Disegni microfluidici di laminazione in polietilene tereftalato a basso costo per l'imaging multiplexato di zebrafish

Riepilogo

Un metodo innovativo per la fabbricazione di dispositivi microfluidici utilizzando la laminazione in polietilene tereftalato (PET) riduce significativamente il costo e la complessità dell'intrappolamento e dell'imaging di più embrioni vivi di pesce zebra.

Abstract

Gli embrioni di zebrafish sono trasparenti e quindi particolarmente adatti per l'imaging intravitale non invasivo di processi fondamentali, come la guarigione delle ferite e la migrazione delle cellule immunitarie. I dispositivi microfluidici sono utilizzati per l'intrappolamento per supportare l'imaging a lungo termine di organismi multicellulari, incluso il pesce zebra. Tuttavia, la fabbricazione di questi dispositivi utilizzando la litografia morbida richiede strutture specializzate e competenza nella stampa 3D, che potrebbero non essere accessibili a tutti i laboratori. Il nostro adattamento di un metodo di laminazione in polietilene tereftalato a basso costo sviluppato in precedenza per la costruzione di dispositivi microfluidici aumenta l'accessibilità consentendo la fabbricazione e l'iterazione del progetto per una frazione dell'investimento tecnico delle tecniche convenzionali. Utilizziamo un dispositivo realizzato con questo metodo, il Rotational Assistant for Danio Imaging of Subsequent Healing (RADISH), per consentire il trattamento farmacologico, le ferite manuali e l'imaging a lungo termine di un massimo di quattro embrioni nello stesso campo visivo. Con questo nuovo design, siamo riusciti a catturare le caratteristiche morfologiche macroscopiche del segnale del calcio intorno all'ablazione laser e alle ferite di trassezione manuale per più embrioni nelle 2 ore immediatamente successive alla lesione, nonché il reclutamento dei neutrofili sul bordo della ferita per 24 ore.

Introduzione

La capacità di rispondere adeguatamente alle lesioni è fondamentale per la sopravvivenza di ogni organismo su ogni scala, da una singola cellula a più tessuti. La ferita e le sue risposte associate, come il reclutamento dei fagociti nelle aree danneggiate¹ sono, quindi, argomenti significativi nella biologia cellulare e tissutale. Le ferite vengono rilevate immediatamente dopo la rottura della barriera tissutale, causando una risposta del gradiente tissutale che coinvolge la contrazione della ferita ^2,3 che coordina la guarigione della ferita e la successiva ricrescita⁴. A causa della natura meccanica di questa contrazione, gli strumenti utilizzati durante la sperimentazione non devono ostacolare fisicamente il movimento delle cellule vicino al sito della lesione.

Gli embrioni di zebrafish sono un modello eccellente per studiare lo sviluppo e la malattia, compresa la risposta della ferita dei vertebrati, grazie alla loro facilità di cura, trattabilità genetica e trasparenza ottica ^5,6. Tuttavia, è necessario immobilizzare l'intero organismo per un periodo prolungato per studiare il comportamento a lungo termine delle cellule vicino a un sito di lesione. L'inclusione di embrioni in agarosio a basso punto di fusione è sufficiente per l'imaging a breve termine di tessuto non ferito. Tuttavia, la matrice di gel circostante limita la contrazione e il rilassamento delle ferite e impedisce la crescita degli embrioni in via di sviluppo nel tempo ^7,8,9.

I dispositivi microfluidici possono immobilizzare embrioni di zebrafish in diversi stadi di sviluppo 10,11,12,13,14,15,16 e alcuni, come lo zWEDGI 7, possono ospitare l'avvolgimento manuale. Tuttavia, ci sono diversi svantaggi nei design dei dispositivi disponibili. Ad esempio, molti dispositivi stampati direttamente su plastica sono incompatibili con l'imaging su sistemi di microscopio invertito a causa della scarsa trasparenza ottica. Inoltre, i canali paralleli consentono l'imaging multiposizionale^10,11, ma il movimento fisico del tavolino del microscopio introduce un ritardo nell'acquisizione dell'immagine. L'iterazione e l'ottimizzazione ripetute per risolvere questi problemi sono difficili se si considera l'investimento finanziario e tecnico richiesto per ogni nuovo progetto, in particolare per gli attuali metodi gold standard di fabbricazione di dispositivi che utilizzano la litografia morbida in polidimetilsilossano (PDMS). Il primo passo, la creazione di uno stampo master, richiede spesso la conoscenza del software di modellazione 3D, l'accesso ad attrezzature di fabbricazione specializzate e (a seconda del materiale utilizzato) un ulteriore trattamento antiaderente come la silanizzazione prima che lo stampo venga utilizzato. L'indurimento del PDMS una volta versato richiede almeno un'ora ad alte temperature e, generalmente, deve essere eseguito sotto vuoto o con una pinza per ottenere i migliori risultati, spesso in una camera bianca ^7,17,18. Come nella biologia dello sviluppo, questi costi possono rivelarsi rapidamente proibitivi per esperimenti che richiedono molti ambienti microfluidici unici su più modelli.

Tra i materiali da costruzione alternativi disponibili, il polietilene tereftalato (PET) è durevole, atossico e facile da manipolare. I fogli in PET sono buste di laminazione in plastica ampiamente disponibili nella maggior parte dei negozi di forniture per ufficio, con adesivo attivato termicamente preapplicato (generalmente etilene vinil acetato). Modellando questi fogli di PET utilizzando taglierine artigianali disponibili in commercio (ad esempio, plotter da taglio controllati da computer progettati per gli artigiani domestici) e facendo aderire gli strati l'uno all'altro utilizzando apparecchiature di laminazione termica standard, è possibile generare e iterare rapidamente un'ampia gamma di potenziali progetti. Abbiamo quindi adattato un metodo di progettazione e costruzione precedentemente descritto che coinvolge il PET¹⁸ impilato per creare l'Astativo razionale per ilmaging D anio Idi Subsequent Healing (RADISH) (Figura 1A, B). Una disposizione rotazionale di diversi canali di contenimento a forma di cuneo ottimizza la prossimità e lascia spazio per la transezione manuale della pinna caudale, l'imaging immediatamente dopo la ferita e l'imaging simultaneo a lungo termine di più embrioni di pesce zebra feriti all'interno dello stesso campo visivo. Inoltre, questo metodo di costruzione riduce drasticamente i costi di capitale iniziali e il tempo necessario per la costruzione del dispositivo, mantenendo al contempo la riutilizzabilità.

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Protocollo

Questo studio ha utilizzato embrioni 3 giorni dopo la fecondazione (dpf), ma può essere progettato per utilizzare embrioni da 2 a 14 dpf. L'esperimento del pesce zebra è stato condotto secondo standard accettati a livello internazionale. Il protocollo per la cura e l'uso degli animali è stato approvato dal Purdue Animal Care and Use Committee (PACUC), aderendo alle linee guida per l'utilizzo del pesce zebra nel programma di ricerca intramurale NIH (numero di protocollo: 1401001018).

1. Assemblaggio del dispositivo microfluidico PET

NOTA: Qualsiasi parte di questo protocollo può essere messa in pausa in qualsiasi momento, ad eccezione dei passaggi 1.8 e 1.9, che sono sensibili al tempo di asciugatura del cianoacrilato.

1. Progetta il modello per il dispositivo nel software scelto (ad esempio, Adobe Illustrator, Figura 1A). A seconda dell'età e delle dimensioni dell'embrione, regolare la larghezza del canale e le dimensioni della camera di imaging centrale per una migliore vestibilità.
   1. Salva ogni livello come un singolo file immagine con dimensioni identiche. Assegnare un nome a ciascun file in modo che lo spessore del foglio da utilizzare e l'ordine di assemblaggio siano evidenti.
2. Inizializzare la macchina da taglio secondo le istruzioni del produttore.
3. Carica ogni modello progettato sul software di progettazione per il taglio.
   1. Nell'area di lavoro di progettazione, seleziona i disegni appena caricati. Raggruppare i modelli destinati allo stesso spessore di foglio di PET nello stesso taglio (Figura 2A). Se necessario, regolare nuovamente le dimensioni dei modelli nel software di progettazione alle dimensioni corrette.
   2. Confermare il numero e il tipo di motivi nel taglio, quindi selezionare il materiale tagliato.
      NOTA: I fogli di PET potrebbero non essere una scelta di materiale nel software di progettazione, anche con nomi come "busta di laminazione in plastica". È possibile selezionare qualsiasi materiale di spessore e consistenza simili (ad esempio, fogli trasparenti o vinile non adesivo).
   3. Fissare i fogli di PET al tappetino da taglio, premendo con decisione per rimuovere le bolle d'aria, e caricare il tappetino nella macchina da taglio. Seguire le istruzioni sullo schermo per richiedere alla macchina da taglio di iniziare il taglio.
   4. Rimuovere i tagli finiti dal tappetino da taglio. Se necessario, regolare i modelli di taglio utilizzando un taglierino o una lama per bisturi.
      NOTA: I file immagine utilizzati per creare il design del ravanello (Figura 1A) sono disponibili per il download come formati di file vettoriali e PNG (File supplementare 1). Se la macchina da taglio si solleva, si strappa o non riesce a tagliare in modo netto il foglio di PET, prendere in considerazione la sostituzione del tappetino da taglio.
4. Allineare gli strati sul vetrino coprioggetti, senza assistenza o con crocini di registro pretagliati. Se è possibile fissare più strati insieme prima della laminazione, allinearli contemporaneamente.
5. Fissare gli strati con del nastro adesivo per ufficio per evitare che si spostino durante la laminazione (Figura 2B). A seconda delle dimensioni del dispositivo e della capacità della plastificatrice, montare i modelli piccoli su un supporto più grande con più nastro adesivo per evitare di inceppare o intasare l'alimentazione della plastificatrice (Figura 2C).
   NOTA: Il supporto utilizzato nella laminazione NON è lo stesso del tappetino da taglio e serve principalmente a fornire trazione alla plastificatrice. Qualsiasi materiale resistente al calore di spessore trascurabile funzionerà come supporto (inclusi, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, cartoncino, carta da ufficio piegata o un foglio di PET più grande).
6. Accendere la plastificatrice e laminare secondo le istruzioni del produttore. Rimuovere il nastro adesivo prima di allineare lo strato successivo (Figura 2D).
7. Ripetere i passaggi da 1.4 a 1.6 fino a quando tutti i livelli non sono stati rispettati.
8. Fissare il dispositivo a un piatto da 35 mm praticato con un foro da 3/4" utilizzando colla cianoacrilica (Figura 2E, F). Regolare la forma e il tipo di piatto in base alle esigenze sperimentali (ad esempio, qualsiasi contenitore abbastanza grande da ospitare il dispositivo: un pozzetto in una piastra a 24 pozzetti o una piastra di Petri più grande). Usa abbastanza colla per sigillare completamente il dispositivo al piatto senza allagarlo.
   NOTA: Il fissaggio del dispositivo a un piatto di supporto non è necessario per il funzionamento del dispositivo. ATTENZIONE: Il cianoacrilato lega pelle e occhi in pochi secondi e irrita il sistema respiratorio, gli occhi e la pelle. Indossare protezioni per mani e occhi e lavorare in un'area ben ventilata.
9. Impermeabilizzare il laminato PET rivestendo accuratamente i bordi esterni del dispositivo con colla cianoacrilica (Figura 2F). Usa abbastanza colla per coprire completamente i bordi esterni. Lasciare indurire la colla per almeno 2 ore prima dell'uso.
   NOTA: Garantire uno spazio adeguato per lo sfiato dei fumi di cianoacrilato. L'accumulo di fumi può causare il deposito di cianoacrilato sul dispositivo, oscurando il materiale otticamente trasparente.

2. Posizionamento degli embrioni all'interno del RAVANELLO e preparazione per l'imaging

1. Allevare embrioni di pesce zebra nel terreno standard per l'allevamento di embrioni E3¹⁹. Se necessario, decorionare gli embrioni almeno 1 ora prima dell'imaging per consentirne l'appiattimento. Questo esperimento ha utilizzato embrioni a 3 dpf, ma gli embrioni possono arrivare fino a 14 dpf (Figura 1E).
2. Colorare o trattare gli embrioni in base alle esigenze sperimentali.
   NOTA: In questi esperimenti, le membrane cellulari dello strato epiteliale esterno sono state colorate, se necessario, incubando con 100 nM di MemGlow 560.
3. Anestetizzare gli embrioni con 164 mg/L MS-222²⁰.
   NOTA: L'esatta concentrazione e l'anestetico utilizzati possono essere regolati in base alle preferenze dello sperimentatore. La concentrazione di anestetico può essere ridotta per consentire uno sviluppo efficace durante le immagini a lungo termine (vedere il passaggio 4.1).
4. Riempire il contenitore contenente il dispositivo montato con 5 mL di E3 contenente 164 mg/L di MS-222.
5. Utilizzando una pipetta di trasferimento, depositare un embrione anestetizzato in ciascuna camera di contenimento del dispositivo. Assicurarsi che gli embrioni rimangano immersi nel liquido per tutta la durata dell'imaging.
   NOTA: Il design RADISH può immobilizzare 1-4 embrioni.
6. Utilizzando un anello per capelli, orientare gli embrioni in modo tale che la coda dell'embrione sporga nella camera di imaging centrale e il tuorlo sia saldamente immobilizzato nel canale a forma di cuneo (Figura 1C).
   NOTA: L'orientamento degli embrioni può essere eseguito con uno stereomicroscopio per facilitare la manipolazione.
7. Se lo si desidera, fissare la testa dell'embrione aggiungendo l'1,5% di agarosio a basso punto di fusione nella camera di contenimento utilizzando una micropipetta.
8. Spostare il dispositivo con gli embrioni nel sistema di imaging scelto per iniziare l'imaging.

3. Imaging dei transitori di calcio dopo la ferita

NOTA: Questa sezione e la sezione 4 sono facoltative e fornite come potenziali esperimenti di esempio.

1. Selezionare il sistema e l'obiettivo appropriati per l'imaging.
   NOTA: Qui, un confocale a scansione laser invertita è stato dotato di un obiettivo 20x.
2. Regolare la messa a fuoco del campione e i parametri di imaging (ad esempio, potenza laser: 5, guadagno: 90, dimensione del foro stenopeico: 2 UA, tempo di esposizione [velocità di scansione: 1 fotogramma/s]) per un rapporto segnale/rumore e una velocità di acquisizione ottimali.
   NOTA: Si consiglia di prefocalizzare i campioni e di regolare i parametri per ciascun canale del sistema di imaging scelto prima dell'avvolgimento per ridurre il ritardo tra la formazione della ferita e l'acquisizione dell'immagine.
3. Ferita un embrione Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) x (cdh1-dTomato)^xt1821,22.
   1. Per ferire l'embrione tramite transezione manuale, applicare una pressione con una lama di bisturi sul tessuto della pinna caudale sulla punta della notocorda sotto uno stereomicroscopio (Video 1), quindi rimettere il dispositivo sul tavolino.
      ATTENZIONE: L'applicazione di una pressione eccessiva con la lama del bisturi può rompere il vetro sottostante. Se il vetro si rompe, gettare il dispositivo e ricominciare dal passaggio 1.2.
   2. Per ferire l'embrione tramite stimolazione laser, definire una regione di interesse (ROI) vicino al bordo della piega della pinna caudale e stimolare in base alla potenza laser disponibile.
      NOTA: In questo caso, una potenza laser di 2,4 W per 30 s a 800 nm era sufficiente per indurre una ferita a tutto spessore.
4. Immagine a temperatura ambiente utilizzando i canali GFP (eccitazione 488 nm, emissione 510 nm) e RFP (eccitazione 561 nm, emissione 610 nm) utilizzando un intervallo di fotogrammi di 1 min per un totale di 1 ora.
5. (Facoltativo): se necessario, rilasciare gli embrioni per il prelievo dopo l'imaging tramite aspirazione delicata vicino alla testa utilizzando una pipetta di trasferimento o facendo roteare il piatto.

4. Imaging del reclutamento dei neutrofili dopo la ferita

1. Almeno 1 ora prima dell'imaging, trasferire gli embrioni in E3 contenente metà della concentrazione standard di anestetico, in questo caso 82 mg/L MS-222.
2. Selezionare l'obiettivo appropriato per l'imaging (in questo caso, un confocale a scansione laser invertita dotato di un obiettivo 10x).
3. Regolare la messa a fuoco del campione e i parametri di imaging (ad esempio, potenza laser: 5, guadagno: 90, dimensione del foro stenopeico: 2 UA, tempo di esposizione [velocità di scansione: 0,5 fotogrammi/s])) per un rapporto segnale/rumore e una velocità di acquisizione ottimali.
   NOTA: Si consiglia di prefocalizzare i campioni e di regolare i parametri per ciascun canale del sistema di imaging scelto prima dell'avvolgimento per ridurre il ritardo tra la formazione della ferita e l'acquisizione dell'immagine.
4. Avvolgere quattro embrioni Tol2(mpx:Dendra2)²³ tramite trassezione manuale applicando pressione con una lama di bisturi sul tessuto della pinna caudale sotto uno stereomicroscopio, quindi riportare il dispositivo sul tavolino.
5. Cattura l'immagine sul canale GFP (eccitazione 488 nm, emissione 510 nm) a temperatura ambiente utilizzando un intervallo di fotogrammi di 5 minuti per 24 ore.
6. Se necessario, rilasciare gli embrioni per il recupero dopo l'imaging tramite aspirazione delicata vicino alla testa utilizzando una pipetta di trasferimento o facendo roteare il piatto.

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Risultati

Per il confronto della qualità dell'immagine prodotta da un confocale a scansione laser con e senza l'ausilio del RADISH, gli embrioni che esprimono il biosensore intensiometrico di calcio GCaMP6f^22,24 nello strato epiteliale esterno sono stati colorati utilizzando MemGlow 560 e riprodotti con un confocale a scansione laser invertita che copre l'intero spessore della piega della pinna caudale a un intervallo di tempo di 1 minuto...

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Discussione

La premessa principale del metodo di laminazione del PET prevede la riduzione dei costi e la minimizzazione delle barriere tecniche all'ingresso rispetto ai mezzi tradizionali di creazione di dispositivi microfluidici, come la litografia morbida o lo stampaggio PDMS. Pertanto, gli unici passaggi critici di questo protocollo sono l'allineamento accurato degli strati di PET durante la laminazione e l'impermeabilizzazione dei bordi del dispositivo dopo la costruzione. Tutte le altre parti d...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 mm diameter round coverglass #1 thickness	Chemglass Life Sciences	CLS-1760-025	Base mounting material. Thickness was chosen based on the specifications of the microscope lens.
Adobe Illustrator v28.5	Adobe	N/A	Vector editor for designing the device pattern.
Calcium Chloride Dihydrate	Fisher	C79	For making E3 medium.
Design PNG Files (Online Mirror)	N/A	N/A	https://i.ibb.co/QPYj7BL/multipositionalv7-1.png https://i.ibb.co/FDpQYXc/multipositionalv7-2.png https://i.ibb.co/5TG4SB6/multipositionalv7-3.png
Design Space for Desktop v8.39	Cricut	N/A	Proprietary software to drive the craft cutter.
Fusion Plus 7000L	GBC	1703098	Thermal laminator. This specific model was selected for quality of life features, such as maximum sheet stack size.
German Carbide Premium Blade	Cricut	10396595	Replacement blade for craft cutter.
Gray Basic Tool Set	Cricut	10307854	Tool set for weeding cuts, cleaning mats, and mounting PET sheets. Optional.
Magnesium Chloride Hexahydrate	Acros Organic	223211000	For making E3 medium.
Maker 3	Cricut	10669040	Craft cutter. The Cricut Maker 3 was selected over the Silhouette Cameo 4 for software user friendliness, but any craft cutter capable of reading black and white images will work.
MemGlow 560	Cytoskeleton	MG02-10	Red live cell dye for cell membranes. No washing needed. Used in Figure 3.
No. 22 Carbon Scalpel Blade	Surgical Design	22-079-697	Scalpel blade for manual cut adjustments. Any similar craft knife (e.g., X-acto #2 knife) will also work.
Potassium Chloride	Fisher	BP366	For making E3 medium.
Sodium Chloride	Fisher	BP358	For making E3 medium.
StandardGrip Adhesive Cutting Mat	Cricut	10138842	Mounting mat for craft cutter. The LightGrip cutting mat will also work, but avoid the StrongGrip and FabricGrip cutting mats as the strength of the adhesive may warp the final cut during weeding and removal. Adhesive on mats will eventually wear out with continued use; replace mats as needed.
Stationery Tape 12 mm	Deli	30014	Office tape. Deli brand was chosen via testing for ease of removal after lamination.
Super glue, liquid	Loctite	1364076	Cyanoacrylate glue. Glue used must be liquid. Gel formulations will not sufficiently seal or waterproof device edges.
PET Thermal Laminating Pouches, 3 mil	Scotch	TP3854	PET sheets with thermal adhesive. Sheets arrive as sandwiched pairs and should be separated before use. Cut with adhesive side facing down.
PET Thermal Laminating Pouches, 5 mil	Scotch	TP5854	PET sheets with thermal adhesive. Sheets arrive as sandwiched pairs and should be separated before use. Cut with adhesive side facing down.
Tricaine (MS-222)	Syndel	IC10310680	Fish anaesthetic.