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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo protocollo presenta il differenziamento degli osteoclasti umani dalle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) e descrive i metodi per la caratterizzazione degli osteoclasti e dei precursori degli osteoclasti.

Abstract

Questo protocollo descrive in dettaglio la propagazione e il passaggio delle iPSC umane e la loro differenziazione in osteoclasti. In primo luogo, le iPSC vengono dissociate in una sospensione unicellulare per un ulteriore utilizzo nell'induzione del corpo embrioide. A seguito dell'induzione mesodermica, i corpi embrioidi subiscono una differenziazione ematopoietica, producendo una popolazione di cellule ematopoietiche fluttuanti. Successivamente, le cellule ematopoietiche prelevate subiscono una fase di maturazione del fattore stimolante le colonie di macrofagi e, infine, il differenziamento degli osteoclasti. Dopo la differenziazione degli osteoclasti, gli osteoclasti sono caratterizzati dalla colorazione per TRAP in combinazione con una colorazione nucleare verde metile. Gli osteoclasti sono osservati come policarioni TRAP+ multinucleati. La loro identificazione può essere ulteriormente supportata dalla colorazione con la catepsina K. I saggi di riassorbimento osseo e minerale consentono la caratterizzazione funzionale, confermando l'identità degli osteoclasti in buona fede. Questo protocollo dimostra un metodo robusto e versatile per differenziare gli osteoclasti umani dalle iPSC e ne consente una facile adozione in applicazioni che richiedono grandi quantità di osteoclasti umani funzionali. Potrebbero essere previste applicazioni nei settori della ricerca sulle ossa, sul cancro, sull'ingegneria tissutale e sulla ricerca sulle endoprotesi.

Introduzione

Gli osteoclasti (OC) sono tipi di cellule di derivazione ematopoietica 1,2, versatili che sono comunemente usati dai ricercatori in aree come la ricerca sulle malattie ossee 3,4, la ricerca sul cancro 5,6, l'ingegneria tissutale 7,8 e la ricerca sull'endoprotesi 9,10. Ciononostante, il differenziamento degli OC può essere impegnativo in quanto la fusione di precursori mononucleari in OC multinucleati è necessaria per creare OC funzionali11. Diversi fattori biologici, come l'attivatore del recettore del ligando NF-κB (RANKL) e il fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF), sono necessari per la differenziazione dell'OC. È stato riportato che M-CSF ha un effetto positivo sulla proliferazione cellulare, sulla sopravvivenza cellulare e sull'espressione di RANK 12,13,14. D'altra parte, RANKL si lega a RANK, che attiva cascate di segnalazione a valle che inducono l'osteoclastogenesi. L'attivazione è mediata dal fattore 6 associato al recettore del TNF (TRAF6), che porta alla degradazione del fattore nucleare del potenziatore genico del polipeptide leggero kappa nell'inibitore delle cellule B, alfa (IκB-α), una proteina legante che lega i dimeri NF-kB16,17. Quindi, la degradazione di IκB-α rilascia dimeri di NF-kB, che poi traslocano nel nucleo e inducono l'espressione dei fattori di trascrizione c-Fos e del fattore nucleare delle cellule T attivate 1 (NFATc1). Questo, a sua volta, innesca la trascrizione di una moltitudine di proteine correlate al differenziamento OC15,18. Le proteine sovraregolate come DC-Stamp e Atp6v0d2 mediano la fusione cellula-cellula dei precursori OC, portando alla formazione del sincizio 19,20,21.

Per quanto riguarda le cellule primarie umane, le PBMC CD34+ e CD14+ sono attualmente i tipi cellulari più utilizzati per il differenziamento in OC22. Tuttavia, questo approccio è limitato dall'eterogeneità all'interno della popolazione CD34+ di cellule raccolte da donatori23 e dalla loro limitata espandibilità. Le iPSC umane rappresentano una fonte alternativa per gli OC. Poiché possono essere propagati indefinitamente24, consentono l'espandibilità e l'upscaling della produzione di OC. Ciò consente la differenziazione di un gran numero di OC, il che facilita la ricerca OC.

Sono stati pubblicati diversi protocolli per la differenziazione delle iPSC in OC 25,26,27. L'intero processo di differenziazione può essere suddiviso in una parte di propagazione delle iPSC, una parte di differenziazione mesodermica ed ematopoietica e una parte di differenziazione OC. La propagazione delle iPSC prima del processo di differenziazione consente l'aumento della produzione di OC prima della differenziazione. Esistono diversi approcci per quanto riguarda il differenziamento mesodermico ed ematopoietico. Tradizionalmente, la formazione di corpi embrioidi (EB) è stata utilizzata per differenziare le cellule ematopoietiche, ma gli approcci basati sul monostrato rappresentano un'altra strategia di differenziamento ematopoietico che non richiede l'induzione di EB. Ciononostante, i sistemi basati su monostrato sembrano richiedere un'ulteriore ottimizzazione, poiché noi e altri abbiamo trovato gli approcci basati sull'EB più robusti per la differenziazione degli OC.

Qui, descriviamo la differenziazione delle OC dalle iPSC umane utilizzando un protocollo basato su EB. Questo protocollo è stato adattato da Rössler et al.26 e modificato per aumentare la robustezza e consentire la crioconservazione durante il processo di differenziazione. In primo luogo, abbiamo raccolto cellule ematopoietiche solo una volta dopo 10 giorni di differenziazione. Le cellule ematopoietiche sono state quindi crioconservate per consentire una maggiore flessibilità durante il processo di differenziazione. Inoltre, abbiamo aumentato la densità di semina delle cellule ematopoietiche da 1 x 105 a 2 x 105 cellule/cm2 per la differenziazione OC. È stato utilizzato un terreno umano più recente privo di siero iPSC (hiPSC-SFM, vedi Tabella dei materiali) e il rivestimento dei pozzetti è stato eseguito con 200-300 μg/mL di un estratto di membrana basale (vedi Tabella dei materiali) invece dello 0,1% di gelatina. La penicillina/streptomicina non è stata aggiunta ai media.

Il protocollo di Rössler et al.26 è stato originariamente adattato da una iPSC a un protocollo di differenziazione dei macrofagi28 che utilizza la formazione di EB per la differenziazione ematopoietica. Mentre la formazione di EB è stata utilizzata per un lungo periodo di tempo dai ricercatori per la differenziazione ematopoietica29,30, in letteratura sono stati descritti diversi metodi di induzione di EB, come l'aggregazione spontanea, la centrifugazione in una piastra a pozzetti a fondo tondo, la coltura a goccia sospesa, la coltura di bioreattori, la coltura di tubi conici, il vaso laterale a rotazione lenta e la coltura di gel micromold31. Questo protocollo utilizza la centrifugazione di iPSC dissociate in una piastra a pozzetti a fondo tondo per avvicinare le singole cellule iPSC l'una all'altra e consentire la formazione di sfere (EB), come descritto di seguito.

Protocollo

NOTA: Tutti i reagenti utilizzati in questo protocollo sono riportati nella Tabella dei materiali. Se non diversamente specificato, tutti i fluidi sono stati pre-bilanciati a 37 °C prima dell'uso. Tutte le fasi di centrifugazione vengono eseguite a 37 °C e utilizzando la modalità di accelerazione/decelerazione più lenta. Se non diversamente specificato, il surnatante viene sempre rimosso utilizzando pipette di vetro Pasteur monouso.

1. Scongelamento e propagazione delle iPSC umane

  1. Un giorno prima dello scongelamento delle iPSC, rivestire un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti con 1 mL di un estratto di membrana basale a una concentrazione di 200-300 μg/mL. Posizionare la piastra a pozzetto a 4 °C per una notte.
  2. Il giorno successivo, scongelare e trasferire le cellule in una provetta da 15 ml utilizzando una pipetta P1000. A goccia, aggiungere 5-7 mL di DMEM/F-12 con 15 mM di HEPES.
  3. Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 min. Rimuovere delicatamente le cellule dalla centrifuga e assicurarsi di non disturbare il pellet cellulare.
  4. Rimuovere con cautela il surnatante con una pipetta di vetro Pasteur e risospendere le cellule in 1 mL di terreno privo di siero hiPSC (hiPSC-SFM contenente 10 μM di inibitore della Rho chinasi (ROCK) Y-27632) utilizzando P1000 con punte a foro largo.
  5. Aspirare l'estratto di membrana basale dal pozzetto rivestito il giorno precedente (passaggio 1.1) e trasferire 1 mL di hiPSC-SFM con 10 μM Y-27632 nel pozzetto. Aggiungere le iPSC risospese al pozzetto per raggiungere un volume finale di 2 mL per pozzetto.
  6. Agitare la piastra per distribuire uniformemente gli aggregati iPSC prima di metterli in un incubatore a 37 °C e 5% di CO2 .
  7. Eseguire cambi di terreno a giorni alterni utilizzando hiPSC-SFM (senza l'aggiunta dell'inibitore ROCK Y-27632). Le iPSC di solito raggiungono il 70-80% di confluenza dopo 3-4 giorni di propagazione.

2. Passaging di iPSC

  1. Un giorno prima del passaggio delle iPSC, rivestire i pozzetti di una piastra a 6 pozzetti con un estratto di membrana basale a una concentrazione di 200-300 μg/mL. Posizionare la piastra a pozzetto a 4 °C per una notte.
    NOTA: Verificare che le cellule abbiano raggiunto circa il 70-80% di confluenza. Assicurarsi che le iPSC non diventino eccessivamente confluenti (oltre l'80% di confluenza), in quanto ciò promuoverà la differenziazione spontanea.
  2. Iniziare a far passare le iPSC rimuovendo le regioni differenziate o le regioni con molti aggregati di iPSC morti sotto lo stereomicroscopio utilizzando puntali per pipette da 10 μL o 20 μL o un raschietto per cellule. Le regioni differenziate appariranno di colore più denso o più bianco.
    NOTA: Gli aggregati cellulari raschiati possono ancora attaccarsi parzialmente al fondo del pozzetto.
  3. Lavare più volte il fondo del pozzetto con una pipetta P1000 a foro largo per rimuovere eventuali aggregati che potrebbero essere ancora parzialmente attaccati al fondo del pozzetto.
  4. Scartare il terreno esaurito in cui sono state coltivate le iPSC che contiene gli aggregati di iPSC staccati. Ripetere la fase di lavaggio altre due volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
  5. Successivamente, aggiungere 1 mL di Dispase 5 U/mL per pozzetto. I bordi delle colonie di iPSC si solleveranno dalla piastra del pozzetto, che può essere osservata al microscopio stereoscopico dopo 3-5 minuti di incubazione a temperatura ambiente.
  6. Rimuovere con cautela Dispase per evitare di rimuovere gli aggregati leggermente staccati e aggiungere 1 mL di DMEM/F-12 con 15 mM di HEPES. Utilizzare un sollevatore cellulare monouso per tagliare gli aggregati in piccole dimensioni. La consistenza delle dimensioni degli aggregati di iPSC può essere migliorata con uno strumento di passaggio delle cellule staminali.
  7. Lavare via gli aggregati iPSC affettati con il terreno nel pozzetto e trasferire il terreno con gli aggregati in una provetta conica da 15 mL utilizzando una pipetta sierologica da 5 mL o P1000 con una punta a foro largo.
  8. Sciacquare il pozzetto con DMEM/F-12 e trasferire il terreno nella provetta da 15 mL con gli aggregati iPSC.
  9. Centrifugare gli aggregati di iPSC affettati a 200 x g per 3 minuti. Rimuovere il surnatante con una pipetta di vetro Pasteur e aggiungere 2 mL di hiPSC-SFM per rimuovere e risospendere le iPSC utilizzando una pipetta sierologica da 5 mL o P1000 con puntali a foro largo.
  10. Aspirare l'estratto di membrana basale rimanente dalle piastre a pozzetti prerivestite e aggiungere 1 mL di hiPSC-SFM a ciascun pozzetto della piastra a 6 pozzetti.
  11. Trasferire le iPSC in nuovi pozzetti di una piastra a 6 pozzetti in modo che il volume finale sia di 2 mL di hiPSC-SFM per pozzetto utilizzando un P1000 con punte a foro largo. A seconda della linea iPSC, i rapporti di divisione devono essere ottimizzati. In questo caso, è stato utilizzato un rapporto di divisione 1:6.
  12. Controllare il pozzetto per gli aggregati galleggianti e le dimensioni degli aggregati allo stereomicroscopio. Idealmente, la dimensione dell'aggregato dovrebbe essere compresa tra 50 e 200 μm.
  13. Agitare la piastra del pozzetto per distribuire uniformemente le cellule sulla piastra dopo che gli aggregati sono stati trasferiti e incubare a 37 °C al 5% di CO2 fino al 70-80% di confluenza.

3. Congelamento delle iPSC

  1. Per congelare le cellule iPSC, le cellule di passaggio come descritto sopra (vedere il passaggio del protocollo "2. Passaggio di iPSC"). Dopo che le cellule sono state tagliate in colonie e lavate via dal fondo del pozzetto (passaggio 2.10), centrifugare gli aggregati affettati a 200 x g per 3 minuti. Aspirare il surnatante.
  2. Aggiungere 1 mL di terreno di crioconservazione senza siero per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti alla provetta da 15 mL e risospendere gli aggregati affettati utilizzando un P1000 con punta a foro largo.
  3. Trasferire le cellule in criotubi preetichettati. Chiudere le provette e trasferire le provette in un contenitore di crioconservazione prerefrigerato a 4 °C. Conservare le cellule a -80 °C per 24-48 ore.
  4. Trasferisci crioviali in azoto liquido per la conservazione a lungo termine.
    NOTA: Un riepilogo schematico del processo di differenziazione OC è illustrato nella Figura 1.

4. Induzione del corpo embrioide

  1. Coltivare ed espandere un numero sufficiente di iPSC come descritto sopra per l'induzione dell'EB.
    NOTA: La produzione di OC può essere aumentata aumentando il numero di corpi embrioidi, che a loro volta producono una resa complessiva più elevata di cellule ematopoietiche. Un pozzetto di iPSC confluenti al 70-80% produce circa 8,4 x 105 cellule per pozzetto di un pozzetto a piastra a 6 pozzetti. Sono necessarie 12.500 iPSC unicellulari per formare un corpo embrioide.
  2. Aspirare il terreno esausto dalle colture di iPSC e risciacquare le colonie di iPSC con D-PBS.
  3. Aggiungere 0,5 mL di reagente di dissociazione a singola cellula preriscaldato a temperatura ambiente a ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e agitare il recipiente di coltura per rivestire l'intera superficie del pozzetto. Incubare il recipiente di coltura a 37 °C per 5-8 minuti.
  4. Rimuovere il recipiente dall'incubatore, aspirare il reagente di dissociazione a singola cellula e aggiungere 1 mL del terreno di differenziazione di fase 1 ai pozzetti, costituito da terreno privo di siero hiPSC con 50 ng/mL di proteina morfogenetica ossea umana 4 (hBMP4), 50 ng/mL di fattore di crescita endoteliale vascolare umano-165 (hVEGF), 20 ng/mL di fattore di cellule staminali umane (hSCF), e 10 μM Y-27632.
  5. Staccare delicatamente le cellule risciacquando il pozzetto con il terreno Stage 1. Raggruppare le iPSC dissociate in una provetta conica da 15 mL.
  6. Aggiungere 1 mL di terreno di differenziazione di fase 1 ai pozzetti e lavare via le cellule rimanenti o utilizzare un raschietto per cellule per le colonie che non si lavano via facilmente.
  7. Dopo aver trasferito tutte le cellule nella provetta, centrifugare a 200 × g per 5 minuti a temperatura ambiente per formare un pellet cellulare. Aspirare e risospendere le cellule in un totale di 2 mL di terreno di differenziazione prebilanciato Stage 1 utilizzando una pipetta sierologica da 5 mL o una P1000 con punta a foro largo.
  8. Conta le cellule utilizzando un emocitometro o un dispositivo automatico per il conteggio delle cellule. Aggiungere il terreno alla provetta da 15 mL contenente la sospensione a cellula singola per ottenere una piastra di 12.500 cellule per pozzetto in una piastra a 96 pozzetti a bassissimo attacco a fondo tondo in 100 μL del terreno di differenziazione di fase 1.
    NOTA: Al microscopio, le cellule appariranno come una sospensione unicellulare con cellule disperse in tutto il pozzetto.
  9. Centrifugare le piastre a 96 pozzetti per 3 minuti a 100 x g. Dopo la centrifugazione, le cellule dovrebbero iniziare ad assomigliare agli sferoidi se osservate al microscopio. Mettere la piastra in un incubatore a 37 °C per 24 ore.
  10. Cambiare metà del terreno il giorno 1 e il giorno 2 con il mezzo di differenziazione della fase 1. Per migliorare l'efficienza, utilizzare una pipetta multicanale per smaltire 50 μL del terreno di differenziazione esausto dello Stadio 1 in una capsula di Petri.
  11. Dopo aver smaltito il terreno dalla piastra a 96 pozzetti, verificare la presenza di EB sotto lo stereomicroscopio che potrebbero essere stati rimossi accidentalmente. Trasferire gli EB rimossi accidentalmente sulla piastra a 96 pozzetti utilizzando una pipetta P1000 con puntali a foro largo.
  12. Aggiungere 50 μL di terreno di differenziazione fresco di fase 1 a ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti con attacco ultrabasso a fondo tondo utilizzando una pipetta multicanale.

5. Differenziamento ematopoietico

  1. Un giorno prima di iniziare la differenziazione ematopoietica, rivestire un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti con 1 mL di un estratto di membrana basale a una concentrazione di 200-300 μg/mL. Posizionare la piastra a pozzetto a 4 °C per una notte.
    NOTA: Ogni pozzetto riceverà 8 EB in un secondo momento di questo protocollo. A seconda del numero di EB preparati, rivestire i pozzetti in modo corrispondente.
  2. Aspirare l'estratto di membrana basale in eccesso e preriempire i pozzetti della piastra a 6 pozzetti con 3 mL del terreno di differenziazione di Stadio 2, costituito da un terreno basale ematopoietico a cui vengono aggiunti 2 mM di ultraglutammina, 55 μM di 2-mercaptoetanolo, 25 ng/mL di interleuchina umana 3 (hIL-3) e 100 ng/mL di fattore stimolante le colonie di macrofagi umani (hM-CSF).
  3. Utilizzando un P1000 con punte a foro largo, trasferire 8 EB in ciascun pozzetto della piastra a 6 pozzetti. Dopo il trasferimento, confermare a occhio o sotto lo stereomicroscopio che in ogni pozzetto sono presenti 8 EB.
    NOTA: Dopo 1 giorno, gli EB galleggianti aderiranno al fondo del pozzo. Nei 5-7 giorni successivi, dovrebbe diventare visibile una popolazione cellulare fluttuante comprendente cellule ematopoietiche. Il periodo di differenziazione ematopoietica può essere variato, a partire da 7 giorni. La differenziazione per 10 giorni ha mostrato una popolazione ematopoietica composta da grandi sottopopolazioni CD45+, CD14+ e CD11b+ .
  4. Dopo 5 giorni di trattamento con il terreno di differenziazione di fase 2, eseguire un cambio di terreno rimuovendo il terreno esausto e distribuendolo in una provetta conica da 50 ml. Pipettare lentamente per cercare di rimuovere il minor numero possibile di cellule flottanti e mantenere lo sforzo di taglio il più basso possibile. Il pipettaggio al microscopio stereoscopico può aiutare a evitare la rimozione accidentale delle cellule.
  5. Aggiungere immediatamente 1 mL di terreno di differenziazione fresco Stage 2 ai pozzetti. Al fine di recuperare eventuali cellule ematopoietiche galleggianti che potrebbero essere già presenti a questo punto del processo di differenziazione, non scartare il mezzo erogato. Piuttosto, centrifugare la provetta con il mezzo esausto a 300 x g per 5 minuti e aspirare il surnatante.
  6. Aggiungere il terreno di differenziazione fresco di fase 2 alla provetta e risospendere per staccare le cellule che potrebbero essere state trasferite con il terreno esausto.
  7. Aggiungere 2 mL del terreno di differenziazione fresco di fase 2 con le cellule recuperate in ciascun pozzetto, che è stato precedentemente riempito con 1 mL di terreno di differenziazione di fase 2.
  8. Il giorno 10 della differenziazione ematopoietica, verificare la presenza di un gran numero di cellule ematopoietiche fluttuanti. Raccoglieteli raccogliendoli in una provetta da 50 ml. Possono essere congelati al 10% di DMSO, al 50% di FBS e al 40% di terreno o utilizzati immediatamente per differenziare le cellule in OC.

6. Maturazione M-CSF e differenziamento OC

  1. Cellule di seme ad una concentrazione di 200.000 cellule/cm2 su piastre di coltura tissutale trattate bene e trattate con alfa-MEM, integrate con FBS al 10% e 50 ng/mL hM-CSF.
  2. Per eseguire saggi funzionali o imaging, staccare le cellule mature M-CSF 3 giorni dopo la semina lavandole con PBS preriscaldato a 37 °C utilizzando un P1000 con punta a foro largo. Potrebbero essere necessarie ripetute fasi di lavaggio per staccare completamente le celle.
  3. Trasferire le cellule staccate in una provetta da 15 mL utilizzando una P1000 con punta a foro largo e centrifugare a 300 x g per 5 min. Scartare il surnatante.
  4. Risospendere e sciogliere il pellet cellulare con il mezzo di differenziazione OC, costituito da alfa-MEM integrato con FBS al 10%, 50 ng/mL hM-CSF e 80 ng/mL hRANKL. Contare le cellule utilizzando un emocitometro o un dispositivo automatico di conteggio delle cellule e riseminare le cellule mature M-CSF a una densità di 200,00-250,000 cellule/cm2 in un materiale di coltura appropriato per saggi funzionali o imaging (ad esempio, saggi di riassorbimento osseo, vetrini coprioggetti per l'imaging, ecc.).
  5. Differenziare con il mezzo di differenziazione OC per 7-9 giorni. Eseguire un cambio completo del terreno di coltura con il terreno di differenziazione OC fresco ogni 2-3 giorni.
    NOTA: Gli OC multinucleati compaiono in genere dopo 5-7 giorni.

Risultati

Monitoraggio della morfologia cellulare durante tutto il processo di differenziamento
Tutti i risultati descritti di seguito sono stati generati utilizzando la linea MCND-TENS2 iPSC per il differenziamento OC. Questa linea di iPSC è stata precedentemente utilizzata in diversi studi32,33. Tuttavia, anche altre linee di iPSC sono state utilizzate con successo con questo protocollo di differenziazione.

Una valutazione...

Discussione

Questo protocollo offre un metodo affidabile e robusto per differenziare le iPSC in OC. Tuttavia, ci sono diverse insidie che si possono incontrare durante il processo di differenziazione. Le linee di iPSC umane generate da cellule di diversa origine tissutale sono state differenziate con successo utilizzando questo protocollo33. Quando si congelano le iPSC (vedere il passaggio del protocollo "3. Congelamento delle iPSC"), un pozzetto nel punto di passaggio è stato congelato in un crioviale. Dura...

Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi contrastanti.

Riconoscimenti

Gli autori desiderano ringraziare i membri del laboratorio Giachelli per il loro aiuto tecnico e supporto. Ringraziamo il Centro di Microscopia W. M. Keck e il direttore del Centro Keck, Dr. Nathanial Peters, per l'assistenza nell'ottenere le immagini di microscopia confocale e microscopia a campo largo. Si ringraziano inoltre la UW Flow Core Facility e il Flow Core Facility manager, Aurelio Silvestroni, per il supporto tecnico e l'assistenza. Infine, ringraziamo Hannah Blümke per il supporto con l'illustrazione e il graphic design.

Il finanziamento è stato fornito attraverso la sovvenzione R35 HL139602-01 del National Institutes of Health. Riconosciamo anche la sovvenzione NIH S10, la OD016240 S10 per il finanziamento dello strumento presso il W. M. Keck Center e la sovvenzione NIH 1S10OD024979-01A1 per il finanziamento dello strumento presso la UW Flow Core Facility.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
2-MercaptoethanolSigma AldrichM6250-10ML
Antibody - Anti-Cathepsin K Abcamab19027
Antibody - APC-conjugated Anti-Human CD45BD555485
Antibody - APC-conjugated Mouse IgG1, κ Isotype ControlBD555751
Antibody - BV711-conjugated Anti-Human CD14BD563372
Antibody - BV711-conjugates Mouse IgG2b, κ Isotype ControlBD563125
Antibody - Goat Anti-Rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 647Abcamab150079
Antibody - PE-conjugated Anti-Human CD14R&D SystemsFAB3832P-025
Antibody - PE-conjugated Anti-Human Integrin alpha M/CD11bR&D SystemsFAB16991P-025
Antibody - PE-Cy7-conjugated Anti-Human CD34BD560710
Antibody - PE-Cy7-conjugated Mouse IgG1 κ Isotype ControlBD557872
Antibody - PE/Cyanine5-conjugated Anti-Human CD11bBiolegend301308
Antibody - PE/Cyanine5-conjugated Mouse IgG1, κ Isotype CtrlBiolegend400118
Antibody - PerCP-Cy5.5-conjugated Mouse IgG1 κ Isotype ControlBD550795
Antibody - PerCpCy5.5-conjugated Anti-Human CD43BD563521
Bone Resorption Assay KitCosmoBioUSACSR-BRA-24KIT
Countess 3 Automated Cell CounterThermoFisher16812556
Cultrex Stem Cell Qualified Reduced Growth Factor Basement Membrane ExtractR&D Sytems3434-010-02Basal membrane extract
DAPIR&D Systems5748/10
Dispase (5 U/mL)STEMCELL Technologies7913
DMEM/F-12 with 15 mM HEPESStem Cell36254
DMSOSigma AldrichD2650
DPBSSigma AldrichD8537-500ML
Human Bone Morphogenetic Protein 4 (hBMP4)STEMCELL Technologies78211
Human IL-3STEMCELL Technologies78146.1
Human Macrophage Colony-stimulating Factor (hM-CSF)STEMCELL Technologies78150.1
Human Soluble Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand (hsRANKL)STEMCELL Technologies78214.1
Human Stem Cell Factor (hSCF)STEMCELL Technologies78155.1
Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution)Biolegend422301
Human Vascular Endothelial Growth Factor-165 (hVEGF165)STEMCELL Technologies78073
Invitrogen Rhodamine PhalloidinInvitrogenR415
MEM α, nucleosides, no phenol redThermoFisher41061029
mFreSRSTEMCELL Technologies05855Serum free cryopreservation medium
mTeSR Plus mediumSTEMCELL Technologies100-0276Human iPSC-serum free medium (hiPSC-SFM)
Nunclon Sphera 96-Well, Nunclon Sphera-Treated, U-Shaped-Bottom MicroplateThermo Scientific174925Round bottom ultra-low attachment 96-well plate
P1000 Wide Bore TipsThermoFisher2079GPK
ROCK-Inhibitor Y-27632STEMCELL Technologies72304
StemSpan SFEMStemCell09650Hematopoietic cell culture medium
TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol redThermo Fisher12563011Single-cell dissociation reagent
UltraglutamineBioscience LonzaBE17-605E/U1
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell MediumBioscience Lonza04-418QHematopoietic basal medium
µ-Slide 8 Well HighIbidi80806

Riferimenti

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