In vivo Imaging a fluorescenza confocale dell'attività neurale indotta dalla stimolazione sensoriale in larve di pesce zebra parzialmente trattenute

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per esaminare l'attività neurale nelle regioni cerebrali del pesce zebra transgenico che esprimono indicatori di calcio GCaMP utilizzando la microscopia confocale.

Abstract

Le larve di zebrafish sono un promettente sistema modello di vertebrati per lo studio dei meccanismi neurali del comportamento. La loro traslucenza e i circuiti neurali relativamente semplici facilitano l'uso di tecniche optogenetiche nell'analisi cellulare del comportamento. Gli indicatori fluorescenti dell'attività neurale in vivo , come i GCaMP6, sono stati ampiamente utilizzati per studiare l'attività neurale associata a comportamenti semplici nelle larve di pesce zebra. Qui, presentiamo un protocollo per rilevare l'attività sensoriale indotta in larve di zebrafish semi-trattenute utilizzando la linea transgenica Tg(elav3:GCaMP6s). In particolare, utilizziamo l'agente chimico isotiocianato di allile per indurre una risposta fluorescente robusta e riproducibile in una regione del cervello al confine tra il rombencefalo e il midollo spinale. Discutiamo i potenziali usi dei GCaMP6 per il monitoraggio ottico dell'attività neurale durante una serie di paradigmi comportamentali e i limiti di questa tecnica. Il nostro protocollo delinea un approccio accessibile per il monitoraggio dell'attività neurale in vivo dinamica e correlata al comportamento nel cervello larvale del pesce zebra.

Introduzione

Il pesce zebra rappresenta un modello animale vertebrato con trattabilità per indagini neurobiologiche granulo-molecolari dettagliate. Le larve di pesce zebra possiedono ~100.000 neuroni a 5 giorni dalla fecondazione (DPF), significativamente meno del cervello dei mammiferi. Inoltre, i pesci zebra sono relativamente traslucidi, una proprietà che facilita gli studi ottici della struttura neurale e della funzione 1,2,3,4,5. Diversi strumenti optogenetici sono stati sviluppati per l'uso nel pesce zebra, tra cui indicatori di calcio ad alta fedeltà⁶, sensori di tensione ^7,8 e marcatori di attività neurale ^{9,10,11,12,13} dipendenti dall'attività. Questi strumenti sono complementari ad altri vantaggi posseduti da questo modello, come l'adattabilità alle modificazioni genetiche 14,15,16,17 e la prontezza con cui le larve di zebrafish assorbono le sostanze chimiche presenti nelle soluzioni per il bagno 18,19,20,21.

Una varietà di metodi è utile per la fisiologia ottica del pesce zebra, in particolare la microscopia a due fotoni, a foglio luminoso e confocale. Ciascuna di queste tecnologie deve bilanciare due problemi di risoluzione correlati: l'accesso ottico, compresa la diffusione della luce da parte del tessuto circostante, e la velocità di campionamento, in particolare per catturare la cinetica del potenziale d'azione su scala inferiore al millisecondo²². Ci sono stati notevoli miglioramenti nell'imaging del calcio in vivo utilizzando la microscopia a due fotoni, ma questo metodo è spesso limitato a un campo visivo di <1 mm² e, in genere, è possibile acquisire solo un singolo piano di profondità, limitando così la cattura dell'attività in ampie regioni dei circuiti neurali²². Per la microscopia a foglio di luce, il potenziale di registrare l'attività di quasi tutti i neuroni nel cervello risolve la limitazione del campo visivo della microscopia a due fotoni, ma le attuali velocità della fotocamera limitano fisicamente la cattura a circa tre volumi cerebrali al secondo a 40 piani per volume cerebrale nella larva di pesce zebra ^1,23. La microscopia confocale è inferiore sia in termini di risoluzione di profondità che di velocità di acquisizione alla microscopia a due fotoni e alla microscopia a foglio di luce. La microscopia confocale presenta i vantaggi di un'ampia accessibilità ai laboratori di tutto il mondo e la capacità di ottenere ricostruzioni dell'intero cervello dell'attività neurale utilizzando reporter dell'attività neurale, come cFos e p-ERK⁹. Inoltre, se vengono prese di mira piccole regioni cerebrali, il microscopio confocale può fornire un'adeguata risoluzione temporale dell'attività neurale.

Il presente articolo descrive un metodo che utilizza la microscopia confocale per registrare l'attività neurale nel pesce zebra transgenico che esprime GCaMP6 a livello pan-neuronale. Diversi protocolli simili che utilizzano larve di zebrafish sono stati sviluppati per comprendere la funzione dei percorsi neurali 24,25,26,27,28,29. Le caratteristiche chiave di molti di questi protocolli, come l'imaging time-lapse, gli indicatori fluorescenti della dinamica del calcio e l'imaging dal vivo, sono state combinate per misurare l'attività neurale in una piccola popolazione di neuroni nel sistema nervoso centrale del pesce zebra in risposta all'isotiocianato di allile (AITC), un irritante chimico avversivo 11,26,27,29,30,31 . L'AITC suscita una risposta a livello cerebrale focalizzata nell'area¹¹ del rombencefalo. Un gruppo di neuroni appena caudale al rombencefalo ha un ruolo nella locomozione e in una risposta prolungata all'AITC. Questa risposta dura più a lungo della rimozione dello stimolo avversivo³⁰. Restringendo il campo visivo, siamo riusciti a rilevare l'attività neurale in questo cluster neurale come riflesso dal cambiamento di fluorescenza nei neuroni che esprimono GCaMP6s. Forniamo tecniche, linee guida e best practice per ottenere una risoluzione spazio-temporale sufficiente utilizzando la microscopia confocale. Inoltre, discutiamo i limiti del nostro metodo di registrazione ottica. Nonostante queste limitazioni, il metodo dovrebbe consentire l'indagine di una varietà di fenomeni neurobiologici, tra cui la memoria e l'elaborazione sensomotoria.

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Protocollo

Tutte le procedure che utilizzano gli animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care Use Committee della California State University, Fullerton (Protocollo # 2023-1310).

1. Messa in scena del pesce zebra larvale in agarosio a basso punto di fusione

1. Allevare animali transgenici adulti che esprimono Tg(elav3:GCaMP6s)⁶ con due maschi e due femmine in conformità con le linee guida istituzionali per la cura degli animali. Gli adulti vengono collocati in apposite camere di riproduzione in modo che le uova rilasciate vengano catturate in una camera inferiore con un doppio fondo non accessibile agli adulti. Alle prime luci dell'alba o quando un divisorio di separazione viene rimosso, le femmine rilasciano le uova e i maschi fecondano le uova catturate nel falso fondo.
2. Rimuovere gli adulti e raccogliere gli ovuli fecondati utilizzando un colino per uova e metterli nel terreno dell'embrione (E3) (5 mM NaCl, 0,33 mM MgSO4, 0,33 mM CaCl2, 0,17 mM KCl, 1 mM HEPES, 0,00001% blu di metilene, pH 7,0)³⁰ con 14 ore di luce/10 ore di buio a 28,5 °C all'interno di un'incubatrice
   NOTA: La ricetta E3 utilizzata ha una bassa concentrazione di blu di metilene che non influisce sulla fluorescenza né porta ad alcun segnale di autofluorescenza significativo. Non richiediamo l'uso di 1-fenil 2-tiourea (PTU) alle età di sviluppo specificate nel protocollo a causa della traslucenza naturale offerta dalla linea transgenica GCaMP6s.
3. Montare gli animali 2-7 giorni dopo la fecondazione (dpf) utilizzando il 3% di agarosio a basso punto di fusione disciolto in terreno E3. Calore agarosio a una temperatura alla quale il pesce zebra può essere manipolato senza danneggiare l'organismo. Prima che l'agarosio con punto di fusione basso si raffreddi e si solidifichi (<1 min), posizionare le larve con il lato dorsale rivolto verso l'alto in una capsula di Petri con fondo di vetro in modo che la regione del cervello da ispezionare sia il più vicino possibile all'obiettivo, come mostrato nella Figura 1. A seconda dell'esperimento, in genere, sono sufficienti da 8 a 10 pesci zebra per gruppo sperimentale.
   NOTA: Gli animali non sono stati anestetizzati in questo protocollo.
4. Dopo che l'agarosio si è solidificato con la larva in posizione (circa 2-3 minuti), aggiungere 5 ml di soluzione E3. Quindi, tagliare l'agarosio con un bisturi come previsto dal protocollo sperimentale.
   NOTA: Diverse parti dell'agar devono essere tagliate, a seconda di quali parti del pesce zebra devono essere liberate dalla contenzione e/o ricevere un diverso tipo di stimolo.
5. Spostare la capsula di Petri contenente il pesce zebra sul tavolino del microscopio confocale e lasciare che il pesce si acclimati per 20 minuti.

2. Impostazione e imaging in microscopia confocale con applicazione di stimoli

1. Dopo il periodo di acclimatazione, centrare il pesce sotto l'obiettivo di immersione in acqua 40x (NA 1.0) a temperatura ambiente utilizzando un campo chiaro con una sorgente luminosa (~475 nm).
2. Le impostazioni di acquisizione del microscopio confocale dipenderanno dalle qualità e dal livello di espressione della molecola fluorescente, dalla profondità e dalle proprietà ottiche del tessuto, dalle dimensioni del campo visivo e dalla velocità di registrazione. Determinare le impostazioni appropriate utilizzando l'indicatore di portata per garantire una cattura ottimale della luce emessa in base alle esigenze sperimentali.
3. Garantire una corretta regolazione della potenza del laser e del guadagno master per catturare la luce fluorescente nella gamma ottimale, evitando così inutili perdite del segnale di fluorescenza dipendente da GCaMP6s. Utilizzare l'elenco delle impostazioni confocali chiave e dei fattori forniti di seguito per determinare le impostazioni appropriate.
   1. Dimensione del foro stenopeico: determinalo in base all'obiettivo utilizzato e impostalo in modo da accettare un singolo piano focale limitando gli altri piani focali. Per questo protocollo viene utilizzato un foro stenopeico di 32 μm.
   2. Potenza e lunghezza d'onda del laser: regola la potenza del laser in base al livello di espressione della molecola fluorescente e alla profondità e alle proprietà ottiche del tessuto. Utilizzare l'indicatore di portata per assicurarsi che il laser non superi la portata del fotorilevatore. Impostare la lunghezza d'onda di eccitazione sulla lunghezza d'onda della luce che eccita in modo ottimale la molecola fluorescente. Per questo esperimento, poiché i pesci erano eterozigoti per il transgene GCaMP6s e i livelli di espressione erano bassi, utilizzare il 5% di potenza laser a lunghezza d'onda di 488 nm, guadagno master 650. Con una forte espressione transgenica, la potenza del laser varia dall'1,5% al 3%, che di solito è sufficiente.
      NOTA: Se la potenza del laser è impostata su un valore troppo basso, le informazioni (luce rilevata dal tubo fotomoltiplicatore) andranno perse. Se la potenza del laser è impostata su un valore troppo alto, la luce emessa potrebbe superare la portata del rivelatore o danneggiare il campione (fotocandeggio).
   3. Guadagno master: Il guadagno master determina la sensibilità del fotorilevatore. Utilizzare l'indicatore di portata per assicurarsi che il guadagno master non sia impostato su un valore troppo alto, superando così la portata del fotorilevatore. Per questo esperimento, il guadagno master è impostato su 650.
   4. Campo visivo: assicurarsi che il campo visivo sia sufficientemente ampio da catturare il tessuto di interesse. Questa è una delle principali limitazioni per i microscopi confocali in generale, perché le dimensioni del campo visivo limitano la velocità di cattura, come mostrato nella Figura 2. Per gli esperimenti che coinvolgono AITC, impostare il campo visivo a 79,86 μm².
   5. Velocità di acquisizione: all'aumentare della velocità di acquisizione, la quantità di luce catturata dal fotorilevatore verrà ridotta. Poiché viene catturata meno luce, la qualità dell'immagine sarà degradata. Assicurati che la velocità di acquisizione bilanci la qualità dell'immagine e la velocità necessaria per catturare l'evento fisiologico di interesse. Qui, la velocità di acquisizione è impostata su 1,20 f/s.
4. Centrare il campo visivo su un cluster neuronale caudale alla commissura infima Halleri nella porzione rostrale del midollo spinale³⁰. Questo cluster è piuttosto piccolo a ~2,5 dpf ma è molto più grande più avanti nello sviluppo (7 dpf).
   NOTA: Se il montaggio dell'agarosio nel passaggio 1 non è ottimale, ovvero l'animale è posizionato ad angolo o troppo in profondità nell'agarosio, la qualità dell'immagine ne risentirà negativamente. Nella Figura 3 sono mostrate un'immagine del midollo spinale del pesce zebra in un animale ben posizionato e un'immagine contrastante del midollo spinale in un pesce zebra posizionato in modo non ottimale.
5. Esegui una scansione di serie temporali utilizzando un campo visivo di 79,86 μm² a 1,20 fotogrammi per s (fps) con una risoluzione spaziale di 0,119 μm² per pixel. Regola la dimensione del campo visivo e la velocità di acquisizione dell'immagine in base all'applicazione desiderata.
6. A 2 minuti dall'inizio dell'imaging, aggiungere 41,67 μl di una soluzione madre di AITC (concentrazione finale di 10 μM) o di una soluzione E3 alla piastra con una pipetta. Continuare la registrazione per ~30 s per osservare eventuali cambiamenti nell'attività di GCaMP6s nella regione di interesse con l'imaging time-lapse. Al termine della registrazione, liberare l'animale dall'agarosio e sopprimerlo secondo le linee guida istituzionali per la cura degli animali.
   NOTA: Durante la registrazione dell'attività di GCaMP6, la luce confocale stessa può essere uno stimolo. Questo deve essere considerato nell'analisi dei risultati dell'imaging. Il tempo di registrazione è una funzione del numero di fotogrammi e della velocità di acquisizione di ciascun fotogramma, che può essere regolata secondo necessità per il tempo desiderato.

3. Analisi del segnale GCaMP utilizzando FIJI

1. Dopo la registrazione, se l'output non è nel formato di file .tif per l'analisi FIJI a valle, esportare i file di immagine come file .tif dalla suite software del microscopio.
2. Scarica FIJI per l'analisi delle tracce neurali. Apri FIJI, importa i file .czi nel programma e, quando richiesto, utilizza le impostazioni predefinite nel plug-in BioFormats.
3. Evidenzia un'area/neurone di interesse utilizzando gli strumenti Cerchio o Mano libera facendo clic sulle rispettive icone. (Passando il mouse sopra le icone lampeggerà il nome dello strumento nel programma.)
   NOTA: Poiché le dimensioni dell'area di interesse variano, non è possibile creare aree/cerchi fissi. Un software che consente la registrazione dei cambiamenti fluorescenti nel tempo come voxel, come il pacchetto Thunder³², potrebbe consentire il rilevamento di singoli neuroni; Tuttavia, per i ~20 neuroni nell'esperimento attuale, il rilevamento dei bordi della membrana da parte di un osservatore cieco sarebbe probabilmente superiore a un sistema di rilevamento automatizzato.
4. Dopo aver selezionato un ROI, nella barra degli strumenti FIJI, fare clic su Analizza > Strumenti > ROI Manager. Successivamente, fai clic su Aggiungi [t] e il ROI selezionato verrà aggiunto alla finestra ROI Manager.
5. All'interno di ROI Manager, fai clic su Altro > Multi Measure. Lasciare le impostazioni predefinite e fare clic su OK. Le FIJI produrranno dati grezzi che possono essere manipolati come file CSV utilizzando Python o come dati grezzi in un foglio di calcolo.
6. Per normalizzare i dati non elaborati e rappresentarli come una traccia neurale per una determinata area di interesse, calcolare la media degli ultimi valori di ~30 s della finestra di 2 minuti prima dello stimolo e normalizzare tutti i valori post-stimolo al valore medio di base:
   Intensità di fluorescenza normalizzata = (fluorescenza istantanea di una data regione di interesse post-stimolo)/(fluorescenza media di ~30 s di un intervallo di 2 minuti pre-stimolo)
7. Tracciare i dati come tracce neurali, come mostrato nella Figura 4.
   NOTA: In alcuni tipi di microscopie, come la microscopia a foglio ottico, in cui viene registrato un volume del cervello, gli artefatti di movimento vengono indirizzati tramite la registrazione spaziale post-elaborazione a un volume cerebrale di riferimento ^1,11. Tuttavia, poiché stiamo registrando solo da un singolo piano, non è possibile effettuare regolazioni per gli artefatti di movimento. Pertanto, per i risultati mostrati qui, non è stato rimosso alcun fotogramma. Tuttavia, se gli artefatti di movimento dovessero alterare in modo significativo i risultati, i sistemi automatizzati potrebbero identificare e correggere i fotogrammi con artefatti di movimento^{1, 11}, oppure un osservatore cieco potrebbe rimuovere tali fotogrammi.

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Risultati

La somministrazione di isotiocianato di allile provoca un segnale neurale associato al calcio nelle larve di pesce zebra
La somministrazione di AITC (fase 2.6) provoca un aumento diffuso dell'attività neurale associata a GCaMP6s in tutto il cervello del pesce zebra larvale ^11,30. Abbiamo osservato un aumento del segnale fluorescente in una piccola regione del cervello dopo l'applicazione di AITC, come mostrat...

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Discussione

Abbiamo dimostrato che l'attività neurale può essere registrata nel cervello delle larve di zebrafish utilizzando GCaMP6 insieme alla microscopia confocale; le minori velocità di cattura richieste a causa della cinetica più lenta delle GCaMP possono essere compensate riducendo l'area cerebrale osservata⁶. Sono disponibili reporter con dinamiche temporali più veloci (ad esempio, GCaMP6f), ma la risoluzione temporale superiore di solito va a scapito di un segna...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low Melting Point Agarose	Invitrogen	16520-100	Diluted to 3%
Allyl Isothiocyanate (AITC)	Sigma Aldrich	377430	Chemical stimulant
E3	N/A	N/A	Water-medium for zebrafish larvae
Glass Bottom Dishes	Thermo Fisher Scientific	12-567-400	Used to hold zebrafish during imaging experiments
Micropipette (10-100 uL)	Cole-Parmer	21600-14	Apparatus used for creating AITC dilutions
Microscope Slides	Fisherbrand	12-550-A3	Used to screen for phenotype
Mirror Finish Forceps	DUMONT	11251-23	Used to orient zebrafish in agarose
myTEMP Mini Digital Incubators	Benchmark	H2200-HC	Holding area for zebrafish; set to 28.5°C
Nitrile Gloves	MedPRIDE	MPR-50504	Basic PPE
Petri Dishes	VWR	89107-632	Container for zebrafish
Posi-Click Tubes	DENVILLE	C-2171	Used for AITC dilution
Samco Polyurethane Transfer Pipettes	Thermo Fisher Scientific	225	Apparatus used to select animal/administer diluted bolus of AITC
Stemi SV11 Apo Microscope	Zeiss	1.25496E+11	Used to stage zebrafish
Transgenic Larval Zebrafish (2 to 7 DPF)	N/A	N/A	Animal test subjects; Tg(elav3:GCaMP6s) strain
Zeiss Confocal Microscope (Model LSM9)	Zeiss	3523004097	Imaging of fish