Questo materiale si basa su ricerche supportato (o in parte sostenuto dal) l&#39;Ufficio commercializzazione della tecnologia, Salt Lake City, UT, Ufficio di Ricerca e Sviluppo, Riabilitazione R &amp; D Service, DVA SLC sistema sanitario, Salt Lake City, UT, Dipartimento della Difesa PRMRP Grant (n. PR054520), il presidente Albert Hofmann &amp; Margaret e il Dipartimento di Ortopedia, University of Utah School of Medicine, Salt Lake City, UT; Supporto tecnico per le simulazioni è stato fornito dal Centro per Integrativo Computing Biomedica di Scientific Computing e Imaging Istituto ed è stato reso possibile in parte dal software dal NIH / NCRR Computing Center for Integrative Biomedica, P41-RR12553-07. Ulteriori gratitudine è estesa a Gwenevere Shaw per assistenza manoscritto preparazione e Dustin Williams per l&#39;immagine del biofilm.

Parte 1: Utilizzando la Tomografia Computerizzata (TC) per la ricostruzione Amputato <ol><li> Retrospettiva TAC sono stati raccolti presso la University of Utah e del Dipartimento della Veteran Affairs Hospital dopo aver ottenuto l&#39;approvazione IRB e HIPAA. </li><li> TAC sono stati selezionati perché permettono una chiara distinzione tra i tipi di tessuto sulla base di raggi X assorbenza. </li><li> TA sono stati ispezionati manualmente e inclusi nello studio in base all&#39;assenza di impianti metallici per evitare artefatto dell&#39;immagine. </li></ol> Parte 2: generazione di modelli con Seg3D <ol><li> I file sono stati scaricati come immagini Dicom e caricati in Seg3D (versione 1.11.0, software.sci.utah.edu) come un nuovo volume. </li><li> Un filtro mediano è stato utilizzato per lisciare i volumi importati prima di determinare le strutture del tessuto geometricamente definiti. </li><li> I confini del tessuto delle ossa, midollo osseo, organi e tessuto adiposo sono state generate dalla soglia dei file CT interattivo (Figura 1). <img src="/files/ftp_upload/1237/1237fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: Una sezione sagittale di un arto amputato residuo thresholded e separati in tipi di tessuti specifici. </li><li> La muscolatura è stato ottenuto impostando manualmente i punti di semi all&#39;interno del tessuto muscolare thresholded e con una fiducia collegata filtro per trovare tutto il tessuto collegato ai punti di seme. Questo passo eliminato tessuti errate che possono essere stati raggruppati con il muscolo in base a capacità di assorbimento simili TA. </li><li> La pelle, che era impossibile distinguere in modo affidabile a immagini TAC, è stato generato da dilatare il più esterno tessuto 2 millimetri in base allo spessore della pelle media per produrre uno strato di spessore omogeneo che circondava il modello di piena 1. </li><li> Segmentazioni sono stati ispezionati manualmente, corretto per assicurare l&#39;accuratezza e combinati in una gerarchia in una mappa singola etichetta per l&#39;analisi agli elementi finiti (Figura 1). <img src="/files/ftp_upload/1237/1237fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2: Rappresentante modello gerarchico di un amputato bilaterale creato con Seg3D. </li></ol> Parte 3: Preparazione per l&#39;analisi agli elementi finiti <ol><li> A 10 centimetri impianto è stato progettato in Matlab per servire come dispositivo impiantato ortopedico e catodo per la stimolazione elettrica e importati in SCIRun (versione 4.0, software.sci.utah.edu). </li></ol> Parte 4: il posizionamento degli elettrodi e Design <ol><li> SCIRun è stato utilizzato per la progettazione di elettrodi in quanto supporta il posizionamento dell&#39;elettrodo interattive e di simulazione. </li><li> Una rete è stata creata e moduli organizzati con funzioni specifiche per la generazione della mesh (Figura 3). I moduli sono stati importanti per definire le condizioni al contorno, conducibilità dei tessuti, rifiniture in rete, generando Matlab istogrammi, i dati dei campi di registrazione, ecc (Tabella 1). <img src="/files/ftp_upload/1237/1237fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3: immagine della rete Rappresentante di uno studio pilota utilizzando una configurazione a due elettrodi esterni band. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Tabella 1 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Conducibilità Assegnato a tessuti segmentati </td></tr><tr><td> Tipo di tessuto </td><td> Conducibilità [S / m] </td></tr><tr><td> Organo </td><td> 0,22 </td></tr><tr><td> Pelle </td><td> 0,26 </td></tr><tr><td> Adiposo </td><td> 0,09 </td></tr><tr><td> Muscolo </td><td> 0,25 </td></tr><tr><td> Ossea corticale </td><td> 0,02 </td></tr><tr><td> Midollo Osseo </td><td> 0,07 </td></tr></tbody></table></li><li> Le configurazioni per gli elettrodi consisteva in un elettrodo di una patch, due elettrodi di patch, una banda fissi e due bande continue. </li><li> Bande di elettrodi esterni sono stati applicati al moncone dei modelli generati da paziente TAC e sono stati di 1,6 cm di spessore. </li><li> Patch elettrodi sono stati collocati su una striscia che copre circa la metà del diametro del moncone ed erano 3 cm di spessore. </li><li> L&#39;impianto interno corticale che ha rappresentato l&#39;impianto osteointegrati è stato impostato per consentire diametro endosseo per una vestibilità perfetta e riempire l&#39;impianto 2. </li></ol> Parte 5: Finite Element Analysis <ol><li> Le simulazioni sono stati generati partendo dal presupposto che le metriche elettrico può essere calcolato utilizzando un approccio quasi-statico, senza dipendenza dal tempo. </li><li> Il modello è stato calcolato risolvendo l&#39;equazione di Laplace per ogni tipo di tessuto generato dal segmentazioni Seg3D. </li><li> Le condizioni al contorno sono formate dagli elettrodi che iniettato correnti e le linee guida che sono rimasti corrente all&#39;interno del corpo. </li><li> Dal momento che gli elettrodi e l&#39;impianto ha una conducibilità molto più grande dei tessuti circostanti, era unssumed che l&#39;impianto (catodo) era ad un potenziale costante, allo stesso modo gli elettrodi di superficie sono stati modellati con una differenza di potenziale costante dall&#39;impianto percutanea. </li><li> Per valutare l&#39;efficacia della configurazione degli elettrodi e dimensionamento, paziente modelli specifici sono stati sviluppati e il potenziale elettrico intorno all&#39;interfaccia impianto è stato utilizzato per determinare l&#39;intensità di campo localizzato. </li><li> Il modello è stato generato usando una maglia esaedriche che consisteva di circa 1,8 milioni di elementi che sono stati trattati come tratti omogenei, ohmico e isotropo. </li><li> Il modello ottimale per questo esperimento è stato scelto con un parente differenza &lt;5% in gradienti di tensione confermato con uno studio di sensibilità mesh per garantire la precisione del modello (Tabella 2). <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" width="305"><tbody><tr><td> Tabella 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> Mesh studio di sensibilità per Amputato Modello </td><td></td></tr><tr><td> Maglia </td><td> Elementi </td><td> Nodi </td><td> Differenza relativa </td></tr><tr><td> 100 100 50 </td><td> 149089 </td><td> 161131 </td><td> 0,0995 </td></tr><tr><td> 125 125 75 </td><td> 350180 </td><td> 371472 </td><td> 0,0802 </td></tr><tr><td> 150 150 100 </td><td> 673032 </td><td> 706082 </td><td> 0,0545 </td></tr><tr><td> 175 175 125 </td><td> 1146778 </td><td> 1194044 </td><td> 0,0527 </td></tr><tr><td> 200 200 150 </td><td> 1796690 </td><td> 1860772 </td><td> 0,0439 </td></tr><tr><td> 250 250 200 </td><td> 3745038 </td><td> 3850202 </td><td> 0,0364 </td></tr><tr><td> 275 275 225 </td><td> 5097243 </td><td> 5226587 </td><td> 0,0301 </td></tr><tr><td> 300 300 250 </td><td> 6742588 </td><td> 6898729 </td><td> 0,0000 </td></tr></tbody></table></li><li> Utilizzando un solutore iterativo, le metriche elettrico in modelli ad elementi finiti sono stati calcolati per le configurazioni di elettrodi. </li></ol>

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La tecnologia comunicati in questo articolo, in particolare utilizzando un impianto ortopedico come catodo funzionale a rafforzare il legame scheletrica, ridurre la riabilitazione e prevenire l&#39;adesione batterica è un&#39;idea originale inventato dal primo autore nella presentazione del giornale. Una forma divulgazione invenzione è stata presentata alla University of Utah e di un brevetto provvisorio degli Stati Uniti è stata depositata proteggere tutte le tecnologie resi noti.

Comprendere il paradigma di stimolazione elettrica Miglioramenti nelle cure mediche e strategie di evacuazione sul campo di combattimento hanno portato a un aumento del numero di guerrieri sopravvissuti ferite di guerra disastrosa correlati. Mentre il tasso di miglioramento della sopravvivenza è un progresso medico, militari e le donne sono di ritorno da combattimento con amputazioni che necessitano di follow-up intensivo cura, riabilitazione estensiva e costosi servizi di protesi dal Veteran Affairs Health Care System 3. Congresso rapporti dettaglio che più di 1.000 legati alla guerra amputazioni si sono verificati a seguito della operazione Enduring Freedom (OEF) e Operazione Iraqi Freedom (OIF) conflitti 4. Nel caso di OEF OIF e veterani, circa il 15% dei guerrieri di ritorno hanno perso gli arti multiple e un numero significativo di militari di ritorno e le donne hanno brevi monconi dove la tecnologia presa non è una scelta o è stata rifiutata dal paziente. L&#39;uso riferito interrotto protesi di arto superiore supera anche il 50%, perché i dispositivi di fissaggio sono ingombranti e difficili da usare comodamente 5. Protesi agli arti inferiori sono altrettanto problematici e dei problemi comuni associati con gli zoccoli dei tessuti molli includere l&#39;impossibilità di camminare sulla sfida terrain6, limitata lunghezza del moncone 7, il disagio del paziente 5, preoccupazione non fisiologica di carico 8, irritazione da ossificazione eterotopica 9 e il rischio di malattie debilitanti 10. Tuttavia, la tecnologia osteointegrazione è una nuova tecnica chirurgica che può ridurre il dolore 11, irritazione cutanea 12, migliorare osseoperception 13, migliorare la mobilità 6, diminuire le piaghe da decubito associati con prese 6, ridurre il consumo energetico per la deambulazione 7,14 e servire meglio i veterani e guerrieri con limitate lunghezza dell&#39;arto residuo 15. Nonostante i numerosi vantaggi fisici e psicologici di osteointegrazione, procedure chirurgiche associate richiedono più avanzato dell&#39;infezione streategies trattamento di prevenzione 16, richiedono programmi di riabilitazione lunga e comprende restrittivi protocolli di sostenere il peso che può durare fino a 1,5 anni post-operatorio 17. Perché la vitalità dell&#39;osso ospite e la lunghezza del moncone è importante per l&#39;attaccamento e la funzionalità muscolare, lo sviluppo di nuovi dispositivi per migliorare l&#39;osteointegrazione è la chiave per la restituzione militari e le donne. Pertanto, lo sviluppo di un osteointegrati intelligente design dell&#39;impianto (OIID) sistema di controllo che utilizza la stimolazione elettrica può ridurre la lunghezza di riabilitazione e di rafforzare il legame scheletrico per veterani e amputati guerriero. Tuttavia, poiché nessun dispositivo attualmente è disponibile in commercio e diretto per l&#39;utilizzo con impianti osteointegrati percutanea, la motivazione del programma è quello di confermare la sicurezza e l&#39;efficacia con analisi agli elementi finiti. Comprendere il ruolo della stimolazione elettrica del rimodellamento osseo, in particolare la deposizione di osteoids e mineralizzazione, è rimasta speculativo. Tuttavia, l&#39;attività elettrica osservata nel osseo può essere il risultato di carico meccanico 18,19 e quindi uno stimolo elettrico può essere un meccanismo efficace per indurre la riparazione delle ossa 19. La logica dietro l&#39;ipotesi è spiegata in un modello di guarigione della frattura. Quando ossa lunghe sono caricati, la parte in tensione diventa elettropositivo ed il elettronegativo lato compressione 20,21, tuttavia, una volta un osso è rotto, il sito rimarrà elettronegativo rispetto all&#39;ambiente circostante fino a guarigione ha avuto inizio riprese e l&#39;omeostasi 21. Simulare la cascata naturale di guarigione con un segnale elettrico è stato creduto di assistere alla deposizione di calcio 22, leggere alterazioni del contenuto di ossigeno e pH 23, il reclutamento di fattori di crescita 22 e assiste alla migrazione degli osteoblasti e la secrezione di ulteriori matrice extracellulare 24. La premessa che la stimolazione elettrica può governare da sola riparazione completa dell&#39;osso è stato ridefinito e l&#39;ipotesi nuova corrente propone che i sindacati completi sono formati da sollecitazioni meccaniche e una stimolazione elettrica di co-stimolo 19. Gli impulsi elettrici osservate in vivo sono associate a deformazione piezoelettrico di collagene o il grande elettro-cinetica correnti prodotte dai costituenti ionici che scorre porzioni minerali passato della matrice ossea 25. In realtà, i potenziali spontanei sono stati riportati in osso grande come 6 millivolt e si correla con un aumento del tasso di apposizione minerale dell&#39;osso 26. Opera giovanile di Brighton e Friedenberg 18,21,27,28 utilizzato il concetto di stimolazione elettrica per la rigenerazione ossea negli anni 1960 e 1970 e Demonstrated che la corrente potrebbe essere usata per riparare non i sindacati in un periodo di tempo più breve rispetto ai metodi tradizionali di cura. Ulteriori modelli hanno indagato la formazione ossea con carico restrittive e hanno dimostrato un aumento del 31 per cento dell&#39;attività osteogenico tra controlli e degli arti stimolati elettricamente, 25. Mentre i ricercatori nel campo della stimolazione elettrica hanno spianato la strada per la comprensione del meccanismo di deposizione osteoblasti matrice con la stimolazione elettrica, la comprensione inadeguata ha limitato l&#39;espansione di questa tecnologia. Mentre ci sono molti casi di guarigione di successo della non-sindacati e modelli di guarigione della frattura, esempi di disagio del paziente e tentativi falliti sono pieni in letteratura come pure 29. Il problema si verifica con la stimolazione elettrica da scienziati e clinici controllare le metriche sbagliato elettrica e concentrarsi unicamente su grandezze corrente. Ricercatori precedenti hanno cercato di corrente come la &quot;pallottola magica&quot; per il fissaggio approssimativo 500.000 non-sindacati che si verificano ogni anno 30. Tuttavia, la ripetibilità tra i modelli è stata limitata da complicazioni riscaldamento joule 31 e non determinare densità di corrente 32. Infatti, tutti i dispositivi fabbricati biomediche deve essere limitata a una densità di corrente inferiore a 2 mA / cm 2 come indicato dalla Commissione elettrotecnica internazionale per prevenire necrosi localizzata del tessuto e il disagio del paziente 33. A parte assistere con fissazione scheletrica, controllato la stimolazione elettrica può anche impedire l&#39;adesione batterica su protesi ortopediche e ridurre il rischio di osteomielite e formazione di biofilm 34-37. Formazione di biofilm su dispositivi ortopedici portare a complicazioni del paziente e il disagio significativo per coloro che dipendono da questi dispositivi 38. L&#39;accento è posto sulla necessità di avere completamente sterilizzati strumentazione e gli impianti prima dell&#39;intervento 39, tuttavia è spesso difficile da diagnosticare l&#39;adesione dei batteri come è evidente da molti casi negativi in coltura che in effetti sono infettati 40. Questo problema è spesso unito al fatto che i biofilm sono a crescita lenta in natura 40, non può essere accuratamente crescita in vitro 39, dipendono dal tipo di cellule di batteri, la pulizia della superficie e il sistema immunitario della persona colpita 39. Indagine europea amputati transfemorali con la tecnologia oseeointegration rivelare il problema più frequente è l&#39;infezione (frequenti infezioni superficiali, 1 / 3 delle infezioni periprotesica) 41. Mentre ci sono stati grandi miglioramenti in vista chirurgico, l&#39;eliminazione dei batteri è uno dei fattori fondamentali per migliorare l&#39;osteointegrazione dal biofilm sono tra 500-5000 mille volte più difficile da sradicare a causa della loro non-platonico forma 34,35,39. Pertanto, utilizzando la stimolazione elettrica come una modalità per la rimozione di colonie batteriche dannose e aumentando la fissazione scheletrica sono fattori importanti per garantire la tutela della salute del paziente e l&#39;efficacia OIID. I vantaggi di utilizzare amputati e veterano guerriero sono che la relativa giovinezza e la salute in caso contrario buona di questi individui li rendono una popolazione ideale per la riabilitazione aggressiva e un post percutanea servirà come aiuto ambulatoriale e può essere sviluppato come catodo esposta per la stimolazione elettrica. La presenza di un impianto osteointegrati non richiede ulteriori interventi chirurgici per inserire componenti elettrici, permette al dispositivo di essere controllati dall&#39;esterno e previene ulteriore rischio di infezione 42. Dunque, a comprendere il metodo di iniezione di corrente nel moncone degli amputati veterano e guerriero, un campo elettrico sulla grandezza di 1-10 V / cm possono essere stabiliti, controllato e misurato a livello di interfaccia impianto. Si ipotizza che questo permetterà livelli di sicurezza di energia elettrica da consegnare, in grado di indurre la migrazione degli osteoblasti e migliorare l&#39;attaccamento scheletrico. Un campo elettrico di questo grado aumenterà la quantità e la qualità del tessuto osseo a livello di interfaccia degli impianti, e migliorare le prospettive per la riabilitazione accelerata e la fissazione scheletrica di un amputato. L&#39;uso della stimolazione elettrica non è stata valutata come una modalità per accelerare l&#39;osteointegrazione di un impianto protesico intramidollare e presenta numerose opportunità per la ricerca traslazionale per migliorare la cura del paziente. Risultati sperimentali La necessità di modelli specifici paziente con un dispositivo di stimolazione elettrica percutaneo è stato sostenuto nello studio. Le simulazioni sviluppate per il dispositivo proposto biomedico possono avere la capacità di accelerare l&#39;attaccamento scheletrico dalla migrazione degli osteoblasti aumentando e prevenire l&#39;adesione batterica 27,34,36,39. Compmodellazione utation ha effettivamente dimostrato che 1-10 V / cm campi elettrici e densità di corrente inferiore a 2 mA / cm 2 possono essere generati utilizzando l&#39;impianto come un catodo funzionale ed è più omogeneamente distribuito tramite due elettrodi esterni band. Il sistema OIID può essere il primo passo per risolvere il classico problema associato a stimolazione elettrica, l&#39;incapacità di definire percorsi di corrente nel corpo umano 43. Pertanto, stabilendo gli strumenti per migliorare l&#39;attaccamento scheletrico può aiutare con la riduzione della lunghezza della riabilitazione necessaria per una procedura di osteointegrati. Utilizzando la stimolazione elettrica per gli anziani amputati è anche un aspetto critico che deve essere esplorate pure. La massa ossea è massima dopo un decennio di crescita scheletrica cessa ma si riduce in modo significativo dal decennio ottavo e nono 44. Come ossa lunghe cambiare con l&#39;età, il diametro endosseo tende a crescere più rapidamente del diametro periostale che può portare a impiantare allentamento 45. Questo problema insieme alla riduzione della pressione sulle ossa muscoli più deboli possono contribuire a malattie debilitanti come l&#39;osteoporosi e osteopenia 45 e richiedono ulteriori opzioni di trattamento per i pazienti con impianti osteointegrati. Tuttavia, la stimolazione elettrica controllata e carico meccanico può fungere da catalizzatore sinergico di ongrowth osso e mantenere ossa integrità dell&#39;host letto con pazienti anziani con un sistema OIID.

bioelectric analyses of an osseointegrated intelligent implant design system for amputees

Il numero previsto di amputati americano è previsto in aumento a 3,6 milioni entro il 2050. Molti di questi individui dipendono arti artificiali per eseguire attività di routine, ma sospensioni protesici con tecnologia tradizionale presa può risultare ingombrante e scomoda per una persona con perdita di un arto. Inoltre, per quelli con alta amputazioni prossimali, limitata lunghezza del moncone può impedire l&#39;attaccamento exoprosthesis tutti insieme. Tecnologia degli impianti osteointegrati è una procedura operativa che permette romanzo attaccamento scheletrico ferma tra l&#39;osso ospite e un impianto. I risultati preliminari in amputati europeo con impianti osteointegrati hanno dimostrato risultati clinici migliori, consentendo il trasferimento diretto dei carichi al osso-impianto. Malgrado gli evidenti vantaggi di osteointegrazione rispetto alla tecnologia socket, le procedure di riabilitazione attuali richiedono lunghi periodi di portante restrittive prima che potrebbe essere ridotto con accelerato attaccamento scheletrico attraverso la stimolazione elettrica. L&#39;obiettivo del progetto degli impianti osteointegrati intelligente (OIID) del sistema è quello di rendere la parte dell&#39;impianto di un sistema elettrico per accelerare l&#39;attaccamento scheletrico e aiutare a prevenire l&#39;infezione periprotesica. Per determinare la dimensione ottimale degli elettrodi e il posizionamento, abbiamo iniziato una prova di concetto con la modellazione computazionale dei campi elettrico e densità di corrente che si presentano durante la stimolazione elettrica degli arti amputato residuo. Al fine di fornire assicurare la sicurezza dei pazienti, i soggetti con retrospettiva scansioni di tomografia computerizzata sono stati selezionati e tre ricostruzioni tridimensionali sono state create utilizzando programmi software personalizzati per garantire la precisione anatomica (Seg3D e SCIRun) in un IRB e HIPAA approvato lo studio. Questi pacchetti software sostenuto lo sviluppo di modelli specifici dei pazienti e ha consentito la manipolazione interattiva di posizione e le dimensioni degli elettrodi. I risultati preliminari indicano che i campi elettrici e densità di corrente può essere generato a livello di interfaccia impianto per ottenere la distribuzione omogenea campo elettrico necessaria per indurre la migrazione degli osteoblasti, migliorare la fissazione scheletrica e può aiutare a prevenire le infezioni periprotesica. Sulla base delle configurazioni degli elettrodi sperimentato nel modello, un esterno configurazione a due band sarà sostenuto in futuro.

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Bioelectric Analyses of an Osseointegrated Intelligent Implant Design System for Amputees

Vi è la necessità di sviluppare alternative attaccamento protesi a causa della perdita degli arti attribuiti a malattie vascolari occlusivi e traumi. L&#39;obiettivo del lavoro è quello di introdurre un osteointegrati intelligente sistema di progettazione degli impianti per aumentare la fissazione scheletrico e ridurre i tassi di infezione periprotesica per i pazienti che necessitano di tecnologia osteointegrati.

Analisi di un Sistema di bioelettrica Osteointegrata Intelligent Design impianto per amputati

The projected number of American amputees is expected to rise to 3.6 million by 2050.  Many of these individuals depend on artificial limbs to perform ...

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Research

JoVE Journal

Biology

13.8K Views.  Department of Veteran Affairs. Vi è la necessità di sviluppare alternative attaccamento protesi a causa della perdita degli arti attribuiti a malattie vascolari occlusivi e traumi. L'obiettivo del lavoro è quello di introdurre un osteointegrati intelligente sistema di progettazione degli impianti per aumentare la fissazione scheletrico e ridurre i tassi di infezione periprotesica per i pazienti che necessitano di tecnologia osteointegrati.

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Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is a highly aqueous extracellular matrix overlying the retina where intraocular as well as extraocular proteins accumulate during disease.1-3 Abnormal interactions between vitreous and retina underlie several diseases such as retinal detachment, proliferative diabetic retinopathy, uveitis, and proliferative vitreoretinopathy.1,4 The relative mouse vitreous volume is significantly smaller than the human vitreous (Figure 1), since the mouse lens occupies nearly 75% of its eye.5 This has made biochemical studies of mouse vitreous challenging. In this video article, we present a technique to dissect and isolate the mouse vitreous from the retina, which will allow use of transgenic mouse models to more clearly define the role of this extracellular matrix in the development of vitreoretinal diseases.

The dissection technique illustrates evisceration of the vitreous, retina, and lens from the mouse eye, separation by centrifugation, and characterization with protein assays.

Eviscerazione delle Vitreous Mouse e Retina per analisi proteomica

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is ...

Ricerca

Biologia

Trajectory Data Analyses for Pedestrian Space-time Activity Study

It is well recognized that human movement in the spatial and temporal dimensions has direct influence on disease transmission1-3. An infectious disease typically spreads via contact between infected and susceptible individuals in their overlapped activity spaces. Therefore, daily mobility-activity information can be used as an indicator to measure exposures to risk factors of infection. However, a major difficulty and thus the reason for paucity of studies of infectious disease transmission at the micro scale arise from the lack of detailed individual mobility data. Previously in transportation and tourism research detailed space-time activity data often relied on the time-space diary technique, which requires subjects to actively record their activities in time and space. This is highly demanding for the participants and collaboration from the participants greatly affects the quality of data4.
Modern technologies such as GPS and mobile communications have made possible the automatic collection of trajectory data. The data collected, however, is not ideal for modeling human space-time activities, limited by the accuracies of existing devices. There is also no readily available tool for efficient processing of the data for human behavior study. We present here a suite of methods and an integrated ArcGIS desktop-based visual interface for the pre-processing and spatiotemporal analyses of trajectory data. We provide examples of how such processing may be used to model human space-time activities, especially with error-rich pedestrian trajectory data, that could be useful in public health studies such as infectious disease transmission modeling.
The procedure presented includes pre-processing, trajectory segmentation, activity space characterization, density estimation and visualization, and a few other exploratory analysis methods. Pre-processing is the cleaning of noisy raw trajectory data. We introduce an interactive visual pre-processing interface as well as an automatic module. Trajectory segmentation5 involves the identification of indoor and outdoor parts from pre-processed space-time tracks. Again, both interactive visual segmentation and automatic segmentation are supported. Segmented space-time tracks are then analyzed to derive characteristics of one's activity space such as activity radius etc. Density estimation and visualization are used to examine large amount of trajectory data to model hot spots and interactions. We demonstrate both density surface mapping6 and density volume rendering7. We also include a couple of other exploratory data analyses (EDA) and visualizations tools, such as Google Earth animation support and connection analysis. The suite of analytical as well as visual methods presented in this paper may be applied to any trajectory data for space-time activity studies.

A suite of spatiotemporal processing methods are presented to analyze human trajectory data, such as that collected using a GPS device, for the purpose of modeling pedestrian space-time activities.

Le analisi per i dati di traiettoria pedonale Lo spazio-tempo di attività di studio

It is well recognized that human movement in the  spatial and temporal dimensions has direct influence on disease transmission1-3.  An infectious disease ...

Nanogold Labeling of the Yeast Endosomal System for Ultrastructural Analyses

Endosomes are one of the major membrane sorting checkpoints in eukaryotic cells and they regulate recycling or destruction of proteins mostly from the plasma membrane and the Golgi. As a result the endosomal system plays a central role in maintaining cell homeostasis, and mutations in genes belonging to this network of organelles interconnected by vesicular transport, cause severe pathologies including cancer and neurobiological disorders. It is therefore of prime relevance to understand the mechanisms underlying the biogenesis and organization of the endosomal system. The yeast Saccharomyces cerevisiae has been pivotal in this task. To specifically label and analyze at the ultrastructural level the endosomal system of this model organism, we present here a detailed protocol for the positively charged nanogold uptake by spheroplasts followed by the visualization of these particles through a silver enhancement reaction. This method is also a valuable tool for the morphological examination of mutants with defects in endosomal trafficking. Moreover, it is not only applicable for ultrastructural examinations but it can also be combined with immunogold labelings for protein localization investigations.

Yeast, Saccharomyces cerevisiae, has been a key model organism to identify and study genes regulating the biogenesis and functions of the endosomal system. Here we present a detailed protocol for the specific labeling of the endosomal compartments for ultrastructural studies.

Nanogold Etichettatura del Sistema lievito endosomiale per le analisi ultrastrutturali

Endosomes are one of the major membrane sorting checkpoints in eukaryotic cells and they regulate recycling or destruction of proteins mostly from the ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, most notably developmental arrest and reduced metabolism. Global gene expression profiling via RNA-Seq can provide important insights into the transcriptional mechanisms of photoperiodic diapause. The Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, is an outstanding organism for studying the transcriptional bases of diapause due to its ease of rearing, easily induced diapause, and the genomic resources available. This manuscript presents a general experimental workflow for identifying diapause-induced transcriptional differences in A. albopictus. Rearing techniques, conditions necessary to induce diapause and non-diapause development, methods to estimate percent diapause in a population, and RNA extraction and integrity assessment for mosquitoes are documented. A workflow to process RNA-Seq data from Illumina sequencers culminates in a list of differentially expressed genes. The representative results demonstrate that this protocol can be used to effectively identify genes differentially regulated at the transcriptional level in A. albopictus due to photoperiodic differences. With modest adjustments, this workflow can be readily adapted to study the transcriptional bases of diapause or other important life history traits in other mosquitoes.

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

RNA-Seq analyses are becoming increasingly important for identifying the molecular underpinnings of adaptive traits in non-model organisms. Here, a protocol to identify differentially expressed genes between diapause and non-diapause Aedes albopictus mosquitoes is described, from mosquito rearing, to RNA sequencing and bioinformatics analyses of RNA-Seq data.

Un Sperimentale e Bioinformatica Protocollo per analisi di RNA-Seq di photoperiodic diapausa nella zanzara tigre,<em&gt; Aedes albopictus</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the invasion of non-indigenous species. However, an exact identification of field predator-prey interactions is difficult in many cases. These analyses are often based on a visual evaluation of gut content or the analysis of stable isotope ratios (&#948;15N and &#948;13C). Such methods require comprehensive knowledge about, respectively, morphologic diversity or isotopic signature from individual prey organisms, leading to obstacles in the exact identification of prey organisms. Visual gut content analyses especially underestimate soft bodied prey organisms, because maceration, ingestion and digestion of prey organisms make identification of specific species difficult. Hence, polymerase chain reaction (PCR) based strategies, for example the use of group-specific primer sets, provide a powerful tool for the investigation of food web interactions. Here, we describe detailed protocols to investigate the gut contents of macroinvertebrate consumers from the field using group-specific primer sets for nuclear ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA). DNA can be extracted either from whole specimens (in the case of small taxa) or out of gut contents of specimens collected in the field. Presence and functional efficiency of the DNA templates need to be confirmed directly from the tested individual using universal primer sets targeting the respective subunit of DNA. We also demonstrate that consumed prey can be determined further down to species level via PCR with unmodified group-specific primers combined with subsequent single strand conformation polymorphism (SSCP) analyses using polyacrylamide gels. Furthermore, we show that the use of different fluorescent dyes as labels enables parallel screening for DNA fragments of different prey groups from multiple gut content samples via automated fragment analysis.

Most common gut content analyses of macroinvertebrates are visual. Requiring intense knowledge about morphological diversity of prey organisms, they miss soft bodied prey and, due to strong comminution of prey, are nearly impossible for some organisms, including amphipods. We provide detailed, novel genetic approaches for macroinvertebrate prey identification in the diet of amphipods.

Protocollo di laboratorio per analisi genetiche del contenuto dell'intestino del rDNA acquatica macroinvertebrati Using Group-specific Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the role of acidic extracellular pH in tumor aggressiveness and its underlying mechanism has not been extensively studied compared to hypoxic or nutrient starvation conditions. In addition, a well-defined culture method to mimic the acidic extracellular tumor microenvironment has not been fully reported.
Here we present a simple in vitro culture method to maintain acidic extracellular pH using reduced bicarbonate and increased lactate or HCl concentrations in the culture medium. The medium pH was sustained for at least 24 h and gradually decreased by 72 h following culture of PANC-1 and AsPC-1 pancreatic cancer cells. Three distinct acidic media conditions in this study highly upregulated pH-responsive genes such as MSMO1, INSIG1, and IDI1 compared to hypoxia or nutrient starvation. The upregulation of these genes can be used as a marker of acidic pH. These simple techniques are beneficial to elucidate underlying mechanisms of tumor malignancy under acidic tumor microenvironment. Therefore, our extracellular acidic pH culture system enables discovery of cellular acidic pH responses not only in cancer cells but also in primary cells, such as renal tubular cells, in relation to the other acidic disorders including, diabetic ketoacidosis, lactic acidosis, renal tubular acidosis, and respiratory acidosis.

The acidic tumor microenvironment plays critical roles in tumor progression. To assess the effects of acidic extracellular pH on cancer cells in vitro, we established simple acidic culture systems.

Istituzione di un pH extracellulare acido sistema cultura

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

The Sleeping Beauty (SB) transposon is a non-viral integrating system with proven efficacy for gene transfer and functional genomics. To optimize the SB transposon machinery, a transcriptionally regulated hyperactive transposase (SB100X) and T2-based transposon are employed. Typically, the transposase and transposon are provided transiently by plasmid transfection and SB100X expression is driven by a constitutive promoter. Here, we describe an efficient method to deliver the SB components to human cells that are resistant to several physical and chemical transfection methods, to control SB100X expression and stably integrate a gene of interest (GOI) through a &#34;cut and paste&#34; SB mechanism. The expression of hyperactive transposase is tightly controlled by the Tet-ON system, widely used to control gene expression since 1992. The gene of interest is flanked by inverted repeats (IR) of the T2 transposon. Both SB components are packaged in integration defective lentiviral vectors transiently produced in HEK293T cells. Human cells, either cell lines or primary cells from human tissue, are in vitro transiently transduced with viral vectors. Upon addition of doxycycline (dox, tetracycline analog) into the culture medium, a fine-tuning of transposase expression is measured and results in a long-lasting integration of the gene of interest in the genome of the treated cells. This method is efficient and applicable to the cell line (e.g., HeLa cells) and primary cells (e.g., human primary keratinocytes), and thus represents a valuable tool for genetic engineering and therapeutic gene transfer.

An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

This protocol describes a method to achieve stable integration of a gene of interest into the human genome by the transcriptionally regulated Sleeping Beauty system. Preparation of the integration of defective lentiviral vectors, the in vitro transduction of human cells, and the molecular assay on transduced cells are reported.

Un metodo efficiente In Vitro trasposizione da un sistema di bellezza dormire trascrizionalmente regolata confezionato in un vettore lentivirale difettoso di integrazione

The Sleeping Beauty (SB) transposon is a non-viral integrating system with proven efficacy for gene transfer and functional genomics. To optimize the SB ...

Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of these methods to non-model organisms. A series of protocols to optimize tissue collection from bats has been developed for a series of high-throughput sequencing approaches. Outlined here are protocols for the capture of bats, desired demographics to be collected for each bat, and optimized methods to minimize stress on a bat during tissue collection. Specifically outlined are methods for collecting and treating tissue to obtain (i) DNA for high molecular weight genomic analyses, (ii) RNA for tissue-specific transcriptomes, and (iii) proteins for proteomic-level analyses. Lastly, also outlined is a method to avoid lethal sampling by creating viable primary cell cultures from wing clips. A central motivation of these methods is to maximize the amount of potential molecular and morphological data for each bat and suggest optimal ways to preserve tissues so they retain their value as new methods develop in the future. This standardization has become particularly important as initiatives to sequence chromosome-level, error-free genomes of species across the world have emerged, in which multiple scientific parties are spearheading the sequencing of different taxonomic groups. The protocols outlined herein define the ideal tissue collection and tissue preservation methods for Bat1K, the consortium that is sequencing the genomes of every species of bat.

This is a protocol for the optimal tissue preparation for genomic, transcriptomic, and proteomic analyses of bats caught in the wild. It includes protocols for bat capture and dissection, tissue preservation, and cell culturing of bat tissue.

Raccolta di tessuti di pipistrelli per -Omics Analyses e Primary Cell Culture

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of ...

Tobacco Hornworm as an Insect Model System for Cannabinoid Pre-clinical Studies

With increased attention on cannabinoids in medicine, several mammalian model organisms have been used to elucidate their unknown pharmaceutical functions. However, many difficulties remain in mammalian research, which necessitates the development of non-mammalian model organisms for cannabinoid research. The authors suggest the tobacco hornworm Manduca sexta as a novel insect model system. This protocol provides information on preparing the artificial diet with varying amounts of cannabidiol (CBD), setting up a cultivation environment, and monitoring their physiological and behavioral changes in response to CBD treatment. Briefly, upon receiving hornworm eggs, the eggs were allowed 1-3 days at 25 &#176;C on a 12:12 light-dark cycle to hatch before being randomly distributed into control (wheat germ-based artificial diet; AD), vehicle (AD + 0.1% medium-chain triglyceride oil; MCT oil) and treatment groups (AD + 0.1% MCT + 1 mM or 2 mM of CBD). Once the media was prepared, 1st instar larvae were individually placed in a 50 mL test tube with a wooden skewer stick, and then the test tube was covered with a cheesecloth. Measurements were taken in 2-day intervals for physiological and behavioral responses to the CBD administration. This simple cultivation procedure allows researchers to test large specimens in a given experiment. Additionally, the relatively short life cycles enable researchers to study the impact of cannabinoid treatments over multiple generations of a homogenous population, allowing for data to support an experimental design in higher mammalian model organisms.

The present protocol provides instructional information for using tobacco hornworm Manduca sexta in cannabinoid research. The method described here includes all necessary supplies and protocols to monitor physiological and behavioral changes of the insect model in response to cannabidiol (CBD) treatment.

Hornworm del tabacco come sistema modello di insetto per studi pre-clinici sui cannabinoidi

With increased attention on cannabinoids in medicine, several mammalian model organisms have been used to elucidate their unknown pharmaceutical ...

Design and Implementation of a Rat Ex Vivo Lung Perfusion Model

Ex vivo lung preparations are a useful model that can be translated to many different fields of research, complementing corresponding in vivo and in vitro models. Laboratories wishing to use isolated lungs need to be aware of important steps and inherent challenges to establish a setup that is affordable, reliable, and that can be easily adapted to fit the topic of interest. This paper describes a DIY (do it yourself) model for ex vivo rat lung ventilation and perfusion to study drug and gas effects on pulmonary vascular tone, independent of changes in cardiac output. Creating this model includes a) the design and construction of the apparatus, and b) the lung isolation procedure. This model results in a setup that is more cost-effective than commercial alternatives and yet modular enough to adapt to changes in specific research questions. Various obstacles had to be resolved to ensure a consistent model that is capable of being used for a variety of different research topics. Once established, this model has proven to be highly adaptable to different questions and can easily be altered for different fields of study.

Design and Implementation of a Rat Ex Vivo Lung Perfusion Model

Ex vivo lungs are useful for a variety of experiments to collect physiological data while excluding the confounding variables of in vivo experiments. Commercial setups are often expensive and limited in the types of data they can collect. We describe a method for building a fully modular setup, adaptable for various study designs.

Progettazione e realizzazione di un modello di perfusione polmonare ex vivo di ratto

Ex vivo lung preparations are a useful model that can be translated to many different fields of research, complementing corresponding in vivo and in vitro ...