Utilizzo di un modello di cuore di ratto funzionante isolato per testare le strategie di conservazione del cuore del donatore

Riepilogo

Descriviamo un protocollo di funzionamento del cuore di ratto isolato ex vivo per testare le strategie di conservazione del cuore del donatore. Questo documento descrive il protocollo per l'uso nelle celle frigorifere statiche dei cuori dei donatori di roditori; Tuttavia, il protocollo può essere utilizzato anche per i cuori dei donatori ottenuti dopo la donazione dopo la morte circolatoria e la morte cerebrale.

Abstract

L'ottimizzazione delle soluzioni di conservazione del cuore del donatore ha svolto un ruolo chiave nella riduzione del danno da ischemia-riperfusione nei cuori dei donatori durante il prelievo, il trasporto e il trapianto di organi. Precedenti lavori del nostro laboratorio hanno dimostrato che l'aggiunta di gliceril trinitrato ed eritropoietina alle soluzioni di conservazione del cuore del donatore potrebbe migliorare significativamente il recupero funzionale cardiaco dopo una prolungata conservazione a freddo e nella donazione dopo la morte circolatoria dei cuori. Questo protocollo di integrazione è stato implementato nell'uso clinico nelle unità di trapianto in Australia, Belgio e Regno Unito. Qui, delineiamo un protocollo per testare le strategie di integrazione utilizzando un circuito di perfusione del cuore di ratto funzionante isolato (IWRH) ex vivo . Utilizzando questa metodologia, le strategie di integrazione possono essere testate nel contesto della conservazione statica a freddo prolungata, della donazione dopo la morte cerebrale e della donazione dopo la morte circolatoria della conservazione del cuore del donatore. Il recupero funzionale cardiaco, misurato dal flusso aortico, dal flusso coronarico, dalla gittata cardiaca, dalla pressione del polso e dalla frequenza cardiaca, può essere utilizzato per determinare se una particolare strategia di conservazione può ridurre al minimo il danno da ischemia-riperfusione del cuore del donatore.

Introduzione

Il successo di un trapianto di cuore può essere notevolmente influenzato dal metodo di conservazione utilizzato per il cuore del donatore. I cuori dei donatori sono soggetti a insulti ischemici durante il processo di prelievo, trasporto e trapianto degli organi. Il grado di danno ischemico all'organo del donatore può essere mitigato selezionando un'appropriata strategia di conservazione del cuore del donatore. La conservazione statica a freddo (CSS) rimane il metodo più fattibile e comune per la conservazione del cuore del donatore; tuttavia, la CSS potrebbe non essere necessariamente l'opzione migliore per tutti i percorsi di donazione del cuore. Ad esempio, i cuori prelevati tramite la via della donazione dopo la morte circolatoria (DCD) vengono mantenuti e valutati per la vitalità utilizzando la perfusione meccanica normotermica, mentre i cuori prelevati tramite la via della donazione dopo la morte cerebrale (DBD) possono essere preservati utilizzando la CSS o la perfusione meccanica ipotermica. Un altro fattore determinante per la strategia di conservazione utilizzata è la quantità di ischemia calda (per DCD) o di ischemia fredda (per DBD) a cui il cuore è sottoposto durante l'approvvigionamento e il trasporto degli organi.

Molti centri utilizzano un'integrazione farmacologica aggiuntiva della soluzione di conservazione del cuore per aumentare la tolleranza ischemica e migliorare la funzione cardiaca post-trapianto. Gli studi sui roditori del nostro laboratorio hanno dimostrato che l'integrazione della cardioplegia con eritropoietina e gliceril trinitrato è stata in grado di migliorare significativamente il recupero funzionale cardiaco dopo una prolungata conservazione a freddo del cuore del donatore ^1,2. Questi studi sono poi passati a studi suini sulla conservazione del cuore del donatore e hanno fornito le basi precliniche che hanno portato all'incorporazione dell'eritropoietina e del gliceril trinitrato nella soluzione cardioplegica dei cuori prelevati tramite una via DCD utilizzando la perfusione meccanica normotermica ^3,4,5. Attualmente, l'integrazione con eritropoietina e gliceril trinitrato è utilizzata anche nelle unità di trapianto australiane per i recuperi cardiaci clinici DBD che incorporano CSS. L'obiettivo generale del protocollo di perfusione del cuore di ratto funzionante isolato (IWRH) descritto di seguito è quello di testare le strategie di conservazione del cuore del donatore in un ambiente di laboratorio e testarne l'efficacia nel preservare la funzione cardiaca del donatore dopo la riperfusione. Il protocollo isolato funzionante del cuore di ratto descritto è stato utilizzato per oltre due decenni all'interno del nostro laboratorio e si è dimostrato estremamente utile nello screening di potenziali integratori e/o strategie che possono migliorare la conservazione del cuore del donatore 2,7,8,9.

Protocollo

Tutti gli animali hanno ricevuto cure umanitarie in conformità con le linee guida del National Health and Medical Research Council (Australia). Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dal Comitato Etico Animale del Garvan Institute of Medical Research (Sydney, Australia).

1. Preparazione del tampone Krebs-Henseleit (KH)

1. Preparare 2 L di una soluzione madre 20x di tampone KH contenente 2,36 M NaCl, 0,094 M KCl, 0,024 M MgSO₄, 0,024 M KH₂PO₄. Aliquotare in provette da 50 mL e conservare a -20 °C.
2. Prima dell'esperimento, preparare due fiasche Erlenmyer da 2 L di 1x tampone KH contenente 1900 mL di acqua deionizzata, 100 mL di 20x tampone KH di riserva, 4,20 g di NaHCO₃ (25 mM) e 3,96 g di glucosio (11 mM).
   1. Porre i palloni tampone in un bagno d'acqua a 37 °C e gasare la soluzione con carbogeno (95% di ossigeno, 5% di anidride carbonica, portata impostata a 2 L/min) tramite pietre porose (filtro di ingresso slip-on) per 5 minuti, quindi aggiungere 2,8 mL di 1 M CaCl₂ (1,4 mM). Continuare a far bollire la soluzione per almeno 1 ora prima dell'inizio dell'esperimento. L'uso di una pietra porosa favorisce un'aerazione uniforme del tampone.
   2. Mettere un piccolo volume (~50 mL) di tampone in un piatto rotondo di metallo a -20 °C per raffreddare e formare uno strato di tampone ghiacciato.

2. Preparazione del circuito di perfusione

1. Assicurarsi che tutti i tubi e la vetreria siano puliti e non presentino crescita/contaminazione visibile.
2. Impostare le altezze delle camere di vetro in modo che corrispondano alle pressioni di perfusione richieste basate su 1 cm H₂O equivalenti a 1,36 mmHg: Langendorff-cuore 100 cm (circa 75 mmHg), precarico di lavoro da lato a cuore 15 cm (circa 11 mmHg), cuore-camera di postcarico 100 cm (circa 75 mmHg).
3. Iniziare la circolazione dell'acqua calda intorno al circuito almeno 10 minuti prima della perfusione cardiaca.
4. Posizionare i filtri in microfibra (1,2 μm) nei portafiltri e fissarli saldamente.
5. Adescare il circuito con tampone KH, assicurandosi che tutta l'aria venga rimossa, e utilizzare un morsetto per tubi di controllo del flusso per regolare il flusso sul lato Langendorff (Figura 1A, B) a ~50 mL/min. Il flusso più lento facilita l'incannulamento aortico e impedisce che il cuore si stacchi prima della legatura. Posizionare un termometro all'interno del circuito tramite un connettore per tubi a forma di T per monitorare la temperatura del tampone a ~37 °C.

3. Configurazione del software Lab Chart (analisi dei dati)

1. Assicurarsi che Powerlab (sistema di acquisizione dati) e il flussometro siano accesi e collegati al computer prima di aprire il software di analisi dei dati.
2. Apri un nuovo file.
3. Imposta la raccolta dei dati selezionando il menu a discesa Impostazioni e selezionando Impostazioni canale. Selezionare Pressione aortica, Flusso aortico e Frequenza cardiaca (Figura 2A).
4. Configurare ciascun canale con le impostazioni mostrate nella Figura 2B.

4. Preparazione dell'animale per l'isolamento del cuore di ratto

NOTA: La metodologia per l'isolamento e la perfusione del cuore di ratto per cuori non DBD e non DCD per la conservazione statica a freddo è descritta di seguito. I metodi per la strumentazione cardiaca sul circuito di perfusione sono relativamente simili, indipendentemente dal metodo di donazione utilizzato. Le differenze nel protocollo per la donazione di cuore di ratto DBD e DCD si verificano principalmente dal momento in cui l'anestesia animale ha avuto effetto fino a quando il cuore viene asportato dall'animale.

1. Pesare l'animale, assicurandosi che il suo peso sia di >330 g. L'intervallo di peso ideale per i ratti maschi è di 330-420 g.
2. Somministrare un'iniezione intraperitoneale di ketamina (80 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg). Garantire un adeguato piano chirurgico di anestesia basato sull'assenza di un riflesso del pedale (riflesso del pizzicamento delle dita) e del riflesso del battito delle palpebre.
3. Posizionare l'animale in posizione supina, fissando gli arti con del nastro adesivo. Somministrare ossigeno all'animale attraverso un cono nasale.
4. Avere il contenitore metallico per granita di ghiaccio tampone KH e un piccolo contenitore metallico con ghiaccio alla stazione di dissezione. Immergere una garza di 7,5 cm x 7,5 cm nel tampone KH e posizionarla sul contenitore con ghiaccio.
5. Una volta confermato un adeguato piano chirurgico di anestesia, radere la pelle nel sito dell'incisione chirurgica e pulire la pelle con asettico come betadine o alcol al 70%. Praticare un'incisione laterale attraverso l'addome (laparotomia) e spostare lo stomaco e l'intestino lateralmente per consentire l'accesso alla vena renale sinistra. Iniettare 1500 UI di eparina e applicare pressione sul sito di iniezione fino a quando l'emorragia non si ferma. Attendere 1-2 minuti affinché l'eparina circoli prima di continuare con il recupero del cuore.
6. Aprire la cavità toracica tagliando la gabbia toracica su entrambi i lati e tagliando il diaframma. Tenere e sollevare con cautela il blocco cuore-polmone mentre si taglia lungo l'aorta discendente, assicurandosi che l'arco aortico rimanga intatto. Ciò consentirà di mantenere una lunghezza sufficiente dell'aorta per l'incannulamento.
7. Il ratto viene soppresso mediante la rimozione del cuore e dei polmoni mentre è sotto anestesia. Immergere il blocco cuore-polmone nella fanghiglia di ghiaccio tampone KH per consentire al cuore di arrestarsi.

5. Incannulare il cuore sul circuito di perfusione cardiaca funzionante isolato

1. Trasferire il blocco cuore-polmone in una garza con ghiaccio. Sezionare il grasso in eccesso intorno all'aorta, tagliare l'aorta in modo da lasciare una lunghezza di 3-5 mm per l'incannulamento e praticare una piccola incisione di ~1-2 mm nell'arteria polmonare. Ciò consentirà un percorso per l'effluente coronarico.
2. Posizionare il blocco cuore-polmone tagliato (mentre è ancora sul ghiaccio) direttamente sotto le cannule. Regolare il flusso dal lato di Langendorff utilizzando un morsetto per tubi di controllo del flusso per facilitare l'incannulamento aortico. Incannulare con cura l'aorta sulla cannula sinistra, tenerla con una pinza nera e legarla con una sutura di seta 2-0.
3. Aumentare il flusso dalla perfusione di Langendorff aprendo completamente il morsetto del tubo di controllo del flusso. Aprire il morsetto di postcarico. Assicurarsi che ci sia un flusso continuo dalla camera Langendorff. Inizia a monitorare l'attività cardiaca con il software.
   NOTA: se il valore del flusso aortico sul display del flussometro è di <10 ml/min, assicurarsi che l'arteriotomia polmonare sia di dimensioni sufficienti. Un traccia/valore basso del flusso aortico potrebbe anche indicare che la cannula aortica è stata inserita troppo in profondità.
4. Regolare il blocco cuore-polmone in modo che la superficie anteriore dei polmoni sia rivolta verso l'operatore. Legare il lobo polmonare sinistro con una sutura di seta 2-0 e tagliare il tessuto polmonare sinistro in eccesso. Legare i lobi polmonari rimanenti in una sola passata con una sutura di seta 2-0 e tagliare il tessuto. Ruota il cuore in modo che i polmoni legati siano rivolti verso la parte posteriore.
5. Usando piccole forbici Vannas, tagliare un bordo di 2-3 mm dell'appendice atriale sinistra, assicurandosi di ottenere una piccola apertura negli atri. Incannulare con cura l'appendice atriale sinistra alla cannula sinistra, tenerla con una pinza nera e legarla con una sutura di seta 2-0. La Figura 3A mostra il posizionamento di entrambe le cannule.
6. Regolare la camicia d'acqua della camera cardiaca in modo che il cuore si trovi al centro della camera.
7. Aprire il trasduttore di pressione in aria e azzerare il trasduttore di pressione nel software selezionando il menu a discesa Pressione aortica > Bridge Amp > Zero. Fare clic su OK.
8. Perfondere il cuore in modalità Langendorff per 10 min. Assicurarsi che il flusso aortico di Langendoff misuri tra 10 e 20 ml/min (ideale 20 ml/min).
9. Prima di cambiare la modalità di lavoro, assicurarsi che la pietra porosa (filtro di ingresso slip-on) del serbatoio tampone Langendorff KH sia collocata nel serbatoio tampone KH funzionante.
10. Passa il cuore in modalità di lavoro chiudendo il grande morsetto che porta alla cannula aortica e aprendo il flusso che porta all'appendice atriale sinistra. Aprire il rubinetto a tre direzioni che porta dal lavoro perfusare. Trasferire il tubo di ritorno comune (riportando il tampone KH al serbatoio) dal serbatoio di Langendorff al serbatoio di lavoro.
11. Perfondere il cuore in modalità di lavoro per 15 min. I valori del flusso aortico devono idealmente essere di >30 mL/min al termine di 15 minuti di perfusione. Una volta che il cuore si è stabilizzato, inizia a registrare i dati nel software di analisi dei dati.
12. Misurare l'effluente coronarico (flusso coronarico) a 1 min, 5 min, 10 min e 15 min.
    NOTA: I valori di flusso coronarico devono essere compresi tra 10 e 20 mL/min. Un flusso coronarico superiore a 22 mL/min indica generalmente una perdita originata da un vaso polmonare slegato. La frequenza cardiaca dovrebbe essere compresa tra 200 e 300 bpm. Gli effluenti coronarici possono essere raccolti per l'analisi a valle dei marcatori di lesione tissutale (ad esempio, troponina-I, rilascio di lattato deidrogenasi).

6. Somministrazione di cardioplegia per la conservazione statica fredda del cuore

1. Riempire la camera cardioplegica (posizionata a un'altezza di 60 cm per produrre una pressione di perfusione di circa 40 mmHg) con 50 ml di soluzione di conservazione cardiaca designata (con o senza supplementazione).
2. Abbassare la camicia d'acqua e chiudere il rubinetto a tre vie sul lato della modalità di lavoro.
3. Arrestare il flusso verso la cannula atriale sinistra chiudendo il morsetto.
4. Aprire il flusso alla cannula aortica.
5. Chiudere la pinza dal lato Langendoff e sul postcarico.
6. Aprire la pinza dalla linea di cardioplegia ed eliminare 15 ml di cardioplegia dalla linea di pressione. Chiudere il rubinetto in corrispondenza della linea di pressione.
7. Consentire al cuore di essere lavato con la cardioplegia attraverso la cannula aortica e raccogliere l'effluente coronarico. Eseguire la cardioplegia per 3 minuti e registrare il volume di cardioplegia somministrata.
8. Interrompere la registrazione dei dati nel software e salvare il file.
9. Dopo 3 minuti, chiudere la pinza cardioplegica e la piccola pinza blu che porta alla cannula aortica.
10. Posizionare un morsetto per bulldog sulla cannula aortica e un secondo morsetto per bulldog sulla cannula sinistra. Scollegare il blocco cuore-cannula dal circuito e posizionarlo in un becher contenente cardioplegia in una ghiacciaia (Figura 3B, C).
11. Conservare il cuore in frigorifero per 6 ore (o il tempo di conservazione a freddo desiderato).

7. Riperfusione cardiaca dopo conservazione statica a freddo

1. Preparare il tampone KH come indicato nella sezione 1.
2. Adescare il circuito di perfusione come da sezione 2.
3. Aprire il file salvato dalla perfusione basale.
4. Rimuovere con cautela il blocco cuore-cannula dalla ghiacciaia e fissarlo al circuito di perfusione. Prima di ricollegare la cannula aortica, utilizzare una siringa smussata da 18 G riempita con tampone KH per rimuovere l'aria dalla cannula. Collegare prima la cannula aortica, aprire il tubo clamp sul lato Langendorff e assicurarsi che il tubo di postcarico clamp è aperto.
5. Ricollegare la cannula atriale sinistra, assicurandosi che l'aria sia stata rimossa dalla cannula prima di collegarla al circuito di perfusione. Tenere il lato di lavoro clamp chiuso fino al momento di passare dalla modalità Langendorff alla modalità di lavoro.
6. Perfondere il cuore in modalità Langendorff per 15 min. Assicurarsi di iniziare a registrare i dati all'inizio della riperfusione di Langendorff.
7. Prima di passare alla modalità di lavoro, posizionare entrambe le pietre gorgoglianti nel tampone KH, aprire il rubinetto a 3 vie sul lato di lavoro e trasferire il tubo di ritorno comune nel serbatoio di lavoro.
8. Chiudere il morsetto Langendorff bianco, aprire il morsetto laterale di lavoro bianco e perfondere il cuore per 30 minuti. Misurare e raccogliere gli effluenti coronarici in punti temporali designati per l'analisi a valle (ad esempio, marcatori di lesioni cardiache). Assicurati di interrompere-riavviare la registrazione del software per avviare un nuovo segmento (o in alternativa, aggiungi un commento).
9. A circa 15 minuti di riperfusione in modalità di lavoro, chiudere il rubinetto a tre direzioni.
10. Al termine della riperfusione, salvare il file di dati, interrompere il flusso attraverso il circuito e scollegare il blocco cardiaco. Raccogliere campioni del ventricolo sinistro per l'elaborazione istologica e/o il congelamento rapido per studi futuri (ad esempio, estrazione di proteine per studi di western blot).
11. Rimuovere i filtri dai portafiltri, scaricare il tampone dal circuito e sciacquare due volte con 5 L di acqua distillata.
    NOTA: Sebbene non sia necessario, è utile preriscaldare l'acqua distillata in un grande contenitore all'interno del bagnomaria.

8. Analisi del recupero funzionale

1. Apri il file LabChart.
2. Evidenzia una regione di almeno 30 secondi di registrazione, quindi fai clic su Comando > Aggiungi selezione dati OPPURE Aggiungi più dati ai dati. Questo aggiungerà i parametri desiderati a un file DataPad all'interno del software.
3. Seleziona il menu a discesa Finestra > DataPad.
4. Evidenzia e copia i valori di recupero da DataPad in un foglio di calcolo per l'analisi funzionale del recupero. Calcolare il recupero funzionale come percentuale del rispettivo valore basale ^1,6,7.

Risultati

I risultati della perfusione di base determineranno se l'esperimento iniziale (pre-conservazione) ha avuto successo. Il flusso aortico visualizzato durante la modalità Langendorff deve essere compreso tra 14 e 22 mL/min. Il flusso di Langendorff viene visualizzato come valore negativo sul flussometro a causa della perfusione retrograda dell'aorta. Un esempio di una traccia di Langendorff accettabile è mostrato nella Figura 4A.

U...

Discussione

Data la natura sensibile della funzione basale del cuore, è necessario prestare attenzione a mantenere il rig di perfusione pulito e con componenti compatibili. Ad esempio, è necessario utilizzare il tubo in PVC corretto. Alcuni materiali per tubi, come il silicone, possono contribuire a ridurre il flusso aortico e la contrattilità, che possono essere dovute alla perdita di ossigeno attraverso il tubo. Sebbene siano disponibili in commercio circuiti di perfusione cardiaca di ratto iso...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL colorless Eppendorff tube, 1000 per box	Bio Strategy Pty Ltd	0030.125.150
15 mL cent/tubes (S) Sleeve/25 PP ctn/500	Sigma-aldrich Pty Ltd	CLS430791-500ea
BP Transducer/Cable kit	ADInstruments	MLT1199	Data Acquisition
Bridge Amp	ADInstruments	FE221	Data Acquisition
Carbogen 555G2	BOC	BOC002
Checktemp1 thermometer	Hanna Instruments	HI98509	Rig Construction
Clamp Pinch 1/4-7/16 PK 12	Thomas Scientific	2848Y40	Rig Construction
Clamp W/Extension Stem Med.	Thomas Scientific	8847T08	Rig Construction
Clamp W/Extension Stem Sm.	Thomas Scientific	8847T02	Rig Construction
Clips, Vessel, 60 g Pressure	Coherent Scientific	14121	Surgical Equipment
Closed Connector	Thomas Scientific	8847E25	Rig Construction
Covidien Sofsilk 2-0 black precut 45 cm box of 24	Specialist Medical Supplies	S195	Surgical consumables
Custom Made 250 mL Jacketed Degasser	Custom Blown Glassware Pty Ltd	N/A	Rig Construction
Custom Made 750 mL Reservoir	Custom Blown Glassware Pty Ltd	N/A	Rig Construction
D-(+)-Glucose Anhydrous SigmaUltra	Sigma-aldrich Pty Ltd	G7528-1Kg	To make Krebs Buffer
Dual Channel Console	ADInstruments	TS402	Data Acquisition
Erlenmyer flasks 2 L
Filter Microfibre type GF/C glass fibre 47 mm, 100	Bio-strategy Pty Ltd	1822047
Forceps, 15 cm, 0.3 mm, CRVD	Coherent Scientific	14114	Surgical Equipment
Four Prong Clamps with 9 mm x 115 mm long arm for holding 2-70 mm diam objects. Vinyl coated	Met-App Australia Pty Ltd	1352	Rig Construction
Heater Circulator. Digital Solid State Control. (1020 Watts/240 Volts)	Thermoline Scientific	TU3	Rig Construction
Heparin 5000 U/5 mL box 50 Pfizer 02112115	Clffird Hallam Healthcare Pty Ltd	1258693	Drugs
Ilium Xylazil 20 Inj 50 mL	Cenvet Australia Pty Ltd	X5010	Anaesthetic
Johns Hopkins Bulldog Clamp	Coherent Scientific	CS-WPI-14117
Ketamine 100 mg/50 mL	Provet (NSW) Pty Ltd	KETAI1	Anaesthetic
Magnesium Sulphate heptahydrate AR 500 g Chemsupply	Bio Strategy Pty Ltd	MA048-500g	To make Krebs Buffer
Male/Female Hinged Adapter	Thomas Scientific	8847V08	Rig Construction
Masterflex L/S Easy-Load Head for Precision Tubing, PPS, CRS Rotor	John Morris	1015164	Rig Construction
Metzenbaum scissors, 11.5 cm curved	Coherent Scientific	WPI-501748	Surgical Equipment
Metzenbaum scissors, 14.5 cm straight	Coherent Scientific	WPI-501252	Surgical Equipment
Mounting Hardware F/2-HEADS SS	John Morris	1014414	Mounting screws for pump heads
Open-sided connector	Thomas Scientific	8847E05	Rig Construction
Paraformadehyde	Sigma-Aldrich	P6148-500G	Sample processing
Potassium Chloride (AnalaR NORMAPUR) 500 g	VWR Chemicals	26764.26	To make Krebs Buffer
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich Pty Ltd	P5379-500g	To make Krebs Buffer
Powerlab 2/26, 2 channel recorder + Labchart software	ADInstruments	ML826	Computer Hardware and Software
Precision XN Inline Flowsensor, 3.2 mm (1/8")ID ME4PXN-KR37 XF	ADInstruments	ME4PXN	Rig Construction
Scalpel with handle disposable #11 pkt/10	BSN Medical (Aust) Pty Ltd	73252-36
Silicone Gasket for Swinnex 47 mm 5/PK	Merck Millipore	SX0004701	Rig Construction
Silicone O-Ring 5-329 10/PK	Merck Millipore	XX1104707	Rig Construction
Single Buret Clamp	Thomas Scientific	8847T32	Rig Construction
Slip-on inlet Filter pore size 10 µm (bubbler)	Sigma-aldrich	59277	Rig Construction
Sm. 360 Rotation Connector	Thomas Scientific	8847E35	Rig Construction
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich Pty Ltd	S6297 - 250g	To make Krebs Buffer
Swinnex Filter Holder, 47 mm	Merck Millipore	SX0004700	Rig Construction
syringes 1 mL box/100	Becton Dickinson Pty Ltd	302100
Three Prong Clamps with 9 mm diameter x 125 mm long arm and twin screw for holding 5-80 mm	Met-App Australia Pty Ltd	1356	Rig Construction
Tubing Flowmeter Module TS410	ADInstruments	TS410	Data Acquisition
Tubing PVC 6.35 mm ID x 9.52 mm OD 50ft Roll 15.24m, clear , DEHP phthalate free, food grade meets REAC	Thermo Fisher	NAL 8701-0600	Rig Construction
Tubing PVC 7.94mm ID x 11.1mm OD 50ft Roll 15.24 m, clear , DEHP phthalate free, food grade meets REAC	Thermo Fisher	NAL 8701-0900	Rig Construction
Tubing PVC 9.52 mm ID x 12.7 mm OD 100ft Roll	Thermo Fisher	NAL 8701-4120	Rig Construction
Vannas scissors, 8.5 cm, Straight, 7 mm Blades	Coherent Scientific	WPI-500-086	Surgical Equipment
Water Bath 30 Litre with Suspended Tray	Thermoline Scientific	TLWB-30	Rig Construction