Sintesi in fase solida

1. Caricamento della resina

1. In un recipiente di sintesi peptidica da 100 ml, aggiungere resina di cloruro di 2-clorotrityl (CTC) (1,1 mmol / g, 0,360 g, 0,400 mmol). Aggiungere 20 mL DMF e lasciarli gonfiare per 30 minuti sotto N_2.
2. Scolare le perle sotto vuoto e aggiungere 10 mL di DMF.
3. Aggiungere 500 mg di Fmoc-Ala-OH (1,60 mmol) e 2,5 mL i-Pr₂EtN e mescolare sotto N₂ per 15 minuti.
4. Scaricare il solvente sotto vuoto e ripetere il caricamento con Fmoc-Ala-OH per 15 min.
5. Scaricare il solvente sotto vuoto e lavare le perle con 10 ml DMFunder N₂e scaricare sotto vuoto 3x.

2. Deprotezione del Gruppo Fmoc

1. Aggiungere 10 mL 20% 4-metilpiperidina in DMF e mescolare le perle sotto N₂ per 15 min.
2. Scaricare il solvente sotto vuoto e ripetere la deprotezione.
3. Lavare le perle con 10 mL DMF sotto N₂ e scolare sotto vuoto 3x.

3. Esecuzione del Kaiser Test

1. Eseguire il test Kaiser aggiungendo 1-2 gocce di soluzione A (0,5 mL 0,01 M KCN, 24,5 mL piridina), soluzione B (1 g ninidrina, 20 mL n-butanolo) e soluzione C (20 g fenolo, 10 ml n-butanolo)ciascuna in due provette. Una provetta sarà il controllo mentre l'altra monitorerà la reazione.
2. Aggiungere alcune pere di resina dal recipiente di reazione alla provetta di reazione e riscaldare le due provette a 110 °C.
3. Se la deprotezione è completa, il contenuto della provetta diventerà di un colore blu scuro/viola. Se la deprotezione è incompleta o non riuscita, la soluzione rimarrà gialla. Confrontare la provetta di reazione con la provetta di controllo.

4. Accoppiamento dei prossimi elementi costitutivi

1. Scaricare il solvente sotto vuoto.
2. Lavare le perle con 10 ml di N-metil-2-pirrolidone sotto N₂ e scaricare il solvente sotto vuoto.
3. Per iniziare l'accoppiamento successivo, aggiungere 10 mL NMP, 620 mgFmoc-Phe-OH (1,6 mmol), 610 mg HBTU (1,6 mmol) e 2,5 mLi-Pr₂EtN e lasciare bollire la resina sotto N₂ per 30 minuti.
4. Scaricare il solvente sotto vuoto.
5. Lavare le perle con 10 mL DMF sotto N₂ e scolare sotto vuoto 3x.
6. Eseguire il test Kaiser (vedere i passaggi 3.1-3.3) per cercare il completamento dell'accoppiamento. Le pere e la soluzione nella provetta devono essere gialle.

5. Scindere il peptide dalla resina

1. Scindere il gruppo Fmoc rimanente utilizzando i passaggi 2.1-2.3.
2. Dopo che il solvente è stato drenato sotto vuoto, aggiungere 40 mL di soluzione di scissione (95% TFA, 2,5% H₂O, 2,5% TIPS) alla resina e bolle sotto N₂ per 3 ore.
3. Posizionare un nuovo pallone ricevente sul sintetizzatore peptidico e scolare la soluzione di FIA contenente il peptide desiderato sotto vuoto nel nuovo matraccio.

6. Precipitazione e I solazione del peptide

1. Separare la soluzione di TFA in 4 flaconcini conici e aggiungere 25 mL di etere freddo (-20 °C) a ciascun flaconcino per precipitare il peptide.
2. Centrifugare i flaconcini (3.000 giri/min, 0-4 °C) per 20 min. Decantare il TFA rimanente e la soluzione di etere dalle fiale coniche e concentrare il precipitato peptidico per consentire il dipeptide desiderato come solido bianco.