilizzando la morfologia e i distinti marcatori di immunofluorescenza viene dopo nel processo. I passaggi massimi per le celle sono 3-4 volte.

Introduzione

Le cellule di Müller (MC) sono le principali e più abbondanti cellule gliali presenti nel tessuto retinico. Sono i principali attori nel fornire integrità strutturale e funzioni metaboliche all'interno della retina¹. La struttura strategica delle MC è distribuita su tutto lo spessore della retina, fornendo così supporto alla retina. Oltre alle loro proprietà simili a impalcature, hanno funzioni metaboliche per i neuroni retinici, fornendo loro substrati energetici, tra cui glucosio e lattato. Queste funzioni sono fondamentali per mantenere una sana funzione neuronale. È stato riportato che le MC compromesse contribuiscono a varie malattie della retina, tra cui la degenerazione maculare legata all'età, la retinopatia diabetica e il glaucoma ^2,3. Le MC possono essere fonti cellulari endogene per la terapia rigenerativa nella retina¹. Comprendono anche una parte significativa della retina e forti prove suggeriscono che in diverse specie, queste cellule possono essere stimolate a sostituire i neuroni mancanti². Collaborano in modo benefico con i neuroni e le estremità delle cellule di Müller, ramificate coniche, disintegrano densamente i vasi sanguigni e collegano i componenti neurali della retina. Al fine di mantenere lo sviluppo neuronale e la plasticità neuronale, le cellule di Müller agiscono come un substrato morbido per i neuroni, proteggendoli dai traumi meccanici³. Inoltre, in circostanze patologiche, le cellule di Müller possono differenziarsi in progenitori neurali o cellule staminali che replicano o rigenerano i fotorecettori e i neuroni persi ^2,3,4. Le cellule di Müller conservano le caratteristiche delle cellule staminali retiniche, inclusi diversi livelli di potenziale di autorinnovamento e differenziazione ^5,6. La cellula gliale di Müller ha un significativo lignaggio retinico che produce fattori neurotrofici, assorbe e ricicla i neurotrasmettitori, tampona spazialmente gli ioni e mantiene la barriera emato-retinica per mantenere la retina in omeostasi ^7,8,9. Ciò evidenzia il potenziale delle cellule di Müller come strumento promettente nelle terapie cellulari per il trattamento di malattie legate alla degenerazione retinica. Le cellule di Müller sono la glia primaria distribuita in tutta la retina, che si collega sia ai neuroni che ai vasi sanguigni. Svolgono un ruolo protettivo cruciale, fornendo un supporto strutturale e metabolico essenziale per mantenere la vitalità e la stabilità delle cellule retiniche. Purtroppo, in letteratura si trovano pochissimi protocolli per l'isolamento primario delle cellule di Müller dalla retina^10,11.

Presentiamo un approccio avanzato per isolare e coltivare in modo affidabile le cellule primarie di Müller di topo. Questo protocollo è stato utilizzato nel nostro gruppo per isolare le cellule di Müller dai topi C57BL/6 wild-type e dai topi transgenici^12,13. Per questo protocollo vengono utilizzati topi di età compresa tra 5 e 11 giorni, senza preferenze di sesso. Le celle sono state attraversate fino a 4 volte; tuttavia, a P4 smettono di aderire al pallone e diventa difficile coltivare una coltura sana. La coltura è spesso contaminata da cellule epiteliali pigmentate retiniche (RPE), quindi le cellule devono essere fatte passare almeno una volta prima di eseguire ulteriori esperimenti sulla linea cellulare. Il passaggio consente un ulteriore isolamento dai contaminanti. Pertanto, il protocollo presentato offre un modo rapido ed efficace per isolare le cellule di Müller di topo, che possono quindi essere utilizzate come piattaforma affidabile per la ricerca di bersagli terapeutici e la valutazione di potenziali trattamenti per le malattie della retina¹⁴.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti con gli animali sono conformi alla dichiarazione ARVO per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e visiva e sono stati eseguiti seguendo il nostro protocollo sugli animali approvato dall'Institute for Animal Care and Use Committee (IACUC) e dalle politiche dell'Università di Oakland (numero di protocollo 2022-1160)

1. Preparazione dei terreni e della soluzione

1. Preparare la soluzione Müller cell eye integrando il Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM, dettagli nella tabella dei materiali) con penicillina/streptomicina alla diluizione di 1:1000. Ad esempio, per 10 ml di DMEM, aggiungere 10 μl di penicillina/streptomicina.
   NOTA: Questo è un semplice terreno di coltura senza siero preparato. Inoltre, riscaldare l'intero terreno in un bagno d'acqua a 37 °C prima di utilizzarlo per il lavoro di coltura cellulare.
2. Preparare un terreno di coltura cellulare Müller primario completo integrando DMEM con il 10% di siero fetale bovino (FBS, inattivato termicamente) e l'1% di penicillina/streptomicina. Ad esempio (500 ml di terreno DMEM + 50 ml di FBS + 5 ml di penicillina/streptomicina).
3. Preparare una soluzione di tripsina-EDTA allo 0,05% con collagenasi IV a una concentrazione di 200 U/mL (la tripsina-EDTA viene utilizzata per sciogliere la quantità calcolata di collagenasi IV polvere per raggiungere la concentrazione necessaria).

2. Enucleazione

1. Sopprimere eticamente il topo utilizzando l'inalazione di CO₂ seguendo le linee guida IACUC.
   1. In breve, posizionare l'animale (o gli animali) nella camera CO₂ per introdurre il 100% di CO₂ a una velocità di riempimento del 30-70% del volume / min della camera con CO₂ per raggiungere l'obiettivo di una rapida perdita di coscienza entro 2-3 minuti con il minimo disagio per i topi.
   2. Poiché i topi sono in giovane età (~ 10 giorni), eseguire la lussazione cervicale come metodo secondario per garantire una corretta eutanasia.
2. Dopo aver sterilizzato l'area di lavoro con etanolo al 70%, posizionare il mouse su un sottopiede sterile.
3. Estrarre gli occhi posizionando le braccia delle pinzette nella parte posteriore dell'occhio, tirando delicatamente dall'area orbitale ed enucleando gli occhi applicando pressione con una pinzetta stile 5/45 sull'area orbitale per causare la proptosi.
   NOTA: Sterilizzare gli strumenti di dissezione con etanolo al 70% seguito da soluzione salina tampone fosfato prima della dissezione.
4. Assicurarsi che il nervo ottico sia ancora collegato all'occhio enucleando lentamente l'occhio. Assicurati di tirare il nervo ottico (identificato visivamente come un cordone bianco) dietro l'occhio.
   NOTA: Questo passaggio non deve essere eseguito al microscopio e può essere eseguito su un banco sterilizzato.

3. Trattamento degli occhi enucleati

1. Coprire una provetta da centrifuga da 15 mL con un foglio di alluminio e riempire la provetta con 10 mL della soluzione oculare cellulare Müller.
2. Porre gli occhi sezionati nella provetta da 15 mL contenente la soluzione per l'occhio cellulare di Müller e lasciarli riposare per una notte, o circa 18 ore, a temperatura ambiente.
3. Dopo 18 ore, decantare la soluzione oculare e sciacquare brevemente gli occhi con 2-3 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) riscaldata (37 °C).
4. Decantare il PBS e spostare gli occhi su una piastra di Petri da 100 mm contenente 10 ml di soluzione di tripsina. (preparato al punto 1.3).
   NOTA: La tripsina viene utilizzata su tutto l'occhio enucleato, agendo come agente dissociativo per facilitare la separazione cellulare dagli strati retinici durante la dissezione. La retina sezionata ha molte cellule, comprese le cellule RPE, che sono appiccicose e hanno maggiori probabilità di contaminare la coltura cellulare di Müller¹⁴. L'esame microscopico ha dimostrato chiaramente che dopo 5 giorni di isolamento (durante il primo cambio di terreno), le cellule RPE si sono staccate dalla piastra e sono morte¹³. Il terreno utilizzato per l'isolamento dell'RPE è il DMEM/F-12, con una composizione diversa rispetto al DMEM (utilizzato nell'isolamento delle cellule di Müller), contenente piruvato di sodio e basso contenuto di glucosio.
5. Mettere la capsula in un'incubatrice e incubare per 1,5-2 ore a 37 °C e 5% di CO₂.
6. Dopo l'incubazione, trasferire gli occhi in una piastra di Petri da 60 mm contenente circa 5 mL di terreno di coltura cellulare Müller primario completo.

4. Dissezione

NOTA: Questa procedura deve essere eseguita all'interno dell'ambiente sterile della cappa di coltura. Pertanto, è essenziale sterilizzare accuratamente le superfici della cappa con alcol al 70%, insieme a tutti gli strumenti e al microscopio di dissezione. Vale la pena notare che il video è stato registrato all'esterno del cofano per una migliore visibilità e una dimostrazione più chiara.

1. Metti un piccolo pezzo di tessuto sterilizzato da laboratorio nel piatto per aiutare a stabilizzare gli occhi durante la dissezione. Posizionare gli occhi sotto un microscopio da dissezione per iniziare la dissezione.
   NOTA: L'uso di tessuto di laboratorio facilita la manovra degli occhi in un piatto pieno di liquido (terreno completo), garantendo una dissezione precisa.
2. Usa le forbici Vannas e le pinzette in stile M5S per rimuovere il tessuto connettivo, i muscoli extraoculari e il nervo ottico.
   1. Afferra l'occhio con una pinzetta stile M5S e fai un'incisione nella sezione ora serrata con le forbici Vannas o l'ago di una siringa.
      NOTA: C'è una linea circolare azzurra tra la parte anteriore e quella posteriore dell'occhio chiamata ora serrata, che può essere utilizzata come punto di riferimento per una direzione accurata durante la dissezione.
   2. Afferrare l'incisione con una pinzetta stile M5S e tirare o strappare la cornea dalla parte posteriore dell'occhio. Tirare in piccoli incrementi per garantire che l'integrità della retina rimanga intatta.
      NOTA: Questi passaggi servono a rimuovere la parte anteriore dell'occhio (cornea, iride e cristallino) dalla parte posteriore della conchiglia oculare (retine neurali e pigmentate).
   3. Per mantenere l'integrità degli strati retinici, tirare delicatamente e rimuovere l'epitelio pigmentato retinico dalla retina neurale. La retina neurale dovrebbe essere priva di macchie nere per garantire il più possibile la purezza dell'isolamento, poiché lo strato di RPE è solitamente appiccicoso e attaccato alla retina neuronale.
   4. Tagliare la retina neurale sezionata in piccoli pezzi prima di raccoglierla in una piastra per garantire una diffusione omogenea delle cellule sulla piastra.
3. Placcare le retine neurali in un pallone T25 contenente 4 mL di terreno di crescita delle cellule Müller primarie complete.
4. Infine, porre il matraccio in un incubatore e incubare a 37 °C e 5% di CO₂.

5. Coltura di cellule gliali primarie di Müller

1. Non spostare il pallone per 3-5 giorni per favorire la crescita cellulare.
2. Cambiare il terreno dopo il quinto giorno e successivamente a giorni alterni fino a quando le celle non sono confluenti al 90%.

6. Passaggio di cellule gliali primarie di Müller

1. Aspirare il terreno di coltura cellulare Müller, seguito da 2 mL di lavaggio in PBS, e aspirare il PBS. Aggiungere 2 mL di tripsina-EDTA allo 0,25% (1x), o quanto basta per coprire la piastra.
2. Incubare per 5-10 minuti a temperatura ambiente.
3. Assicurarsi che le cellule siano staccate dalla piastra al microscopio. Quindi, raccogliere la sospensione cellulare e aggiungere 4 mL di terreno di coltura cellulare Müller primario completo preriscaldato (37 °C) (preparato nella fase 1.2) nella provetta di raccolta.
4. Centrifugare per 7 min a 300 x g. Dopo aver aspirato il surnatante, risospendere il pellet in 10 mL di terreno di coltura cellulare Müller primario completo. Poiché il numero di cellule può variare in base al numero di occhi sezionati, quindi, è meglio contare le cellule prima della semina e dell'incubazione. La densità di semina consigliata è di 3,0 x 10⁶ celle in un pallone T75.
   NOTA: Le celle possono essere passate fino a 4-5 volte. Tuttavia, i risultati più coerenti dell'esperimento si trovano dopo 1-2 passaggi.

7. Immunofluorescenza

NOTA: Utilizzare il protocollo di immunofluorescenza per colorare e convalidare la specificità delle cellule di Müller. Ecco una breve panoramica del protocollo di immunofluorescenza. Questo passaggio viene eseguito dopo il primo passaggio¹².

1. Seminare le cellule in un vetrino per camera di coltura cellulare (30.000 cellule per pozzetto per un vetrino da 8 pozzetti).
2. Coltura delle cellule isolate per 24-48 ore in un terreno di coltura cellulare Müller completo (preparato nella fase 1.2) a 37 °C e 5% di CO₂.
3. Aspirare il terreno e lavare il vetrino della camera con 250-300 μl di 1x PBS su ciascun pozzetto quando le celle sono confluenti all'80-90%.
4. Fissare il vetrino per 10-15 minuti in 250-300 μl di paraformaldeide al 4% su ciascun pozzetto, quindi lavare con PBS/TX-100 (5 minuti ciascuno/3x).
5. Aggiungere il tampone di blocco per 1 ora a 37 °C (vedere la tabella dei materiali).
6. Aspirare la soluzione bloccante, quindi aggiungere gli anticorpi primari specifici per le cellule di Müller per confermare la purezza delle cellule isolate utilizzando glutammina sintetasi e vimentina ^5,12. Incubare per 3 ore a 37 °C (utilizzando una concentrazione di anticorpi di 1:100-1:200 in tampone bloccante in un volume di 150-200 μL/vetrino). Lavare il vetrino con lavaggi PBS/TX-100 (5 e 10 minuti ciascuno).
   NOTA: Questi anticorpi sono stati scelti in quanto sono segni distintivi per identificare le cellule di Müller e garantire il successo e la purezza della coltura cellulare di Müller.
7. Aggiungere l'anticorpo secondario (con una concentrazione di anticorpi compresa tra 1:1000 in tampone bloccante in un vetrino da 150-200 μl/vetrino) e incubare per 1 ora a 37 °C. Quindi, lavare con PBS/Triton X-100, tre volte (5-10 minuti ciascuna).
8. Applicare una goccia di terreno di montaggio DAPI per etichettare i nuclei prima di coprire il vetrino con un vetrino coprioggetti. Evitare la formazione di bolle d'aria quando si posiziona il vetrino coprioggetti.
9. Utilizzare un microscopio a fluorescenza per controllare il vetrino e acquisire le immagini (vedi Tabella dei materiali).
   NOTA: le celle sono localizzate con DAPI a ex/em 359/461 con ingrandimento 10x per localizzare le celle; Un ingrandimento più elevato può catturare le cellule. Altre lunghezze d'onda dipenderebbero dal colore scelto. Colore verde (GFP) - ex/em 488/510. Colore rosso (Cy3) - ex/em 555/569.

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Risultati

Validazione della specificità, della purezza e della funzione barriera delle cellule di Müller isolate
Per confermare la vitalità, la morfologia e le qualità distintive delle cellule di Müller isolate, le cellule sono state esaminate al microscopio ottico. Sono state registrate immagini P0 e P1 (Figura 1A). Per verificare la contaminazione delle cellule Müller isolate con le cellule RPE e confermarne la purezza, è stata eseguita la colorazione in immunofluorescenza...

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Discussione

L'isolamento dell'epitelio pigmentato retinico primario (RPE) dai topi è stato precedentemente documentato dal nostro laboratorio. Questo manoscritto descrive un protocollo dimostrativo dettagliato per l'isolamento delle cellule primarie di Müller. Questa procedura prevede l'enucleazione, il trattamento, la dissezione, la raccolta, la semina, la coltura e la caratterizzazione delle cellule di Müller isolate dagli occhi di topo. Si basa su un protocollo precedentemente riuscito trovato in pubblicazioni precedenti e sul...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beaker : 100mL	KIMAX	14000
Collagenase IV	Worthington	LS004188
Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile		13-711-20
DMEM (1X)	Thermo Scientific	11885084	Media to grow Müller cells
Fetal Bovine Serum (FBS)	gibco	26140079	For complete Muller cell culture media
Glutamine synthase	Cell signalling	80636
Heracell VISO 160i CO2 Incubator	Thermo Scientific	50144906
Kimwipes	Kimberly-Clark	34155
Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL	B-D	309577
Micro Centrifuge Tube: 2 mL	Grainger	11L819
Pen Strep	gibco	15140-122	For complete Müller cell culture media
Phosphate Buffer saline (PBS)	Thermo Scientific	J62851.AP
Positive Action Tweezers, Style 5/45	Dumont	72703-DZ
Scissors Iris Standard Straight 11.5cm	GARANA INDUSTRIES	2595
Sorvall St8 Centrifuge	ThermoScientific	75007200
Stemi 305 Microscope	Zeiss	n/a
Surgical Blade, #11, Stainless Steel	Bard-Parker	371211
Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style	Corning	430589
Tissue Culture Dish : 100x20mm style	Corning	353003
Tornado Tubes: 15mL	Midsci	C15B
Tornado Tubes: 50mL	Midsci	C50R
Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09x0.05mm Tips	Dumont	501764
Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL	Electron Microscopy Sciences Dumont	50-241-57
Underpads, Moderate : 23" X 36"	McKesson	4033
Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge	FST	15000-08
Vimentin	invitrogen	MA5-11883
Zeiss AxioImager Z2	Zeiss	n/a
Zeiss Zen Blue 2.6	Zeiss	n/a