Gli autori desiderano ringraziare il Dott. Andre Walder e Nicolas Perrin per la produzione di protesi in titanio, K. Benmlih per l&#39;accumulo degli stampi in teflon e Dr. G. Prevost per il suo aiuto con la sperimentazione animale. Riconosciamo anche la Regione Alsazia e PMNA (Polo Materiaux et Nanoscienze d&#39;Alsace) per il contributo finanziario.

1. Preparazione di gradienti micropori in macroporose impianti metallici <ol><li> Pulire gli impianti (ad esempio impianti in grado perle di titanio medico con una gamma di dimensioni di 400-500 micron, Neyco SAS, Francia) con etanolo e poi ultrasuoni in acetone per 15 min. </li><li> Progettazione e produzione stampi in teflon a seconda delle dimensioni dell&#39;impianto e la forma (per esperimenti standard sono utilizzati stampi cilindrici di 1,5 cm di diametro, con una altezza di 2 cm). Stampi devono essere modulari, in modo che le alcune parti possono essere rimossi durante l&#39;estrazione. Tale disegno stampo assicura il controllo sul processo di estrazione forzando il movimento del liquido di estrazione in modo diretto. </li><li> Per impianti tubolare destinato a sostituire trachea, la struttura dovrebbe essere composto da tre parti: i) una parte inferiore per determinare le dimensioni dell&#39;impianto, ii) un mandrino e iii) un nucleo esterno che è rimovibile. In questo modo, il gradiente dimensione dei pori può essere formata dall&#39;esterno verso l&#39;interno. </li> &lt;li&gt; Preparare la soluzione di polimero sintetico (PLLA): Per la soluzione PLLA freeze / estrazione deve essere preparato in una miscela binaria di diossano e acqua (87:13%, v: v). </li><li> Scaldare la miscela a 60 ° C per ottenere una soluzione omogenea. 60 ° C scelto in quanto è il limite superiore della resistenza delle temperature per le siringhe di vetro di precisione che deve essere utilizzato per l&#39;introduzione della soluzione in impianti. </li><li> Se vengono usati ad alta concentrazione (≥ 6%), soluzioni di PLLA ad elevato peso molecolare, introdurre la soluzione nel implantare immediatamente dopo il riscaldamento. Altrimenti gelificazione della soluzione avviene senza immersione completa. </li><li> Calcolare il volume della soluzione di polimero necessaria rispetto alla porosità della protesi, per il cambiamento precisione nel volume della soluzione congelata può essere preso in considerazione. </li><li> Introdurre la soluzione in impianti con le siringhe di vetro di precisione con precisione di 0,1 microlitri. Il limite inferiore per la concentrazione del polimero è3% per la formazione di pendenze riproducibile pori mentre diventa difficile ottenere una distribuzione omogenea nei campioni di spessore superiore al 6%. Tuttavia, per applicazioni specifiche possono essere usate altre concentrazioni. </li><li> Congelare i campioni direttamente a -80 ° C o con un periodo di incubazione, prima di 30 min a temperatura ambiente. Condizioni di gelo determinano in parte la formazione di pori, quindi le condizioni di congelamento possono essere regolate a seconda della porosità mirato. Conservare i campioni durante la notte a -80 ° C. </li><li> Estrazione: Immergere gli impianti nel 80% EtOH pre-raffreddata. Eseguire l&#39;estrazione a -20 ° C per una notte. Per ottenere gradienti di porosità, rimuovere tutte le parti dello stampo, tranne il mandrino per gli impianti tubolari e di tutte le parti tranne la parte inferiore per gli impianti a forma di disco. Utilizzare un bisturi pre-raffreddata per facilitare la separazione dello stampo. </li><li> Dopo l&#39;estrazione a -20 ° C per una notte 19, rimuovere i restanti parti dello stampo e lasciare asciugare gli impianti. Per la caratterizzazione deila porosità complessiva della struttura mercurio analisi porosimetro è necessario. Mercurio misurazioni porosimetro mostravano picchi distinti che corrispondono ai pori sui due lati dell&#39;impianto e le interdispersed pori più piccoli. Tuttavia i dati più importanti è la differenza tra le porosità superfici intraluminale e extraluminale, che possono essere analizzati da J immagine per distribuzione dimensionale dei pori con un microscopio elettronico a scansione (SEM) 20. Per la verifica del gradiente dei pori, congelare-frattura dei campioni e osservare la sezione trasversale con SEM. </li><li> A causa della natura porosa aperta delle protesi utilizzate, e la capacità di riflettere la luce di titanio, è possibile fare z-pile di cellule marcate all&#39;interno dei impianti porosi. Etichettare le cellule con PKH26 o Calcein-AM e visualizzare gli impianti con microscopia laser confocale. </li></ol> 2. Rivestimento superficiale di porosi impianti metallici con collagene / alginato Multilayers <ol><li> Per accumulodi multistrati, più alta riproducibilità è ottenuto con i robot immersione. Tuttavia, se un robot immersione non è disponibile, queste fasi possono essere eseguite manualmente. </li><li> Utilizzare il grado di collagene tipo I medici e alginato di sodio. Le concentrazioni sono ottimizzati 0,5 g / L per ogni in 150 mM NaCl in tampone citrato a pH 3.8. </li><li> Sciogliere la soluzione di collagene durante la notte per assicurare l&#39;omogeneità della soluzione. PH acido di 3,8 è necessaria per stabile accumulo degli strati in quanto la struttura è instabile prima della reticolazione a pH neutro. </li><li> Depositare gli strati da un sistema di robot immersione immergendo gli impianti in soluzioni di collagene e alginato in alternativa. Tempo di deposizione è di 15 minuti per ogni strato successivo. Sciacquare la struttura tra fasi di deposizione con 150 mM di NaCl a pH 3,8 per 5 min. </li><li> Titolare specifico Design per l&#39;utilizzo degli impianti con robot immersione utilizzati nella produzione di multistrato di polielettrolita. Depositare gli strati sulla superficie sia titanio solo IMPLAnti o impianti modificati come descritto nella sezione 1. </li><li> Stabilizzazione della membrana basale mimare con genipin: Preparare la soluzione di reticolazione in dimetilsolfossido (DMSO) / tampone citrato (150 mM NaCl, pH 3,8) a 1:4 v: v rapporto. Una vasta gamma di concentrazioni possono essere usate e 100 mM è sufficiente per la reticolazione. Sciogliere genipin prima nella componente DMSO e aggiungere il componente acqua dopo per evitare grumi. </li><li> Reticolarlo i campioni dalla immersione nella soluzione di reticolazione tra 12-24 hr. Successivamente sciacquare abbondantemente con tampone citrato (pH 3,8). </li><li> Dopo le fasi di lavaggio, sterilizzare i campioni sia con il trattamento UV (30 min) o un bagno di antibiotico / antimicotico (penicillina / streptomicina, Fungizone). </li><li> I principali parametri che determinano la qualità della membrana basale mimica sono suo spessore e il diametro delle fibre. Calcolare i diametri delle fibre mediante microscopia a forza (AFM) immagini Atomic ottenuti nella modalità di contatto. Asciugare i campioni conflusso di azoto prima di imaging. Quantificare lo spessore di almeno 10 fibre per immagine per determinare lo spessore medio fibrilla con il software Image J. </li><li> Lo spessore dei film può essere determinata con test zero utilizzando AFM. Secco (COL / ALG) 24 film multistrato / COL. Utilizzare un ago di siringa a graffiare la pellicola. Dopo la localizzazione del graffio con un microscopio ottico, ottenere immagini AFM su 10 x 10 micron 2 superfici al confine del graffio. Calcolare le altezze dei profili ottenuti con il software AFM, che fornisce lo spessore dello strato di pellicola. </li></ol> 3. Monitoraggio indiretto di Implant Integrazione in vivo Analisi del plasma sanguigno <ol><li> Tutte le approvazioni delle commissioni necessarie devono essere prese per la sperimentazione animale in base alle regole che disciplinano per ogni paese 21. Nel nostro caso la Guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio (Consiglio Nazionale delle Ricerche, 2010) è seguito e THapprovazione e dell&#39;Università di comitato etico Strasburgo si ottiene. </li><li> Eseguire l&#39;impianto presso il sito di destinazione. Il protocollo di monitoraggio sangue dato qui è stato utilizzato per la sostituzione tracheale in conigli bianchi New Zealand di una resezione tracheale 15 mm. </li><li> Dopo l&#39;impianto di un giorno di follow-up è necessario, come ad esempio montioring il benessere degli animali (la guarigione intorno ai siti chirurgici, il tasso di respirazione) generale e la registrazione del loro peso. </li><li> Per convalidare l&#39;esame del sangue, utilizzare un metodo ben consolidato come il test ELISA per i livelli di CRP nel sangue. Test CRP per molti animali sono a disposizione ed il test specifico utilizzato per i conigli sono elencati nella Tabella 1. Allo stesso modo, l&#39;uso western blotting per la determinazione dei livelli di CGA. Anticorpi monoclonali anti-CGA (anti-CGA 47-68) sono stati utilizzati in questo protocollo. </li><li> Per la caratterizzazione di plasma, ottenere campioni di sangue dalla vena auricolare dei conigli. Centrifugare a 5000 rpm per 20 min a 4 °, C. Utilizzare il supernatante ottenuto per l&#39;analisi. Nella nostra procedura, questi test sono fatti su base settimanale, ma i test più frequenti sono inoltre possibili. </li><li> HPLC in fase inversa purificazione del contenuto proteico: Estrarre il plasma di coniglio con il 0,1% di acido trifluoroacetico (1:1, v: v). Purificare l&#39;estratto utilizzando un sistema di HPLC Dionex (ultima 3000; Sunnyvale, CA USA) su un NUCLEOSIL fase inversa 300-5C18-colonna (4 x 250 mm; particella 5 micron, porosità, 300 Å). </li><li> Registrare l&#39;assorbanza a 214 e 280 nm. Il sistema solvente usato è i) Solvente A: Acido 0,1% (v / v) trifluoroacetico (TFA) in acqua e ii) Solvente B: 0,09% (v / v) TFA in 70% (v / v) di acetonitrile-acqua. </li><li> Utilizzare un flusso di 700 ml / min utilizzando gradienti per eluizioni. Raccogliere le frazioni di punta. Concentrare le frazioni per evaporazione dalla applicazione della velocità a vuoto. È importante arrestare la velocità-vuoto prima completa secchezza. </li><li> Correlare i picchi ottenuti in diversi punti temporali nel coUrse del periodo di impianto. Utilizzare i peptidi purificati che mostrano andamenti coerenti durante il corso di impiantazione per l&#39;identificazione mediante sequenziamento automatico Edman. </li><li> Automatica Edman sequenziamento dei peptidi: Determinare la sequenza N-terminale dei peptidi purificati mediante degradazione di Edman automatico utilizzando un microsequencer Procise. Caricare il campione di filtri in fibra di vetro polibrene-trattati. Passo successivo è l&#39;identificazione di acidi Phenylthiohydantoin-aminoacidi (PTH-Xaa) mediante cromatografia su una colonna C 18 (PTH C-18, 2.1 x 200 mm) 22. Dopo la sequenza è ottenuta, può essere identificato da software Blast utilizzando il database Swiss-Prot. </li></ol>

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	<li>Hollister, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porous+scaffold+design+for+tissue+engineering.">Porous scaffold design for tissue engineering.</a> Nat. Mater. 4, 518-524 (2005).</li><li>Ryan, G., Pandit, A., Apatsidis, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+methods+of+porous+metals+for+use+in+orthopaedic+applications.">Fabrication methods of porous metals for use in orthopaedic applications.</a> Biomaterials. 27, 2651-2670 (2006).</li><li>Schultz, P., Vautier, D., Charpiot, A., Lavalle, P., Debry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+tracheal+prostheses+made+of+porous+titanium:+a+study+on+sheep.">Development of tracheal prostheses made of porous titanium: a study on sheep.</a> European Archives of Oto-Rhino-Laryngology. 264, 433-438 (2007).</li><li>Janssen, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laryngotracheal+reconstruction+with+porous+titanium+in+rabbits:+are+vascular+carriers+and+mucosal+grafts+really+necessary.">Laryngotracheal reconstruction with porous titanium in rabbits: are vascular carriers and mucosal grafts really necessary.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 4, 395-403 (2010).</li><li>Li, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+ingrowth+in+porous+titanium+implants+produced+by+3D+fiber+deposition.">Bone ingrowth in porous titanium implants produced by 3D fiber deposition.</a> Biomaterials. 28, 2810-2820 (2007).</li><li>Schultz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyelectrolyte+multilayers+functionalized+by+a+synthetic+analogue+of+an+anti-inflammatory+peptide,+alpha-MSH,+for+coating+a+tracheal+prosthesis.">Polyelectrolyte multilayers functionalized by a synthetic analogue of an anti-inflammatory peptide, alpha-MSH, for coating a tracheal prosthesis.</a> Biomaterials. 26, 2621-2630 (2005).</li><li>M&#252;ller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-Functionalized+Polyelectrolyte+Multilayers+as+Proangiogenic+Prosthetic+Coatings.">VEGF-Functionalized Polyelectrolyte Multilayers as Proangiogenic Prosthetic Coatings.</a> Advanced Functional Materials. 18, 1767-1775 (2008).</li><li>Mills, R. J., Frith, J. E., Hudson, J. E., Cooper-White, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Geometric+Challenges+on+Cell+Migration.">Effect of Geometric Challenges on Cell Migration.</a> Tissue Engineering Part C-Methods. 17, 999-1010 (2011).</li><li>O'Brien, F. J., Harley, B. A., Yannas, I. V., Gibson, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+pore+size+on+cell+adhesion+in+collagen-GAG+scaffolds.">The effect of pore size on cell adhesion in collagen-GAG scaffolds.</a> Biomaterials. 26, 433-441 (2005).</li><li>Karageorgiou, V., Kaplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porosity+of+3D+biomaterial+scaffolds+and+osteogenesis.">Porosity of 3D biomaterial scaffolds and osteogenesis.</a> Biomaterials. 26, 5474-5491 (2005).</li><li>Budyanto, L., Goh, Y. Q., Ooi, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+porous+poly(L-lactide)+(PLLA)+scaffolds+for+tissue+engineering+using+liquid+-+liquid+phase+separation+and+freeze+extraction.">Fabrication of porous poly(L-lactide) (PLLA) scaffolds for tissue engineering using liquid - liquid phase separation and freeze extraction.</a> J. Mater. Sci. Mater. Med. 20, 105-111 (2009).</li><li>Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+gut-on-a-chip+inhabited+by+microbial+flora+that+experiences+intestinal+peristalsis-like+motions+and+flow.">Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow.</a> Lab Chip. 12, 2165-2174 (2012).</li><li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+Organ-Level+Lung+Functions+on+a+Chip.">Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip.</a> Science. 328, 1662-1668 (2010).</li><li>Chaubaroux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen-Based+Fibrillar+Multilayer+Films+Cross-Linked+by+a+Natural+Agent.">Collagen-Based Fibrillar Multilayer Films Cross-Linked by a Natural Agent.</a> Biomacromolecules. 13, 2128-2135 (2012).</li><li>Huang, Y., Siewe, M., Madihally, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+spatial+architecture+on+cellular+colonization.">Effect of spatial architecture on cellular colonization.</a> Biotechnology and Bioengineering. 93, 64-75 (2006).</li><li>Kirkpatrick, C. J., Fuchs, S., Unger, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-culture+systems+for+vascularization+-+Learning+from+nature.">Co-culture systems for vascularization - Learning from nature.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63, 291-299 (2011).</li><li>Lavalle, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Aspects+of+Films+Prepared+by+a+Sequential+Deposition+of+Species:+Perspectives+for+Smart+and+Responsive+Materials.">Dynamic Aspects of Films Prepared by a Sequential Deposition of Species: Perspectives for Smart and Responsive Materials.</a> Advanced Materials. 23, 1191-1221 (2011).</li><li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+concentration+of+chromogranin+A+at+admission:+An+early+biomarker+of+severity+in+critically+ill+patients.">Serum concentration of chromogranin A at admission: An early biomarker of severity in critically ill patients.</a> Annals of Medicine. 41, 38-44 (2009).</li><li>Goh, Y., Ooi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+and+characterization+of+porous+poly(l+-lactide)+scaffolds+using+solid+-+liquid+phase+separation.">Fabrication and characterization of porous poly(l -lactide) scaffolds using solid - liquid phase separation.</a> Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 19, 2445-2452 (2008).</li><li>Vrana, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+macroporous+titanium+tracheal+implants+with+biodegradable+structures:+Tracking+in+vivo+integration+for+determination+of+optimal+in+situ+epithelialization+conditions.">Modification of macroporous titanium tracheal implants with biodegradable structures: Tracking in vivo integration for determination of optimal in situ epithelialization conditions.</a> Biotechnology and Bioengineering. 109, 2134-2146 (2012).</li><li>Dupret-Bories, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+surgical+protocol+for+implantation+of+tracheal+prostheses+in+sheep.">Development of surgical protocol for implantation of tracheal prostheses in sheep.</a> J. Rehabil. Res. Dev. 48, 851-864 (2011).</li><li>Gasnier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+location+of+post-translational+modifications+on+chromogranin+B+from+bovine+adrenal+medullary+chromaffin+granules.">Characterization and location of post-translational modifications on chromogranin B from bovine adrenal medullary chromaffin granules.</a> Proteomics. 4, 1789-1801 (2004).</li><li>Vrana, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+Titanium/Biodegradable+Polymer+Implants+with+an+Hierarchical+Pore+Structure+as+a+Means+to+Control+Selective+Cell+Movement.">Hybrid Titanium/Biodegradable Polymer Implants with an Hierarchical Pore Structure as a Means to Control Selective Cell Movement.</a> PLoS ONE. 6, e20480 (2011).</li><li>Nakatsu, M. N., Davis, J., Hughes, C. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+Fibrin+Gel+Bead+Assay+for+the+Study+of+Angiogenesis.">Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis.</a> J. Vis. Exp. (3), e186 (2007).</li><li>Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Human+Umbilical+Vein+Endothelial+Cells+and+Their+Use+in+the+Study+of+Neutrophil+Transmigration+Under+Flow+Conditions.">Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions.</a> J. Vis. Exp. (66), e4032 (2012).</li><li>Dong, C. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photomediated+crosslinking+of+C6-cinnamate+derivatized+type+I+collagen.">Photomediated crosslinking of C6-cinnamate derivatized type I collagen.</a> Biomaterials. 26, 4041-4049 (2005).</li></ol>

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Gradienti pori sono strumenti importanti in ingegneria tissutale di interfaccia e il sistema qui descritto possono essere usati da soli o in combinazione con impianti metallici a formare pori gradiente di studiare la migrazione cellulare. Il sistema non richiede alcuna impostazione supplementare o attrezzatura supplementare tranne sotto cappa per gestire solventi organici, così può essere applicato in laboratori di biologia. Polimeri simili come poli (acido glicolico) (PGA), poli (lattico-co-glicolico) acido (PLGA) e ...

Attualmente sono disponibili impianti metallici sono adatti per applicazioni portanti, ma la loro non degradabilità richiede disegni che garantiscono una forte interfaccia con il tessuto circostante li 1. Prevedendo strutture che facilitano la crescita cellulare in-e la colonizzazione in vivo, la vita di impianti metallici può essere prolungato 2. Apertamente porosi impianti metallici sono materiali per l&#39;ingegneria dei tessuti interfaccia promettenti e anche per garantire una buona colonizzazione degli impianti. Essi sono stati utilizzati attivamente, come impianti ortopedici e anche come protesi tracheali 3-5. Tuttavia, vi sono ancora problemi che devono essere risolti come il controllo preciso movimento delle cellule nelle zone dei pori. Incapacità di controllare questo processo potrebbe portare alla colonizzazione incompleta in una estremità e restenosi nell&#39;altra. Inoltre un&#39;ulteriore funzionalizzazione di questi impianti è necessario per raggiungere funzioni superiori come, consegna di fattori di crescita,vascolarizzazione diretto e movimento simultaneo di diversi tipi di cellule 6-8. Per impianti tracheali, questo è cruciale come la colonizzazione dell&#39;impianto da un tessuto vascolarizzato è auspicabile. Tuttavia, il tessuto incontrollata crescita interna al lume della trachea è indesiderabile perché diminuisce implantare pervietà. Una possibilità di controllare il movimento delle cellule è la dimensione di esclusione. Conoscendo la dimensione delle cellule bersaglio e la loro capacità di interagire con un dato polimero sintetico è possibile sviluppare gradienti di pori che possono determinare efficacemente la profondità di movimento cellulare. Ad esempio creando un&#39;architettura poro che è abbastanza grande per l&#39;ingresso di cellule del tessuto connettivo, quali fibroblasti extraluminally, ma abbastanza piccoli (meno di 10 micron) per impedire il loro movimento intraluminale un efficace controllo colonizzazione di una protesi tubolare può essere raggiunto. Dal metodi di creazione dei pori disponibili come freeze-essiccazione ding, la lisciviazione di particelle, gas schiumogeno 9,10, il più facile da adattare il metodo per la rapida formazione di gradienti pori con quantità minima di attrezzature necessarie è freeze-estrazione 11. In questo metodo, una soluzione polimerica è congelato in una miscela binaria di un solvente organico ed acqua. Successivamente, il solvente viene scambiato tramite estrazione con un liquido miscibile pre-raffreddata come etanolo. Congelamento e condizioni di estrazione determinano la forma e la dimensione dei pori e se l&#39;estrazione avviene in un modo in cui può essere controllato il movimento della soluzione di estrazione, forma e dimensione dei pori può essere modulata direzionalmente. Secondo passo per tessuti multicellulari è la formazione di barriere porose tra diversi tipi cellulari per controllare il loro interazione. Ciò è necessario anche per la disponibilità di diversi microambienti per diversi tipi di cellule a seconda delle loro esigenze 12,13. Trachea è un organo tubolare che collega laringe con BRONCHi. Ha un rivestimento interno pseudostratificato epitelio ciliare con interdispersed cellule caliciformi che producono muco. La struttura 3D della trachea e la stabilità è mantenuta da cartilagine a forma di C-ring. Così, in una trachea artificiale ci dovrebbe essere una giunzione definita tra il tessuto connettivo e lo strato epiteliale ciliare. Mentre una struttura 3D è necessario del tessuto connettivo, la migrazione delle cellule epiteliali richiede una membrana-come seminterrato superficie per ottenere movimento direzionale e la chiusura della ferita. Polielettrolita film multistrato (PEM) sono una possibile opzione per ottenere seminterrato imita membrana. Metodo layer-by-layer (LBL) è un processo versatile per ottenere rivestimenti superficiali sottili e funzionale. Essa si basa su interazioni elettrostatiche di due polielettroliti di carica opposta e il loro accumulo nei maniera sequenziale per ottenere rivestimenti di superficie su scala nanometrica le cui proprietà può essere variato cambiando semplicemente variabili come specie polielettrolita, pH,numero strati, aggiunta di uno strato di tappatura, reticolazione ecc Uno dei principali vantaggi del metodo LBL è la sua capacità di conformarsi alla topografia del substrato sottostante. Così, in condizioni controllate questo metodo può essere utilizzato anche per ottenere la copertura superficiale di strutture porose. Se collagene viene utilizzato come uno dei polielettroliti è possibile ottenere strutture nanofibrillar che possono mimare la superficie della membrana basale. L&#39;idrofobicità del titanio consente lo sviluppo di tali strutture e fibrillarity può essere conservato in strati spessi 14. Questo modo attaccamento e movimento di cellula sulla superficie può anche essere controllato. Utilizzando freeze-estrazione e pellicole di rivestimento Lbl sequenzialmente, una struttura in cui il movimento delle cellule può essere controllato lateralmente e longitudinalmente circonferenzialmente può essere ottenuto 15. Qui si descrive due metodi di modifica per i nuovi impianti in titanio, utilizzando il loro comportamento idrofobico che può essereesteso a modifica di vari impianti porosi: i) formazione di gradienti di micropori entro i macroporosi con impianti di titanio idrofobe, polimeri sintetici ii) formazione di uno spesso strato di film polimerico sulla superficie dell&#39;impianto che supporta la crescita cellulare e la formazione di rivestimento multistrati polielettrolita. Questi metodi possono essere usati in sequenza o separatamente. Essi forniscono strutture che garantiscono la migrazione controllata e organizzazione spaziale dei diversi tipi di cellule nei tessuti multicellulari 16,17. Per il caso specifico della trachea, il risultato desiderato per l&#39;impianto sarebbe la colonizzazione da tessuto fibrovascolare entro i gradienti micropori senza restenosi e la formazione del rivestimento interno di cellule epiteliali ciliate sui multistrati polielettrolita. Un modo per controllare l&#39;integrazione della protesi è di fare piccoli interventi chirurgici nel periodo della loro integrazione con l&#39;host in situ. Al fine di essere in grado tØ decidere la tempistica degli interventi, è importante disporre di informazioni sugli effetti sistemici della protesi. Proteina C-reattiva (CRP) è stato utilizzato per il monitoraggio di infezione e risposta infiammatoria in ambito clinico. Cromogranina A (CGA) può anche essere usato in modo simile e potrebbe fornire risultati più accurati per osservare il livello di infiammazione 18. Come un possibile modo di osservare l&#39;integrazione impianto metallico in vivo, vi presentiamo una procedura di monitoraggio continuo di effetti sistemici degli impianti da parte caratterizzazione di campioni di sangue di animali con cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC) e il successivo sequenziamento di proteine. Elaborazione di questo metodo può essere utilizzato per eludere analisi istologica end-point regolare. Taglio istologica di impianti metallici è un processo lungo, complicato e costoso e può essere effettuata solo in momenti specifici. Per questo motivo, ben progettato analisi del sangue forniscono informazioni circa la salute robusta impianto sarebbeessere possibili vie per diminuire la sperimentazione animale come richiesto dalle recenti norme UE in materia di sperimentazione animale. I metodi qui presentati possono essere usati per migliorare le prestazioni di impianti metallici mediante funzionalizzazione o di avere un modo alternativo di monitoraggio degli impianti esistenti.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dioxane</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>360481</td>
 <td>Toxic material, Strictly under chemical hood</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PLLA 
 i. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~0.5 dl/g 
 ii. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~2.0 dl/g 
 </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>94829, 81273</td>
 <td>The choice of molecular weight and inherent viscosity is application dependent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PRONOVA UP LVG (Sodium Alginate)</td>
 <td>Novamatrix</td>
 <td>4200006</td>
 <td>Low viscosity(20-200 mPa.s)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagen type I (Bovine)</td>
 <td>Symatese</td>
 <td>CBPE2US100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pen/Strep, Fungizone </td>
 <td>Promocell</td>
 <td>C42020</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Genipin</td>
 <td>Wako</td>
 <td>0703021</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silicon nitride probes with aspring constant of 0.03 N.m-1. </td>
 <td>Bruker </td>
 <td>MSCT </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trifluoroacetic acid for HPLC ,&ge;99.0% </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>302031</td>
 <td>Hazardous Material, Please follow MSDS carefully</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetonitrile, for HPLC ,&ge;99.9% </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>34998</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Calcein-AM</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>C3100MP </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>PKH26GL</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rabbit C-Reactive Protein (CRP) ELISA kit</td>
 <td>Genway Bio</td>
 <td>GWB-9BF960 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMSO, Bioreagent, &ge;99.7% </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D2650</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Multimode Nanoscope IV Atomic Force microscope</td>
 <td>Bruker</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Procise microsequencer </td>
 <td>Applied Biosystems </td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ultima 3000 HPLC system </td>
 <td>Dionex</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Scanning Electron Microscope Hitachi TM 100</td>
 <td>Hitachi </td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Confocal Scanning Laser Microscope Zeiss LSM 510 </td>
 <td>Zeiss </td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
Table 1. List of Materials and Reagents.

multi-scale modification of metallic implants with pore gradients, polyelectrolytes and their indirect monitoring in vivo

Impianti metallici, in particolare impianti di titanio, sono ampiamente utilizzati in applicazioni cliniche. Tessuto in crescita e l&#39;integrazione di questi impianti nei tessuti sono parametri importanti per i risultati clinici di successo. Al fine di migliorare l&#39;integrazione del tessuto, sono state sviluppate impianti metallici porosi. Porosità aperta di schiume metalliche è molto vantaggiosa, in quanto le aree del poro possono essere funzionalizzata senza compromettere le proprietà meccaniche di tutta la struttura. Qui si descrivono le modifiche che utilizzano impianti in titanio poroso a base di microsfere in titanio. Utilizzando le proprietà fisiche intrinseche quali idrofobicità di titanio, è possibile avere gradienti pori idrofobi entro microperla impianti metallici based e allo stesso tempo di avere una membrana basale mimo basa su idrofili, polimeri naturali. Gradienti poro 3D sono formate da polimeri sintetici come acido poli-L-lattico (PLLA) mediante metodo freeze-estrazione. 2D nanofibrillar surfacce sono formati utilizzando collagene / alginato seguita da una fase di reticolazione con un reticolante naturale (genipin). Questo film nanofibrillar è stato costruito da strati con il metodo di deposizione delle due molecole di carica opposta, collagene e alginato strato (LBL). Infine, un impianto dove diverse aree possono ospitare diversi tipi di cellule, in quanto ciò sia necessario per molti tessuti multicellulari, può essere ottenuto. Da, in questo modo il movimento cellulare in direzioni diverse da diversi tipi di cellule può essere controllato. Tale sistema è descritto per il caso specifico di trachea rigenerazione, ma può essere modificata per altri organi bersaglio. Analisi della migrazione cellulare e le possibili metodi per la creazione di diversi gradienti pori vengono elaborati. Il passo successivo nella analisi di tali impianti è la loro caratterizzazione dopo l&#39;impianto. Tuttavia, l&#39;analisi istologica di impianti metallici è un processo lungo e ingombrante, quindi per il monitoraggio reazione host per impianti metallici in vivo di unlternative metodo basato sul monitoraggio proteine ​​del sangue CGA e diverso è anche descritto. Questi metodi possono essere utilizzati per lo sviluppo in vitro la migrazione su misura e test di colonizzazione e di essere utilizzato anche per l&#39;analisi di funzionalizzati impianti metallici in vivo senza istologia.

Formazione di gradienti pori Modificando la concentrazione della soluzione PLLA, è possibile controllare la dimensione dei pori sul lato extraluminale degli impianti. Dimensioni e la forma dei pori è stata significativamente influenzata dalla presenza di impianti in titanio (figure 1a e 1b). Dimensioni dei pori variava 40-100 micron e l&#39;utilizzo di concentrazioni più basse hanno provocato pori più piccoli. Considerando che, nella dimensione dei pori end...

Watch this Scientific Journal Video about Multi-Scale Modification of Metallic Implants With Pore Gradients, Polyelectrolytes and Their Indirect Monitoring In vivo at JoVE.com

Multi-Scale Modification of Metallic Implants With Pore Gradients, Polyelectrolytes and Their Indirect Monitoring In vivo

In questo video, dimostreremo tecniche di modificazione per porosi impianti metallici per migliorare la loro funzionalità e per controllare la migrazione delle cellule. Le tecniche includono lo sviluppo di gradienti pori per controllare il movimento delle cellule in 3D e produzione di membrana basale imita per controllare il movimento delle cellule in 2-D. Inoltre un metodo HPLC-based per il monitoraggio integrazione dell&#39;impianto in vivo mediante analisi delle proteine ​​del sangue è descritto.

Modifica multi-scala di impianti metallici con gradienti poro, polielettroliti e il loro monitoraggio indiretto<em&gt; In vivo</em

Metallic implants, especially titanium implants, are widely used in  clinical applications. Tissue in-growth and integration to these implants in  the ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Multi-Scale Modification of Metallic Implants With Pore Gradients, Polyelectrolytes and Their Indirect Monitoring In vivo

10.8K Views.  INSERM. In questo video, dimostreremo tecniche di modificazione per porosi impianti metallici per migliorare la loro funzionalità e per controllare la migrazione delle cellule. Le tecniche includono lo sviluppo di gradienti pori per controllare il movimento delle cellule in 3D e produzione di membrana basale imita per controllare il movimento delle cellule in 2-D. Inoltre un metodo HPLC-based per il monitoraggio integrazione dell'impianto in vivo mediante analisi delle prote...

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Monitoring Protein Adsorption with Solid-state Nanopores

Solid-state nanopores have been used to perform measurements at the single-molecule level to examine the local structure and flexibility of nucleic acids 1-6, the unfolding of proteins 7, and binding affinity of different ligands 8. By coupling these nanopores to the resistive-pulse technique 9-12, such measurements can be done under a wide variety of conditions and without the need for labeling 3. In the resistive-pulse technique, an ionic salt solution is introduced on both sides of the nanopore. Therefore, ions are driven from one side of the chamber to the other by an applied transmembrane potential, resulting in a steady current. The partitioning of an analyte into the nanopore causes a well-defined deflection in this current, which can be analyzed to extract single-molecule information. Using this technique, the adsorption of single proteins to the nanopore walls can be monitored under a wide range of conditions 13. Protein adsorption is growing in importance, because as microfluidic devices shrink in size, the interaction of these systems with single proteins becomes a concern. This protocol describes a rapid assay for protein binding to nitride films, which can readily be extended to other thin films amenable to nanopore drilling, or to functionalized nitride surfaces. A variety of proteins may be explored under a wide range of solutions and denaturing conditions. Additionally, this protocol may be used to explore more basic problems using nanopore spectroscopy.

A method of using solid-state nanopores to monitor the non-specific adsorption of proteins onto an inorganic surface is described. The method employs the resistive-pulse principle, allowing for the adsorption to be probed in real-time and at the single-molecule level. Because the process of single protein adsorption is far from equilibrium, we propose the employment of parallel arrays of synthetic nanopores, enabling for the quantitative determination of the apparent first-order reaction rate constant of protein adsorption as well as and the Langmuir adsorption constant.

Monitoraggio delle proteine ​​con a stato solido Nanopori

Solid-state nanopores have been used to perform measurements at the single-molecule level to examine the local structure and flexibility of nucleic acids ...

Ricerca

Bioingegneria

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the issue of spectral overlap of fluorophore emissions has limited the number of simultaneous probes. In contrast, the new CyTOF mass cytometer by DVS Sciences couples a liquid single-cell introduction system to an ICP-MS.1 Rather than fluorophores, chelating polymers containing highly-enriched metal isotopes are coupled to antibodies or other specific probes.2-5 Because of the metal purity and mass resolution of the mass cytometer, there is no "spectral overlap" from neighboring isotopes, and therefore no need for compensation matrices. Additionally, due to the use of lanthanide metals, there is no biological background and therefore no equivalent of autofluorescence. With a mass window spanning atomic mass 103-203, theoretically up to 100 labels could be distinguished simultaneously. Currently, more than 35 channels are available using the chelating reagents available from DVS Sciences, allowing unprecedented dissection of the immunological profile of samples.6-7
Disadvantages to mass cytometry include the strict requirement for a separate metal isotope per probe (no equivalent of forward or side scatter), and the fact that it is a destructive technique (no possibility of sorting recovery). The current configuration of the mass cytometer also has a cell transmission rate of only ~25%, thus requiring a higher input number of cells.
Optimal daily performance of the mass cytometer requires several steps. The basic goal of the optimization is to maximize the measured signal intensity of the desired metal isotopes (M) while minimizing the formation of oxides (M+16) that will decrease the M signal intensity and interfere with any desired signal at M+16. The first step is to warm up the machine so a hot, stable ICP plasma has been established. Second, the settings for current and make-up gas flow rate must be optimized on a daily basis. During sample collection, the maximum cell event rate is limited by detector efficiency and processing speed to 1000 cells/sec. However, depending on the sample quality, a slower cell event rate (300-500 cells/sec) is usually desirable to allow better resolution between cells events and thus maximize intact singlets over doublets and debris. Finally, adequate cleaning of the machine at the end of the day helps minimize background signal due to free metal.

The steps necessary for daily tuning and optimization of the performance of a CyTOF mass cytometer are described. Comments on optimal sample preparation and flow rate are discussed

Massa Citometria: Protocollo per l&#39;ottimizzazione giornaliera e campioni di cellule in esecuzione su un citometro Messa CyTOF

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Graphene Coatings for Biomedical Implants

Atomically smooth graphene as a surface coating has potential to improve implant properties. This demonstrates a method for coating nitinol alloys with nanometer thick layers of graphene for applications as a stent material. Graphene was grown on copper substrates via chemical vapor deposition and then transferred onto nitinol substrates. In order to understand how the graphene coating could change biological response, cell viability of rat aortic endothelial cells and rat aortic smooth muscle cells was investigated. Moreover, the effect of graphene-coatings on cell adhesion and morphology was examined with fluorescent confocal microscopy. Cells were stained for actin and nuclei, and there were noticeable differences between pristine nitinol samples compared to graphene-coated samples. Total actin expression from rat aortic smooth muscle cells was found using western blot. Protein adsorption characteristics, an indicator for potential thrombogenicity, were determined for serum albumin and fibrinogen with gel electrophoresis. Moreover, the transfer of charge from fibrinogen to substrate was deduced using Raman spectroscopy. It was found that graphene coating on nitinol substrates met the functional requirements for a stent material and improved the biological response compared to uncoated nitinol. Thus, graphene-coated nitinol is a viable candidate for a stent material.

Graphene offers potential as a coating material for biomedical implants. In this study we demonstrate a method for coating nitinol alloys with nanometer thick layers of graphene and determine how graphene may influence implant response.

Rivestimenti grafene per impianti biomedici

Atomically smooth graphene as a surface coating has potential to improve implant properties. This demonstrates a method for coating nitinol alloys with ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

Creazione di sfumature adesivi e solubile per la migrazione di imaging cellulare con microscopia a fluorescenza

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large animal model. A step by-step protocol for inter-positional placement of the TEV and real-time digital assessment of the TEV and native carotid arteries is described here. In vivo monitoring is made possible by the implantation of flow probes, catheters and ultrasonic crystals (capable of recording dynamic diameter changes of implanted TEVs and native carotid arteries) at the time of surgery. Once implanted, researchers can calculate arterial blood flow patterns, invasive blood pressure and artery diameter yielding parameters such as pulse wave velocity, augmentation index, pulse pressures and compliance. Data acquisition is accomplished using a single computer program for analysis throughout the duration of the experiment. Such invaluable data provides insight into TEV matrix remodeling, its resemblance to native/sham controls and overall TEV performance in vivo.

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

A step-by-step protocol for the inter-positional placement of Tissue Engineered Vessels (TEVs) into the carotid artery of a sheep using end-to-end anastomosis and real-time digital assessment in vivo until animal sacrifice.

Tecnica chirurgica per l&#39;impianto di ingegneria tessutale vascolari Innesti e successive<em&gt; In Vivo</em&gt; Monitoraggio

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large ...

Generation of Scalable, Metallic High-Aspect Ratio Nanocomposites in a Biological Liquid Medium

The goal of this protocol is to describe the synthesis of two novel biocomposites with high-aspect ratio structures. The biocomposites consist of copper and cystine, with either copper nanoparticles (CNPs) or copper sulfate contributing the metallic component. Synthesis is carried out in liquid under biological conditions (37 &#176;C) and the self-assembled composites form after 24 hr. Once formed, these composites are highly stable in both liquid media and in a dried form. The composites scale from the nano- to micro- range in length, and from a few microns to 25 nm in diameter. Field emission scanning electron microscopy with energy dispersive X-ray spectroscopy (EDX) demonstrated that sulfur was present in the NP-derived linear structures, while it was absent from the starting CNP material, thus confirming cystine as the source of sulfur in the final nanocomposites. During synthesis of these linear nano- and micro-composites, a diverse range of lengths of structures is formed in the synthesis vessel. Sonication of the liquid mixture after synthesis was demonstrated to assist in controlling average size of the structures by diminishing the average length with increased time of sonication. Since the formed structures are highly stable, do not agglomerate, and are formed in liquid phase, centrifugation may also be used to assist in concentrating and segregating formed composites.

Here we present a protocol to synthesize novel, high-aspect ratio biocomposites under biological conditions and in liquid media. The biocomposites scale from nanometers to micrometers in diameter and length, respectively. Copper nanoparticles (CNPs) and copper sulfate combined with cystine are the key components for the synthesis.

Generazione di scalabili, Metallic Tacchi-Aspect nanocompositi Rapporto in un Biologica Liquid Media

The goal of this protocol is to describe the synthesis of two novel biocomposites with high-aspect ratio structures. The biocomposites consist of copper ...

Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of these porous nanofibers is of great interest due to their unique physiochemical properties. Here we elaborate on the fabrication of keratin containing poly (&#949;-caprolactone) (PCL) nanofibers (i.e., PCL/keratin composite fiber). Water soluble keratin was first extracted from human hair and mixed with PCL in different ratios. The blended solution of PCL/keratin was transformed into nanofibrous membranes using a laboratory designed electrospinning set up. Fiber morphology and mechanical properties of the obtained nanofiber were observed and measured using scanning electron microscopy and tensile tester. Furthermore, degradability and chemical properties of the nanofiber were studied by FTIR. SEM images showed uniform surface morphology for PCL/keratin fibers of different compositions. These PCL/keratin fibers also showed excellent mechanical properties such as Young&#39;s modulus and failure point. Fibroblast cells were able to attach and proliferate thus proving good cell viability. Based on the characteristics discussed above, we can strongly argue that the blended nanofibers of natural and synthetic polymers can represent an excellent development of composite materials that can be used for different biomedical applications.

Electrospun nanofibers have a high surface area to weight ratio, excellent mechanical integrity, and support cell growth and proliferation. These nanofibers have a wide range of biomedical applications. Here we fabricate keratin/ PCL nanofibers, using the electrospinning technique, and characterize the fibers for possible applications in tissue engineering.

Sintesi di nanofibre cheratina-based per Ingegneria Biomedica

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of ...

A Facile and Eco-friendly Route to Fabricate Poly(Lactic Acid) Scaffolds with Graded Pore Size

Over the recent years, functionally graded scaffolds (FGS) gaineda crucial role for manufacturing of devices for tissue engineering. The importance of this new field of biomaterials research is due to the necessity to develop implants capable of mimicking the complex functionality of the various tissues, including a continuous change from one structure or composition to another. In this latter context, one topic of main interest concerns the design of appropriate scaffolds for bone-cartilage interface tissue. In this study, three-layered scaffolds with graded pore size were achieved by melt mixing poly(lactic acid) (PLA), sodium chloride (NaCl) and polyethylene glycol (PEG). Pore size distributions were controlled by NaCl granulometry and PEG solvation. Scaffolds were characterized from a morphological and mechanical point of view. A correlation between the preparation method, the pore architecture and compressive mechanical behavior was found. The interface adhesion strength was quantitatively evaluated by using a custom-designed interfacial strength test. Furthermore, in order to imitate the human physiology, mechanical tests were also performed in phosphate buffered saline (PBS) solution at 37 &#176;C. The method herein presented provides a high control of porosity, pore size distribution and mechanical performance, thus offering the possibility to fabricate three-layered scaffolds with tailored properties by following a simple and eco-friendly route.

A Facile and Eco-friendly Route to Fabricate PolyLactic Acid Scaffolds with Graded Pore Size

In this work, poly(lactic acid)/polyethylene glycol (PLA/PEG) scaffolds were prepared by using a combination of melt mixing and selective leaching. The method herein discussed permitted to develop three-layer scaffolds by highly controlling both porosity and pore size. The mechanical properties were also evaluated in a physiological environment.

Un Facile ed ecologico percorso per fabbricare poli (acido lattico) Ponteggi con Graded dimensione dei pori

Over the recent years, functionally graded scaffolds (FGS) gaineda crucial role for manufacturing of devices for tissue engineering. The importance of ...

Synthesis of Multi-walled Carbon Nanotubes Modified with Silver Nanoparticles and Evaluation of Their Antibacterial Activities and Cytotoxic Properties

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver MWCNTs were prepared by the reductive deposition of silver from an aqueous solution of AgNO3 on the oxidized MWCNTs. Given the unique color of the CNTs, it was not possible to apply them to the minimum inhibitory concentration or mitochondrial toxicity assays to evaluate the toxicity and antibacterial properties, since they would interfere with the assays. The inhibition zone and minimum bactericidal concentration for the Ag-MWCNTs were measured and Live/Dead and Trypan Blue assays were used to measure the toxicity and antibacterial properties without interfering with the color of the CNTs.

In this study, antimicrobial nanomaterials were synthesized by acidic oxidation of multiwalled carbon nanotubes and subsequent reductive deposition of silver nanoparticles. Antimicrobial activity and cytotoxicity tests were performed with the as-prepared nanomaterials.

Sintesi di nanotubi di carbonio Multi-parete modificati con nanoparticelle di argento e valutazione dell'attività antibatterica e proprietà citotossiche

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in every tissue to be identified and characterized. Our laboratory is actively working to make technological advances in X-ray micro-computed tomography (micro-CT) that will bring the diagnostic power of histology to the study of full tissue volumes at cellular resolution (i.e., an X-ray Histo-tomography modality). Toward this end, we have made targeted improvements to the sample preparation pipeline. One key optimization, and the focus of the present work, is a straightforward method for rigid embedding of fixed and stained millimeter-scale samples. Many of the published methods for sample immobilization and correlative micro-CT imaging rely on placing the samples in paraffin wax, agarose, or liquids such as alcohol. Our approach extends this work with custom procedures and the design of a 3-dimensional printable apparatus to embed the samples in an acrylic resin directly into polyimide tubing, which is relatively transparent to X-rays. Herein, sample preparation procedures are described for the samples from 0.5 to 10 mm in diameter, which would be suitable for whole zebrafish larvae and juveniles, or other animals and tissue samples of similar dimensions. As proof of concept, we have embedded the specimens from Danio, Drosophila, Daphnia, and a mouse embryo; representative images from 3-dimensional scans for three of these samples are shown. Importantly, our methodology leads to multiple benefits including rigid immobilization, long-term preservation of laboriously-created resources, and the ability to re-interrogate samples.

We developed protocols and designed a custom apparatus to enable embedding of millimeter-scale specimens. We present sample preparation procedures with an emphasis on embedding in acrylic resin and polyimide tubing to achieve rigid immobilization and long-term storage of specimens for the interrogation of tissue architecture and cell morphology by micro-CT.

Rigida incorporamento di fisso e macchiato, complesso, scala millimetrata esemplari per l'istologia privo di sezione 3D da Micro-tomografia computerizzata

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...