Un approccio alla costruzione di comunità di biofilm multispecie dal suolo della rizosfera

Riepilogo

Qui viene presentata una procedura rapida e standardizzata per stabilire comunità di biofilm multispecie sinergiche da vari suoli della rizosfera. Si tratta di un protocollo unico progettato per sondare e simulare il complesso microbiota del suolo della rizosfera.

Abstract

Il biofilm multispecie è uno stile di vita naturale e dominante dei batteri in natura, anche nel suolo della rizosfera, sebbene l'attuale comprensione di esso sia limitata. Qui, forniamo un approccio per stabilire rapidamente comunità di biofilm multispecie sinergiche. Il primo passo consiste nell'estrarre le cellule dal terreno della rizosfera utilizzando il metodo della centrifugazione differenziale. Successivamente, queste cellule del suolo vengono inoculate nel terreno di coltura per formare il biofilm della pellicola. Dopo 36 ore di incubazione, la composizione batterica del biofilm e la soluzione sottostante vengono determinate utilizzando il metodo di sequenziamento dell'amplicone genico 16S rRNA. Nel frattempo, l'isolamento batterico ad alto rendimento dal biofilm della pellicola viene condotto utilizzando il metodo di diluizione limitante. Quindi, i primi 5 taxa batterici vengono selezionati con la più alta abbondanza nei dati di sequenziamento dell'amplicone del gene 16S rRNA (campioni di biofilm a pellicola) per un ulteriore utilizzo nella costruzione di comunità di biofilm multispecie. Tutte le combinazioni dei 5 taxa batterici sono state rapidamente stabilite utilizzando una piastra a 24 pozzetti, selezionata per la più forte capacità di formazione del biofilm mediante il saggio di colorazione cristallovioletto e quantificata mediante qPCR. Infine, le più robuste comunità di biofilm batterici multispecie sintetiche sono state ottenute attraverso i metodi di cui sopra. Questa metodologia fornisce una guida informativa per condurre ricerche sul biofilm multispecie della rizosfera e identificare comunità rappresentative per studiare i principi che governano le interazioni tra queste specie.

Introduzione

I biofilm rappresentano intricate comunità microbiche fissate alle superfici o collegate con interfacce. C'è un ampio riconoscimento che la maggior parte dei batteri incontrati in vari ambienti, come habitat naturali, ambienti clinici e contesti industriali, sopravvive all'interno delle comunità di biofilm¹. Nel suolo, la rizosfera, che comprende la superficie delle radici e la sua adiacente regione spessa 2 mm, forma una nicchia ecologica con una maggiore disponibilità di nutrienti. Batteri specifici hanno sviluppato strategie per sfruttare questa nicchia, favorendo la proliferazione microbica e favorendo la formazione di comunità di biofilm nella rizosfera².

I microbi della rizosfera sono considerati il "secondo genoma" delle piante³. I microrganismi che promuovono la crescita delle piante (PGPM) si impegnano in simbiosi mutualistica con le piante, fornendo significative funzioni di promozione della crescita e di biocontrollo⁴. Da un lato, il PGPM può fornire nutrienti alle radici delle piante, migliorare l'assorbimento dei nutrienti, difendersi dagli agenti patogeni e degradare gli inquinanti nel suolo della rizosfera⁵. D'altra parte, la PGPM utilizza gli essudati delle radici delle piante come fonte di nutrienti per la crescita e l'evoluzione, influenzando così il suolo e l'apparato radicale della rizosfera attraverso il loro stesso metabolismo. Vale la pena notare che il prerequisito per tutte queste funzioni è l'efficace colonizzazione del PGPM nella rizosfera vegetale, formando biofilm stabili⁶.

Il biofilm della rizosfera influenza il processo di assemblaggio dei microbi della rizosfera e le caratteristiche temporali e spaziali dell'assemblaggio dei microbi della rizosfera sono strettamente correlate all'interazione del biofilm multispecie⁷. Funge da fulcro delle interazioni pianta-microbioma, fornendo una nicchia stabile e controllabile per interagire in modo efficace. Pertanto, lo studio del biofilm della rizosfera è anche una direzione importante per ottenere informazioni sull'interazione tra piante e microbi.

Tuttavia, attualmente ci sono poche ricerche sui biofilm multispecie della rizosfera. L'elevata complessità della composizione del microbioma rende difficile rispondere alle domande ecologiche fondamentali che circondano le comunità microbiche naturali⁸. Nel processo degli esperimenti, è necessario considerare molte condizioni, come il tipo di suolo, il tipo di pianta e il gran numero di comunità microbiche. Vari fattori limitano la ricerca di biofilm multispecie della rizosfera.

Per studiare ulteriormente le comunità di biofilm multispecie dal suolo della rizosfera, come le interazioni sinergiche interspecie o l'alimentazione incrociata dei metaboliti⁸, è auspicabile costruire artificialmente una comunità microbica sintetica semplificata, rappresentativa, stabile e trattabile in condizioni di laboratorio ^9,10. Qui, un protocollo standardizzato combina molte delle più recenti tecniche microbiologiche e bioinformatiche.

Protocollo

Questo protocollo è generalmente applicabile al microbiota del suolo della rizosfera di varie piante. Qui, il cetriolo è usato come esempio. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate per lo studio sono elencati nella tabella dei materiali.

1. Isolamento batterico

1. Isolamento del suolo nella rizosfera
   1. Cultura del cetriolo
      1. Disinfettare i semi di cetriolo con una soluzione di etanolo al 75% e ipoclorito di sodio (NaClO) al 2%, quindi sciacquarli in acqua sterile¹¹.
      2. Germina i semi in condizioni sterili e seleziona quelli che raggiungono lo stadio a due foglie¹². Successivamente, trapiantare le piantine di cetriolo costantemente germogliate in vasi contenenti 2 kg di terra nera.
         NOTA: Due tipi di terra nera provenienti da diverse località nel nord-est della Cina vengono utilizzati per ridurre gli errori sistematici.
   2. Preparazione della sospensione del terreno
      1. Preparare il tampone PBS-S utilizzando la formulazione: 6,33 g di NaH₂PO₄· H₂O, 16,5 g di Na₂HPO₄·7H₂O, 200 μL di Silwet L-77 e 1 L di acqua distillata.
      2. Quando le piantine raggiungono lo stadio¹² a quattro foglie, capovolgere il vaso e isolare le radici insieme a un terriccio della rizosfera di 2 mm di spessore utilizzando guanti sterilizzati.
      3. Inserire le radici in 30 mL di tampone PBS-S in una provetta da centrifuga da 50 mL. Dopo aver agitato per 20 minuti, filtrare la sospensione attraverso un filtro a celle di nylon da 100 μm per rimuovere radici e sedimenti di grandi dimensioni.
      4. Trasferire il filtrato in un'altra provetta da centrifuga da 50 mL, centrifugarlo a 3200 x g per 15 minuti a temperatura ambiente e conservarlo temporaneamente a 4 °C.
2. Estrazione di cellule batteriche del suolo a rizosfera.
   NOTA: Questa metodologia adotta il metodo di centrifugazione differenziale¹³, sebbene il metodo di centrifugazione in gradiente di densità di Nycodenz¹⁴ si applichi anche a questa fase.
   1. Diluire la sospensione del suolo con una soluzione di Na₄P₂O₇ allo 0,2% in 500 mL e centrifugare a 1.000 x g per 10 minuti per separare inizialmente gli organismi dal suolo.
   2. Riomogeneizzare il precipitato, centrifugarlo alla stessa bassa velocità per 60 s e ripetere il processo tre volte. Unire i surnatanti, centrifugarli a 12.000 x g per 20 minuti, quindi scartare il surnatante.
   3. Risospendere il precipitato in 50 mL di tampone PBS-S, costituendo la sospensione di cellule batteriche del suolo nella rizosfera.

2. Sequenziamento e identificazione del microbiota del biofilm della rizosfera

1. Preparazione dei terreni
   NOTA: Il brodo di soia triptico (TSB) e i terreni di glutammato glicerolo (MSgg) a sali minimi sono disponibili in commercio. Le formulazioni seguenti sono solo di riferimento.
   1. Preparare il terreno TSB utilizzando la seguente formulazione: 15 μg/mL di triptone, 5 μg/mL di peptone di soia, 5 μg/mL di NaCl, pH = 7.
   2. Preparare il terreno MSgg utilizzando la seguente formulazione: 5 mM KH₂PO₄, 100 mM 3-(N-morfinolino) acido propano solfonato (MOPS), 2 mM MgCl₂, 700 μM CaCl₂, 50 μM MnCl₂, 50 μM FeCl₃, 1 μM ZnCl₂, 2 μM tiamina, 0,5% glicerolo, 0,5% glutammato, 50 μg/mL triptofano, 50 μg/mL fenilalanina, pH = 7.
   3. Per preparare i setti filtranti TSB-MSgg, mescolare i setti filtranti TSB con quelli MSgg in un rapporto 1:1 (v/v)¹⁵.
2. Cocoltura di biofilm a pellicola
   1. Incubare la sospensione cellulare in terreno TSB a 30 °C per una notte (di solito 12 ore) per attivare i batteri.
   2. Posizionare i filtri cellulari in nylon da 100 μm su piastre a 24 pozzetti. Incubare i batteri in terreni TSB e impostare tre ripetizioni. Coltivare il biofilm della pellicola per 36 ore a 30 °C.
      NOTA: Se il biofilm della pellicola dell'ultimo passaggio non è ben coltivato, il terreno TSB-MSgg è un efficace sostituto del terreno TSB.
   3. Rimuovere il filtro contenente il biofilm della pellicola. Aggiungere 2 mL di tampone PBS-S a una nuova piastra cellulare a 24 pozzetti, posizionare il filtro a 24 pozzetti per lavare il biofilm e rimuovere le cellule libere. Ripetere il processo di lavaggio tre volte.
3. Estrazione del DNA del biofilm della pellicola
   1. Estrarre il genoma del biofilm utilizzando un kit DNA seguendo le istruzioni del produttore.
4. Sequenziamento ad alta produttività
   NOTA: Le aziende biotecnologiche possono aiutare a completare gli esperimenti di sequenziamento per la maggior parte dei laboratori. Se è necessaria la composizione microbica nella soluzione rimanente, sequenziarla in questa fase. La fase di sequenziamento varia a seconda degli strumenti. Si prega di seguire le istruzioni del produttore. Il passaggio 2.4.1 è solo di riferimento.
   1. Amplificare le regioni V3-V4 del gene 16S rRNA in base al database con sequenze geniche 16S rRNA a lunghezza intera. Creare OTU di specie in base al numero minimo di sequenze per campione¹⁶. Raggruppa le annotazioni di classificazione delle specie e acquisisci le composizioni delle comunità da ciascun campione.
   2. Sulla base dei dati di sequenziamento, seleziona i primi cinque ceppi in termini di abbondanza relativa.
5. Isolamento e coltura batterica ad alto rendimento
   NOTA: Questo passaggio è stato progettato secondo la più recente metodologia microbiologica e bioinformatica¹⁷. Il metodo della piastra rivestita di diluizione è disponibile per l'isolamento batterico, sebbene richieda più tempo e sia meno mirato rispetto alle tecniche ad alto rendimento.
   1. Mescolare il biofilm coltivato. Utilizzare una diluizione limitante per garantire che non più del 30% dei pozzetti nella piastra a 24 pozzetti mostri una crescita batterica.
      NOTA: Per determinare la diluizione più adatta, eseguire esperimenti preliminari utilizzando un'ampia gamma di velocità di diluizione. La diluizione ottimale non deve contenere più di due batteri coltivabili per millilitro, che rappresentano l'incubazione batterica in meno del 30% dei pozzetti.
   2. Amplifica il gene 16S rRNA dei batteri aggiungendo etichette per i pozzetti e le piastre e sequenziali utilizzando la piattaforma Illumina¹⁷ ad alto rendimento.
   3. Condurre analisi bioinformatiche utilizzando software disponibili in commercio per ottenere informazioni tassonomiche sulla purezza e sulle specie per ogni coltura.
   4. Coltiva i primi cinque batteri puri abbondanti mediante coltura in linea continua e usa il glicerolo per preservare i batteri a -80 °C.

3. Costruzione di comunità microbiche sintetiche

1. Coltura di biofilm ricostruita
   NOTA: Per i dettagli, fare riferimento a Ren et ^al.18. I 5 ceppi corrispondono a 31 combinazioni sintetiche, di cui 5 consorzi a specie singola, 10 a due specie, 10 a tre specie, 5 a quattro specie e 1 a cinque specie.
   1. Incubare i 5 ceppi nel terreno TSB fino a quando il loro OD₆₀₀ raggiunge 1 per attivarli.
   2. Preparare diverse piastre a 24 pozzetti con il terreno TSB e posizionare su di esse filtri cellulari in nylon da 100 μm.
      NOTA: Se il biofilm dell'ultimo passaggio non è ben coltivato, il terreno TSB-MSgg è un efficace sostituto del terreno TSB.
   3. Incubare le 31 combinazioni di comunità sintetiche nel mezzo. Assicurarsi che il numero di inoculazione dei batteri sia costante in ogni pozzetto. Imposta tre ripetizioni per ogni combinazione.
   4. Coltivare il biofilm a 30 °C per 36 h.
2. Quantificazione del biofilm della pellicola
   1. Seguire la stessa procedura del passaggio 2.2.3.
   2. Trasferire il biofilm in una nuova piastra a 24 pozzetti contenente 180 μL di soluzione di cristallovioletto e colorarla per 20 minuti.
   3. Trasferire il campione colorato in un'altra piastra a 24 pozzetti contenente 200 μl di etanolo al 96%, eluirlo per 30 minuti e misurare OD₅₉₀.

4. Quantificazione del numero di cellule a pellicola

NOTA: Per determinare la proporzione di ciascuna specie e la conta delle cellule nella pellicola e nella soluzione rimanente, è necessaria la PCR quantitativa. Per i dettagli, fare riferimento a Sun et ^al.16.

1. Progettare primer specifici per ceppo per le comunità microbiche sintetiche selezionate.
2. Usa Roary per eseguire confronti tra i genomi e scoprire i geni a copia singola specifici del ceppo di ciascun isolato. Assicurati che i primer siano mirati a questi geni.
3. Ligasi i frammenti amplificati a plasmidi PMD19T. Genera curve standard utilizzando i plasmidi contenenti i frammenti corrispondenti come modelli.
4. Segui gli stessi passaggi indicati nel passaggio 2.2.
5. Preparare i componenti della reazione come segue: 7,2 μL di H₂O, 10 μL di 2x qPCR Master mix, 0,4 μL di 10 μM di ciascun primer e 2 μL di DNA stampo.
6. Eseguire la PCR con uno strumento PCR in tempo reale nelle seguenti condizioni: 95 °C per 10 minuti, 40 cicli di 95 °C per 30 s e 60 °C per 45 s, seguiti da un segmento della curva di fusione standard.
7. Eseguire sei repliche biologiche per ogni trattamento.

Risultati

Seguendo la procedura menzionata, si osservano gradienti significativi nella capacità di formazione di biofilm dal microbiota del suolo della rizosfera del cetriolo (Figura 1). Il sequenziamento dell'amplicone del biofilm ha confermato la presenza della specie nella pellicola (Figura 2). Sulla base della mappatura termica dei dati di sequenziamento, sono state selezionate le prime cinque specie batteriche la cui abbondanza nella pellicola è maggiore di quella ...

Discussione

Seguendo il protocollo, una serie di robuste comunità di biofilm sintetici multispecie sono costruite sulla base del microbiota nel suolo della rizosfera di diverse piante. Utilizzando tecniche di PCR quantitativa, la composizione di ciascuna comunità viene decifrata in modo chiaro. La biomassa del biofilm indica la forza delle loro potenziali interazioni metaboliche, anche se non è stato possibile rivelare qui varie proprietà e meccanismi alla base della cooperazione¹⁹. Date le dimensioni e l...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 % Na4P2O7 solution	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	20041418	Used to dilute the soil suspension.
100 μm Nylon Cell Filter	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	F613463-0001	Used to filter culture solution and separate pellicle biofilm.
2% NaClO solution	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	L03336903	Used to sterilize the seeds.
24-well Plate	Merck & Co., Inc.	PSRP010	Used for micobial cultivation and pellicle biofilm separation.
3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS)	Bioolook Scientific Research Special	2360010	Used to prepare MSgg media.
50 mL Centrifuge Tube	Beijing Su-bio Biotech Co., Ltd.	62.547.254	Properly-sized centrifuge tubes for our protocol.
75% C2H5OH solution	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	801769680	Used to sterilize the seeds.
Acinetobacter baumannii XL-1	Nanjing Agricultural University	N/A	Strains isolated from rhizosphere soil.
Bacillus velezensis SQR9	Nanjing Agricultural University	N/A	Strains isolated from rhizosphere soil.
Bacteria DNA Kit	Nanjing Dinsi Biotechnology Co.,Ltd.	D3350020000K04U021	Used to extract bacterial DNA.
Black Soil I	Nanjing Agricultural University	N/A	Black soil from Jilin Province.
Black Soil II	Nanjing Agricultural University	N/A	Black soil from Heilongjiang Province.
Burkholderia cenocepacia XL-2	Nanjing Agricultural University	N/A	Strains isolated from rhizosphere soil.
CaCl2	Xilong Scientific Co.,Ltd.	10035048	Used to prepare MSgg media.
Centrifuge	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	G508009-0001	High-speed centrifuge.
ChamQ SYBR qPCR Master Mix	Vazyme Biotech Co.,Ltd.	Q311-02	Used for DNA amplification in qPCR.
Clean Bench	Suzhou Antai Airtech Co., Ltd.	NB026143	Used for aseptic operation.
Constant Temperature Incubator	ShangHai CIMO Medical Instrument Co.,Ltd	GNP-9080BS-	Used for microbial cultivation.
Cristal Violet Dye	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	A600331	Used for pellicle biofilm staining and quantifivation.
Cucumber Seed	Nanjing Agricultural University	N/A	"Jinchun I" cucumber seed.
Culturome v 1.0	The Institute of Genetics and Developmental Biology of the Chinese Academy of Sciences	N/A	Used for high-throughput rhizosphere soil bacterial cultivation and identification
FeCl3	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10011918	Used to prepare MSgg media.
Fridge	Hefei Midea Refrigerator Co.,Ltd.	BCD-556WKPM(Q)	Used for strain preservation.
Glutamate	Bioolook Scientific Research Special	2180020	Used to prepare MSgg media.
Glycerol	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10010618	Used to prepare MSgg media.
Hydroponic Planting Basket	Yulv Furniture Store	6526262626	Used for cucumber hydroponics.
KH2PO4	Xilong Scientific Co.,Ltd.	10017618	Used to prepare MSgg media.
MgCl2	Xilong Scientific Co.,Ltd.	7791186	Used to prepare MSgg media.
MnCl2	Xilong Scientific Co.,Ltd.	10400101	Used to prepare MSgg media.
Msgg Medium	Shanghai Bioesn Biotechnology Co.,Ltd.	BES20791KB	Pellicle biofilm culture medium.
Na2HPO4·7H2O	Merck & Co., Inc.	S9390-100G	Used to prepare TSB media.
NaCI	Chinasun Specialty Products co., Ltd.	HS0416	Used to prepare TSB media.
NaH2PO4·H2O	Merck & Co., Inc.	S9638-25G	Used to prepare TSB media.
PBS-S Buffer	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	E607008-0001	Basic buffer for living tissues.
Phenylalanine	RYON	RT3486L005	Used to prepare MSgg media.
Pipette	Beijing Labgic Technology Co.,Ltd.	BS-1000-T	Used for strain inoculation.
PMD19T Plasmid	Takara Biomedical Technology (Beijing) Co.,Ltd.	D102A	Used to generate qPCR standard curves.
Pot	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	YHHWS2401	Used for cucumber soil culture.
Primer for qPCR	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	N/A	Used for DNA amplification in qPCR.
Real-Time PCR Instrument	Thermo Fisher Scientific (China) Co.,Ltd.	4484073	Used to perform qPCR on selected pellicle biofilm.
Roary	The Wellcome Trust SangerInstitute	N/A	Used to design primers of qPCR
Shaker	Shanghai Zhichu Instrument Co.,Ltd	ZQTY-50S	Used for solution mixing and microbial cultivation.
Silwet L-77	Cytiva Bio-technology(Hangzhou) Co., Ltd.	SL77080596	Used to prepare TSB media.
Soy peptone	Qingdao Hi-tech Industrial Park Hope Bio-technology Co., Ltd	HB8275	Used to prepare TSB media.
Spectrophotometer	Shanghai Yidian Analysis Instrument Co.,Ltd.	76713100010	Used for pellicle biofilm cristal violet quantifivation.
Sterile Water	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	SW150302	Used to wash the pellicle biofilm.
Sterilized Nitrile Gloves	Beijing Labgic Technology Co.,Ltd.	223016852LLZA	Used for basic experimental operations.
Template DNA	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	N/A	Used for DNA amplification in qPCR.
Thiamine	Bioolook Scientific Research Special	2180020	Used to prepare MSgg media.
Tryptone	Thermo Fisher Scientific	LP0042B	Used to prepare TSB media.
Tryptophan	Bioolook Scientific Research Special	2190020	Used to prepare MSgg media.
TSB Medium	Guangdong Huankai Microbial Sci. & Tech. Co.,Ltd.	024048	Broad-spectrum bacterial medium.
TSB-Msgg Meidium	Nanjing Agricultural University	N/A	Mixed medium for pellicle biofilm culture with wider applicability.
ZnCl2	Nanjing Chemical Reagent Co.,Ltd	C0310520123	Used to prepare MSgg media.