Questo lavoro è stato sostenuto dal National Science Foundation tedesco (DFG) e dall&#39;Istituto federale per la valutazione dei rischi (BfR, Germania).

Gli oltre ogni disegno del protocollo contenente quattro fasi principali è rappresentato in figura 1. Tutte le fasi sono descritte in dettaglio. Isolamento delle cellule, la trasduzione e la cultura, seguita da confocale circa 24 ore è poi un consecutivi e obbligatoria tempi. La costruzione del virus dovrebbe essere fatto in anticipo l&#39;isolamento delle cellule e viene quindi utilizzato per la trasduzione genetica. 1. Isolamento dei miociti cardiaci da adulti cuore di ratto <ol><li> Adulto ratti maschi Wistar circa 250 g di peso (6-12 settimane di età) sono anestetizzati mediante iniezione intraperitoneale di 170 ul di soluzione anestesia per 100 g di peso corporeo </li><li> Inoltre, una soluzione di citrato (2 microlitri / g di peso corporeo) viene iniettato per evitare la coagulazione del sangue durante l&#39;intervento. </li><li> Perfusione Langendorff set-up deve essere preparato. Tutte le soluzioni devono essere saturata con l&#39;ossigeno. </li><li> Quando il ratto è anestetizzati, l&#39;animale è fissato su una tavola di chirurgia e la parte superiore del corpo è disinfettata con il 70% di etanolo. </li><li> L&#39;animale viene ucciso con il taglio della carotide. </li><li> Il torace è aperto con le forbici. Il cuore e l&#39;aorta dovrebbe essere accessibile. Il pericard viene rimosso. </li><li> Ghiacciata soluzione A + (5 ml) viene iniettato in entrambi i ventricoli con una 26-gauge per arrestare il cuore e lavare via il sangue. </li><li> L&#39;aorta viene afferrato con una pinza e troncato l&#39;arco aortico proprio sono stati i primi ramificazione si verifica. </li><li> Il cuore viene rimossa dal petto e l&#39;aorta è collegato alla cannula di perfusione set-up da pinze e un morsetto per consentire retrograda Langendorff-perfusione. Siate consapevoli di non foraminate le valvole aortica. </li><li> Il cuore deve essere stabilito da una legatura attorno alla aorta / cannula. Serbatoi aperti anche bisogno di essere legato. </li><li> Il cuore è retrogrado perfusi con una soluzione satura di ossigeno-A + a temperatura ambiente (23 ° C) per 10 min a una pressione di circa 70 mbar. Assicurarsi che non bolle d&#39;aria entrare l&#39;aorta. </li><li> La soluzione di perfusione è passati a una soluzione Liberase ad una temperatura di 37 ° C per circa 25 minuti ad una velocità di 4 ml / min per mezzo di una pompa peristaltica. Al termine della perfusione del cuore dovrebbe apparire in marmo bianco. Il tempo di digestione può essere necessario adattare alla situazione / condizione dei tessuti. </li><li> Il cuore è preso dalla perfusione set-up e posto in una soluzione contenente una capsula di Petri ad una temperatura di 37 ° C. Navi che restano e atri vengono tagliate. I vasi vengono scartati e gli atri - se necessario - sono trattate in modo diverso (non fa parte di questo protocollo). I ventricoli sono divisi in circa 6 pezzi. </li><li> I pezzi vengono trasferiti in un pallone di Erlenmeyer da 100 ml contenente 20 ml di soluzione A ad una temperatura di 37 ° C e un po &#39;agitato in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C per 5 min. Infine, il supernatante viene scartato. </li><li> La procedura sopra descritta viene ripetuta una o due volte. Il supernatante dovrebbe apparire leggermente opaco. </li><li> L&#39;incremento della concentrazione di calcio extracellulare è iniziata con l&#39;aggiunta di 20 ml di soluzione B 1 / 2 a 37 ° C per le cellule e tessuti rimanendo un residuo di soluzione A nella beuta. Questo è un po &#39;scosso in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C per altri 5 min. Successivamente il supernatante viene scartato. </li><li> Aggiungere altri 20 ml di soluzione B 1 / 2. (La soluzione surnatante / ora dovrebbe contenere cellule vitali.) Una goccia di cellule è trasferito in una capsula di Petri su un microscopio invertito colture cellulari. Se le cellule mostrano una elevata attività spontanea (contrazioni) bisogna aspettare le cellule vengono a riposo. </li><li> Ancora una volta il supernatante viene scartato e 20 ml di soluzione B 1 / 2 sono aggiunti. </li><li> La punta di una pipetta Pasteur di plastica è tagliata in modo tale che i pezzi di tessuto può passare facilmente quando agita attraverso l&#39;apertura. Con il trattamento fiamma spigoli vivi sono ammorbidite (fuso). </li><li> Ora i pezzi di tessuto sono leggermente e delicatamente triturato. I pezzi di tessuto dovrebbe &quot;cadere a pezzi&quot; nelle cellule. </li><li> La cella contenente surnatante viene decantato e diluita con soluzione B per raggiungere la densità cellulare desiderato, che dipende dal tipo di esperimenti e devono essere determinati empiricamente. </li></ol> 2. Costruzione di un adenovirus per la trasduzione proteina di fusione Per produrre la trasposizione adenovirus-Ad sistema vettore adenovirale da MP Biomedicals viene utilizzato 1. Questo protocollo inizia con il vettore d&#39;ingresso disponibili e testato (pCR259) per una proteina di fusione fluorescente o GEB 2 s. <ol><li> Un importo di 10 ng del citato iniziale pCR259 vettore contenente il gene di interesse si trasforma con 100 ul HighQ-1 Trasposizione-AD ™ 294 cellule competenti. </li><li> Questa miscela è incubata per 20 min in ghiaccio seguito da uno shock termico per 45 s a 42 ° C e conservati in ghiaccio per altri 2 minuti. </li><li> Aggiungere 900 &amp; mu; L di non selettivo LB-media e di crescere a 37 ° C con agitazione per 4 ore. </li><li> Tavola 50 microlitri, 100 ul e 200 ul su piastre contenenti LB-media con cloramfenicolo (Cm, 20 mg / ml), Ampicillina (100 mg / ml), tetraciclina (15 mg / ml), X-Gal (280 mg / ml ) e IPTG (40 mg / ml). (Una colorazione più intensa e veloce blu è possibile utilizzando il colorante più costosi Bluo-Gal con 300μg/ml. Questo deve essere usato in particolare quando non sono così familiari nel riconoscere e distinguere blu / bianco colonie) </li><li> Crescere per 24 ore a 37 ° C. Lasciare a 4 ° C fino a quando l&#39;identificazione di buone colonie blu è possibile. Quando ci sono problemi per decidere quale colonia è veramente bianco raccogliere alcune delle colonie e replicare su un altro piatto che contiene i tre antibiotici, X-Gal e IPTG e lasciarli crescere durante la notte a 37 ° C. Nota) La HighQ-1 Trasposizione-AD ™ 294 cellule contengono due plasmidi importanti: La spina dorsale adenovirus (Transpose-Ad ™ 294) e un aiutante plasmide che esprime un trasposasi, che media l&#39;inserimento del gene di interesse nei suoi siti bersaglio, che si trova nel gene LacZ del Transpose-AD 294 plasmide. </li><li> Per identificare le colonie positivo contenente il gene di interesse nella spina dorsale virus eseguire colonia-PCR come descritto nella 2,7-2,9. Usa primer vettore che fiancheggiano il sito più clonazione (avanti 5 &#39;CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG 3&#39;, invertire 5 &#39;GCGGATAACAATTTCACACAGG 3&#39;) e fare una colonia PCR con il 100% colonie bianche e utilizzare una colonia blu come controllo per la trasposizione-AD 294 plasmidi senza gene inserito di interesse. Colonie blu vi darà un breve frammento di PCR (~ 200bp), colonie contenente il gene di interesse mostrano un grande prodotto di PCR (a seconda della lunghezza del gene di interesse) e le colonie con due frammenti sono colonie di cellule multiple e devono essere separati se ulteriormente utilizzati. </li><li> Secondo la tabella riportata di seguito una master mix deve essere preparato. </li><li> Scegli una singola colonia 100% bianco con un stuzzicadenti in autoclave e prima una replica di questa colonia su un piatto con LB-Cm. </li><li> Trasferire la colonia nelle PCR-mix. Volteggiare nella PCR-mix di 3-4 volte rispetto togliere lo stuzzicadenti prima che potesse assorbire un sacco di PCR-mix. La PCR-protocollo dipende dal kb dell&#39;inserto e della polimerasi utilizzate. La temperatura di annealing del primer è di 57 ° C ed un utilizzo di 35 cicli è raccomandato. </li><li> Crescere nel culture notte (LB-medio con Cm) dei cloni positivi e isolare i plasmidi con un kit disponibile in commercio senza colonne di rotazione, perché la forza centrifuga interrompe il vettore enorme virus. </li><li> Trasforma 0,5 mcg di plasmidi isolati in 100 ul cellule DH5α competenti. Incubare le cellule con DNA in ghiaccio per 30 min. Shock termico 45 s a 42 ° C e impostare in ghiaccio per 2 minuti. </li><li> Aggiungere 900 microlitri non selettivo LB-media e di crescere a 37 ° C con agitazione per 1 ora. </li><li> Tavola 50 microlitri su un piatto contenente LB-media con Cm, X-Gal e IPTG. Incubare a 37 ° C per 24 ore. </li><li> Raccogliere e replicare fino a 20 100 colonie% bianco separati ampicillina, tetracicline e cloramfenicolo piastre contenenti IPTG e X-Gal. Lasciateli crescere durante la notte a 37 ° C. Selezionare le colonie che sono 100% bianco, resistente cloramfenicolo, ampicillina e tetraciclina sensibile. </li><li> Colony-PCR (opzionale): cloni positivi possono essere testati di nuovo con colonia-PCR per verificare che essi contengono l&#39;inserto. </li><li> Scegli una singola colonia di un ricombinante positivo e crescere in 600 ml di LB-media con Cm. </li><li> Isolare il plasmide utilizzando un kit plasmide maxi. </li><li> Digest 5 microgrammi di plasmide con Pac io per due ore a 37 ° C e fermare la reazione a 65 ° C per 20 min. </li><li> Concentrare l&#39;digerire tutto in una SpeedVac a temperatura ambiente per 30 minuti ad un volume finale di 10 microlitri o utilizzare un fenolo-cloroformio metodo di estrazione. </li><li> Scongelare una fiala di surgelati QBI-HEK 293 cellule con agitazione in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C. Lavare la parte esterna del flaconcino con 70% di etanolo e procedere in modo asettico in una cappa sterile. </li><li> Trasferire le cellule ad un tubo sterile 15 ml, aggiungere goccia a goccia 10 ml DMEM (+10% FCS), mentre agita dolce e centrifugare 10 min a 250xg per agglomerare le cellule. </li><li> Gettare il surnatante. Risospendere il pellet in 10 ml di DMEM (+10% FCS) pipettando gentilmente su e giù. </li><li> Seme in un centimetro 75 2 pallone e aggiungere 10 ml di DMEM con 10% FCS per le cellule. Incubare per una notte a 37 ° C in un 5% di CO 2 incubatore. </li><li> Il giorno successivo verificare la densità cellulare. QBI HEK-293 cellule dovrebbe essere diviso in un rapporto 1:10-1:20. </li><li> Rimuovere il supporto dalle cellule e trypsinize con 2 ml di tripsina per almeno 1-3. Dare 10 ml DMEM alle cellule e centrifugare a 250xg per 10 minuti. </li><li> Rimuovere accuratamente il mezzo e dare 10 ml di terreno fresco per le cellule, risospendere e contare le cellule. </li><li> Piastra in sei ben bene con uno 2x10 5, 3x10 5 </sa&gt;, 4x10 5, 5 e 5x10 6x10 5 celle. Incubare il piatto a 37 ° C in CO 2-incubatore. </li><li> Al giorno successivo utilizzare un bene con 50% di confluenza di trasfezione con il concentrato Pac io digerisco. Abbiamo una buona esperienza con Lipofectamine 2000 transfezione, ma anche altri metodi (come la transfezione fosfato di calcio) dovrebbe essere adatto. </li><li> Modificare le medie h ben 3-4 prima di trasfezione per le cellule in crescita esponenziale nel corso della procedura. </li><li> Mescolare 5 Lipofectamine microlitri con 250 microlitri DMEM e incubare a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Dare il Lipofectamine-Media Miscela al DNA (Pac I digerire) e mescolare toccando contro il tubo di reazione, non mescolare pipettando. Incubare la miscela 20 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Caduta la miscela di trasfezione per le cellule e rock la piastra per mescolare. Incubare a 37 ° C con 5% di CO 2. Cambia media dopo 4-5 ore. </li><li> Due giorni dopo la transfezione prendere il medium dalle cellule e dare in un pallone coltura fresca (75 cm 2). </li><li> Trypsinize le cellule con 500 microlitri tripsina per un massimo di 5 minuti. 1 ml di DMEM dare alle cellule, prendere l&#39;impasto e metterla tutta, insieme con 17 ml di mezzo fresco (DMEM con FCS) nel pallone cultura. Coltivare le cellule a 37 ° C con 5% di CO 2 fino a effetto citopatico (CPE) sono visibili. Vedere la Figura 2 per imparare come CPE dovrebbe essere simile. </li><li> Raccogliere le cellule con il mezzo in un tubo da 50 ml e congelare le cellule a -80 ° C. Rompere le cellule con tre cicli gelo / disgelo (-80 ° C/37 ° C acqua bagno). </li><li> Centrifugare 20 min a 8000xg e 4 ° C. Decantare il supernatante in un 100mm, diametro del disco e scartare il pellet. Utilizzare un filtro sterile con 0.45μm dimensione dei pori per filtrare il supernatante. Questo è lo stock primo virus (passaggio 1). </li><li> Usare 1 / 3 di questo stock di trasdurre uno 75 centimetri 2 pallone con QBI HEK-293 cellule con il 70% confluenza. Incubare a 37 ° C e 5% di CO 2 fino a CPE s sono visibili. </li><li> Se le cellule mostrano CPE s li raccolgono e estrarre il virus come fatto prima. Questo è il passaggio 2 del virus. </li><li> Ripetere i passaggi 2,37 e 2,38 con il passaggio del virus 2 e così via fino a quando l&#39;amplificazione del virus raggiunge una scorta sufficiente virus. Il virus può essere concentrato con centrifugazione tubi specifici (Amicon Ultra-15 unità centrifughe filtro con ultracel-100 da membrana Millipore) e conservati per diversi mesi a -80 ° C. Per contare le particelle infettive utilizzare un test targa. </li><li> Utilizzare il passaggio del virus 2 o superiore per trasdurre cellule e per l&#39;amplificazione del virus. </li></ol> 3. Colture cellulari primarie e trasduzione adenovirali <ol><li> Sterile scivola coperchio rotondo del diametro di 20 mm sono poste in standard di 12 pozzetti. </li><li> 20 ul di soluzione ECM è ugualmente distribuiti su ciascun vetrino. Resti vengono scartati. Per l&#39;asciugatura permettono un minimo di 1 ora a 37 ° C. In alternativa al rivestimento in grado di secca durante la notte (12 ore) a temperatura ambiente. </li><li> Ogni bene è riempito con 1 ml di mezzo M199 con integratori che comprende antibiotici e ITS. </li><li> Una sospensione cellulare (dal punto 1.21) tra 200 e 400 microlitri si aggiunge a ciascun pozzetto. Coltura delle cellule avviene a 37 ° C in un 5% di CO 2 incubatore. </li><li> Le cellule sono autorizzati a sedimenti e dopo 1 h di media è cambiato. </li><li> Immediatamente dopo aver cambiato il medium una adeguata quantità di soluzione contenente virus (passaggio da 2 o superiore) viene mescolato con delicatezza la piastra a dondolo. </li><li> In caso di medio lungo termine cultura viene cambiata ogni 2 giorni. </li><li> 24 ore dopo la trasfezione espressione GEB è ​​rilevabile. </li></ol> 4. L&#39;imaging confocale per il 3D delle strutture subcellulari e Ca 2 + di segnalazione Confocale può essere eseguito su qualsiasi microscopio confocale. Tuttavia, il calcio-imaging esperimenti richiedono una velocità di acquisizione di almeno il video tasso (25-30 Hz). Questo limita tecnologie utilizzabili a uno scanner a raggi multipli (es. disco Nipkow, spazzato campo o chilo-beam scanner array) o lo scanner molto veloce fascio singolo (ad esempio scanner di risonanza o deflettore acusto ottico (AOD)-scanner). Per una panoramica vedi rif. 3. Il 3D-subcellulare immagini richiede un z-drive. Ecco un chilo-fascio scanner array (VTinfinity, VisiTech Int.., Sunderland, UK) è usato. <ol><li> Il microscopio e periferiche deve essere impostato in una modalità di funzionamento. Soprattutto per il laser questo può richiedere un periodo di riscaldamento fino a una potenza di uscita stabile è raggiunto. </li><li> Cellule devono essere trasferiti in una camera sperimentale (copertura antiscivolo di trasferimento). I coprioggetti con le cellule vengono trasferiti ad una camera sperimentale. 1 ml di soluzione Tyrode (contenente 1,8 mM di calcio extracellulare) viene poi aggiunto. </li><li> La camera sperimentale ha bisogno di essere immessi sul palco microscopio. Stimolazione elettrodi, perfusione set-up e altre periphedispositivi naturali, il controllo della temperatura per esempio, devono essere organizzati di conseguenza. </li><li> Le cellule saranno concentrati a e selezionati con la luce bianca e / o illuminazione epifluorescente. </li><li> Parametri di acquisizione come la potenza del laser, il tempo di esposizione ecc o un protocollo intero esperimento ha bisogno di essere messa a punto. </li><li> Immagini serie temporali e / o Z-sezione può essere acquisita. </li><li> Sulle misurazioni di set-up più avanzata multimodale può essere fatto utilizzando elettrofisiologia (patch-clamp) e / o manipolazione ottica come redistribuzione a fluorescenza, dopo photobleach (FRAP) o uncaging di sostanze tra cui due fotolisi fotone. </li><li> Analisi delle immagini, soprattutto 3D ricostruzione viene eseguita su un software di analisi dedicato, come Imaris (Bitplane AG, Zurigo, Svizzera), velocità (improvvisazione, Coventry, UK) o Browser Arivis (arivis GmbH, Rostock, Germania). </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: I risultati finali del protocollo sono sequenze di immagini che possono essere utilizzati per estrarre ulteriori dati. Un esempio è l&#39;indagine delle strutture subcellulari e organelli. La Figura 3 mostra l&#39;esempio del 3-dimensionale disposizione dell&#39;apparato di Golgi. A differenza di microscopia elettronica tutte le indagini possono essere eseguite su cellule viventi. <img src="/files/ftp_upload/1433/JoVEFig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: flusso generale delle fasi principali sperimentale. <img src="/files/ftp_upload/1433/JoVEFig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2: L&#39;immagine a sinistra raffigura il Q-HEK cellule in coltura con il 90-95% confluenza che non sono trasdotte. Effetti Cytopatic dopo trasduzione virale sono riportati nella parte destra. Cellule rotonde e staccarsi dal fondo della piastra. In queste cellule il nucleo occupa la maggior parte delle cellule a causa della produzione di virus attivi. <img src="/files/ftp_upload/1433/JoVEFig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3: ratto adulto miociti cardiaci transfettate con un YFP-proteina di fusione intese a promuovere l&#39;apparato di Golgi. Miociti cardiaci dopo il trasferimento genico adenovirali (un giorno nella cultura) esprimono la proteina fluorescente fusione. Un pannello raffigura una sola fetta confocale preso da un z-stack. Nel pannello B stessa cella è rappresentata dopo deconvoluzione utilizzando una teorica funzione di diffusione del punto (PSF). Questa de-offuscata serie di immagini viene successivamente utilizzato per rendere il cellulare e ottenere una ricostruzione 3D del volume, come mostrato nel pannello C o una ricostruzione di superfici 3D (D). La barra rappresenta 10 micron.

<ol>
	<li>Kaestner, L., Ruppenthal, S., S, ., Licha, K., Lin, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Imaging II. Vol. 7370, 737008-737008 (2009).</li><li>Viero, C., Kraushaar, U., Ruppenthal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+Drosophila+melanogaster+pupae+with+mesoscopic+fluorescence+tomography.">In vivo imaging of Drosophila melanogaster pupae with mesoscopic fluorescence tomography.</a> Cell Calcium. 43 (1), 59-59 (2008).</li><li>Kaestner, L., Lipp, P., Shorte, S. L., Frischknecht, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 289-289 (2007).</li><li>Kaestner, L., Lipp, P., Popp, J., von Bally, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Optics in Life Science. Vol. 6633, 66330K-66330K (2007).</li><li>Rinne, A., Littwitz, C., Bender, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+delivery+of+short+hairpin+RNA+(shRNA)+mediates+efficient+gene+silencing+in+terminally+differentiated+cardiac+myocytes.">Adenovirus-mediated delivery of short hairpin RNA (shRNA) mediates efficient gene silencing in terminally differentiated cardiac myocytes.</a> Methods Mol Biol. 515, 107-107 (2009).</li></ol>

La procedura descritta per l&#39;isolamento dei cardiomiociti di ratto può essere adattato ad altre specie, ad esempio, il mouse 4, se necessario. Un parametro che ha bisogno di adattamento è il mix di enzimi per la digestione (vedi sotto) e anche la durata della digestione. Essere consapevoli del fatto che le cellule di alcune specie (topo per esempio) potrebbe essere più fragile di altri (ad esempio, ratto). La scelta di collagenasi è probabilmente il passo più importante n...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Anesthesia solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Serumwerk Bernburg GmbH (Ursotamin), Bayer Health Care (Rompun)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mixture of 1 ml Ursotamin (100 mg/ml Ketaminhydrochlorid) and 240 &mu;l Rompun (2% Xylazinhydrochlorid)</td>
</tr>
<tr>
<td>Citrate solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>117,64 mg sodium citrate in 10 ml 0.9% NaCl solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Solution A</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>134 mM NaCl, 4 mM KCl, 11 mM glucose, 1.2 mM MgSO4, 1.2 mM Na2HPO4, 10 mM HEPES, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered</td>
</tr>
<tr>
<td>Solution A+</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Content of solution A plus 0.2 mM EGTA, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered</td>
</tr>
<tr>
<td>Liberase solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>F. Hoffmann&#x2010; La Roche Ltd.</td>
<td>11988476 001</td>
<td>500 &mu;l stock solution in 15 ml solution A (stock solution:
10 mg/ml Liberase Blendzyme 4 in aqua dest.)</td>
</tr>
<tr>
<td>Solution B</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Content of solution A plus 200 &mu;M CaCl2 and 0.1% DNase solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Solution B1/2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1:1 mixture of solution A and solution B</td>
</tr>
<tr>
<td>DNase solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma&#x2010; Aldrich Co.</td>
<td>D4527</td>
<td>Deoxyribonuclease I, Type 2 from bovine pancreas, 40 KU (15 mg) are dissolved in 5 ml of 10 mM Tris&#x2010;HCl buffer, adjusted to pH=7.35, additional content: 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM dithioerythritol; this solution is mixed with 5 ml glycerol</td>
</tr>
<tr>
<td>Extracellular matrix protein (ECM) solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Extracellular matrix protein (ECM) solution</td>
<td>E1270</td>
<td>1 ml stock solution as purchased is diluted with 6 mL
medium M199</td>
</tr>
<tr>
<td>Culture medium M199</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PAA</td>
<td>E15&#x2010;834</td>
<td>Medium M199 supplemented with 1 &mu;l/ml ITS solution and 20 &mu;l/ml penicillin&#x2010;streptomycin solution (5000 units/ml)</td>
</tr>
<tr>
<td>ITS solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>25 mg Insulin, 25 mg Transferrin and 50 &#x03BC;l Selenite stock solution are dissolved in 5 ml aqua dest. (stock solution: 0.5 mg/ml Sodiumselenite in aqua dest.). Add a few drops of 1 M HCl until one should get a clear
solution. Aliquots can be frozen.</td>
</tr>
<tr>
<td>Tyrode</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>135 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 2mM MgCl2, 10 mM glucose, 10 mM HEPES, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered</td>
</tr>
<tr>
<td>Master mix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5 &mu;l 10&#215;PCR&#x2010;Buffer, 5 &mu;l MgCl2 (25 mM), 2 &mu;l forward primer, 2 &mu;l reverse primer, 1 &mu;l dNTP&#180;s (10 mM each), 33 &mu;l H2O, 1 &mu;l DMSO, 1 &mu;l Taq&#x2010;DNA polymerase for each sample</td>
</tr>
<tr>
<td>LB&#x2010;Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>10 g/l Tryptone, 5 g/l Yeast extract, 5 g/l NaCl (and 15 g/l Agar if used as solid medium), pH 7.0</td>
</tr>
<tr>
<td>Pac I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>R0547L</td>
<td>preparation: 50 &mu;g DNA, 5 &mu;l 10&#215;buffer, 0.5 &mu;l 100&#215;BSA,
0.75 &mu;l Pac I, fill with H2O up to final volume of 50&mu;l</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation and genetic manipulation of adult cardiac myocytes for confocal imaging

Miociti cardiaci isolati da cuori adulti sono ampiamente accettate come un modello da qualche parte a metà strada tra le cellule muscolari embrionali e neonatale da un lato e un cuore lavoro, dall&#39;altro. Così, cardiomiociti servire come buoni modelli per cardiache fisiologia e fisiopatologia cellulare, per le indagini farmaceutica e per l&#39;esplorazione di modelli animali transgenici. Qui si descrive un metodo per isolare le cellule del cuore. Inoltre si mostra come una manipolazione genetica su miociti cardiaci possono essere eseguiti senza allevare un animale transgenico: Questa è la combinazione della cultura a lungo termine (1 settimana) e il trasferimento di geni adenovirali. Che quest&#39;ultima sia descritto dalla costruzione del virus per la trasduzione delle cellule. Può essere utilizzato per l&#39;espressione di biosensori geneticamente codificato (GEBS), proteine ​​di fusione fluorescenti, ma anche per le proteine ​​oltre espressione e giù per regolamento, ad esempio utilizzando RNAi. Qui abbiamo un esempio per l&#39;espressione di una proteina di fusione colorazione una struttura subcellulare (Golgi). Espressione di tali proteine ​​possono essere visualizzate da imaging confocale di z-stack per una ricostruzione 3D di strutture subcellulari. Il protocollo comprende state-of-the-art in coltura cellulare, biologia molecolare e di biofisica e fornisce quindi un metodo per esplorare nuovi orizzonti in cardiologia cellulare.

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Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Adulti miociti cardiaci sono cellule primarie che possono essere isolati da cuori animali e coltivate per diversi giorni. In questo periodo la cultura trasferimento genico adenovirali possono essere usate per esprimere biosensori geneticamente codificato (GEBS) o proteine ​​di fusione fluorescenti. Entrambi gli approcci consentono indagini cellulari mediante microscopia confocale.

L&#39;isolamento e la manipolazione genetica di adulti miociti cardiaci per confocale Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

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Biology

14.5K Views.  Universty of Saarland. Adulti miociti cardiaci sono cellule primarie che possono essere isolati da cuori animali e coltivate per diversi giorni. In questo periodo la cultura trasferimento genico adenovirali possono essere usate per esprimere biosensori geneticamente codificato (GEBS) o proteine ​​di fusione fluorescenti. Entrambi gli approcci consentono indagini cellulari mediante microscopia confocale.

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Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research. Nevertheless, establishment of robust, viable cultured adult myocytes can be a technically challenging, rate-limiting step for many researchers. Here we described a protocol to obtain a high yield of adult rat heart myocytes that remain viable in culture for several days. The heart is isolated and perfused with collagenase and protease under low Ca2+ conditions to recover single myocytes. Ca2+-tolerant cells are obtained by stepwise increases in extracellular Ca2+ concentration in three subsequent wash steps. Cells are filtered, resuspended in culture medium, and plated on laminin coated slips. Cultured myocytes obtained using this protocol are viable for up to four days and are suitable for most experiments including electrophysiology, biochemistry, imaging and molecular biology.

In this paper, we described a typical way to isolate and culture adult rat heart myocytes. Collagenase and protease are used to digest and isolate single myocytes. Myocytes cultured follow this protocol meet most experiment requirements.

Cultura primario di miociti adulti Cuore Rat

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

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Biologia

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its remarkable neuronal cell plasticity, and its involvement in epilepsy, neurodegenerative diseases, and psychiatric disorders. The hippocampus is composed of distinct regions; the dentate gyrus, which comprises mainly granule neurons, and Ammon's horn, which comprises mainly pyramidal neurons, and the two regions are connected by both anatomic and functional circuits. Many different mRNAs and proteins are selectively expressed in the dentate gyrus, and the dentate gyrus is a site of adult neurogenesis; that is, new neurons are continually generated in the adult dentate gyrus. To investigate mRNA and protein expression specific to the dentate gyrus, laser capture microdissection is often used. This method has some limitations, however, such as the need for special apparatuses and complicated handling procedures. In this video-recorded protocol, we demonstrate a dissection technique for removing the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope. Dentate gyrus samples prepared using this technique are suitable for any assay, including transcriptomic, proteomic, and cell biology analyses. We confirmed that the dissected tissue is dentate gyrus by conducting real-time PCR of dentate gyrus-specific genes, tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO2) and desmoplakin (Dsp), and Ammon's horn enriched genes, Meis-related gene 1b (Mrg1b) and TYRO3 protein tyrosine kinase 3 (Tyro3). The mRNA expressions of TDO2 and Dsp in the dentate gyrus samples were detected at obviously higher levels, whereas Mrg1b and Tyro3 were lower levels, than those in the Ammon's horn samples. To demonstrate the advantage of this method, we performed DNA microarray analysis using samples of whole hippocampus and dentate gyrus. The mRNA expression of TDO2 and Dsp, which are expressed selectively in the dentate gyrus, in the whole hippocampus of alpha-CaMKII+/- mice, exhibited 0.037 and 0.10-fold changes compared to that of wild-type mice, respectively. In the isolated dentate gyrus, however, these expressions exhibited 0.011 and 0.021-fold changes compared to that of wild-type mice, demonstrating that gene expression changes in dentate gyrus can be detected with greater sensitivity. Taken together, this convenient and accurate dissection technique can be reliably used for studies focused on the dentate gyrus.

A dissection technique for removal of the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope was demonstrated in this video-recorded protocol.

Dissezione di giro dentato ippocampale di topo adulto

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

The study of electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ handling abnormalities requires isolated cardiomyocytes. In addition, the possibility to investigate myocytes from patients using these techniques is an invaluable requirement to elucidate the molecular basis of cardiac diseases such as atrial fibrillation (AF).1 Here we describe a method for isolation of human atrial myocytes which are suitable for both patch-clamp studies and simultaneous measurements of intracellular Ca2+ concentrations. First, right atrial appendages obtained from patients undergoing open heart surgery are chopped into small tissue chunks ("chunk method") and washed in Ca2+-free solution. Then the tissue chunks are digested in collagenase and protease containing solutions with 20 &mu;M Ca2+. Thereafter, the isolated myocytes are harvested by filtration and centrifugation of the tissue suspension. Finally, the Ca2+ concentration in the cell storage solution is adjusted stepwise to 0.2 mM. We briefly discuss the meaning of Ca2+ and Ca2+ buffering during the isolation process and also provide representative recordings of action potentials and membrane currents, both together with simultaneous Ca2+ transient measurements, performed in these isolated myocytes.

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

We describe the isolation of human atrial myocytes which can be used for intracellular Ca2+ measurements in combination with electrophysiological patch-clamp studies.

Isolamento dei miociti atriali umane per misure simultanee di Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Transitori e correnti di membrana

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly understood. Here assays are described to monitor the ability and kinetics of healing of cultured cells following localized injury. The first protocol describes an end point based approach to simultaneously assess cell membrane repair ability of hundreds of cells. The second protocol describes a real time imaging approach to monitor the kinetics of cell membrane repair in individual cells following localized injury with a pulsed laser. As healing injured cells involves trafficking of specific proteins and subcellular compartments to the site of injury, the third protocol describes the use of above end point based approach to assess one such trafficking event (lysosomal exocytosis) in hundreds of cells injured simultaneously and the last protocol describes the use of pulsed laser injury together with TIRF microscopy to monitor the dynamics of individual subcellular compartments in injured cells at high spatial and temporal resolution. While the protocols here describe the use of these approaches to study the link between cell membrane repair and lysosomal exocytosis in cultured muscle cells, they can be applied as such for any other adherent cultured cell and subcellular compartment of choice.

The process of healing injured cells involves trafficking of specific proteins and subcellular compartments to the site of cell membrane injury. This protocol describes assays to monitor these processes.

Imaging Membrana cellulare Pregiudizio e processi subcellulari coinvolti nella riparazione

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult cardiomyocytes are widely accepted as a good model for cardiac cellular physiology and pathophysiology, as well as for pharmaceutical intervention. Genetically modified mice preclude the need for complicated cardiomyocyte infection processes to generate the desired genotype, which are inefficient due to cardiomyocytes&#8217; terminal differentiation. Isolation and culture of high quantity and quality functional cardiomyocytes will dramatically benefit cardiovascular research and provide an important tool for cell signaling transduction research and drug development. Here, we describe a well-established method for isolation of adult mouse cardiomyocytes that can be implemented with little training. The mouse heart is excised and cannulated to an isolated heart system, then perfused with a calcium-free and high potassium buffer followed by type II collagenase digestion in Langendorff retrograde perfusion mode. This protocol yields a consistent result for the collection of functional adult mouse cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

We describe a reliable method for isolation of adult mouse cardiomyocytes. This protocol yields a consistent result for the culture of functional adult cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Isolamento e Cultura del topo adulto Cardiomyocytes per Cell Signaling e<em&gt; In vitro</em&gt; Cardiaca Ipertrofia

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

Elettroporazione DNA, isolamento e imaging di miofibre

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). These pacemaker APs reflect the coordinated activity of numerous membrane currents and intracellular calcium cycling. However the precise mechanisms that drive spontaneous pacemaker activity in SAMs remain elusive. Acutely isolated SAMs are an essential preparation for experiments to dissect the molecular basis of cardiac pacemaking. However, the indistinct anatomy, complex microdissection, and finicky enzymatic digestion conditions have prevented widespread use of acutely isolated SAMs. In addition, methods were not available until recently to permit longer-term culture of SAMs for protein expression studies. Here we provide a step-by-step protocol and video demonstration for the isolation of SAMs from adult mice. A method is also demonstrated for maintaining adult mouse SAMs in vitro and for expression of exogenous proteins via adenoviral infection. Acutely isolated and cultured SAMs prepared via these methods are suitable for a variety of electrophysiological and imaging studies.

Methods are demonstrated for the isolation of sinoatrial node myocytes (SAMs) from adult mice for patch clamp electrophysiology or imaging studies. Isolated cells can be used directly or can be maintained in culture to permit expression of proteins of interest, such as genetically encoded reporters.

Metodi per l&#39;isolamento, la cultura, e la caratterizzazione funzionale di seno-atriale Nodo miociti da topi adulti

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead myocardium after MI. Although several strategies have been used to regenerate myocardium, stem cell therapy remains a major approach to replenish the dead myocardium of an MI heart. Accumulating evidence suggests the presence of resident cardiac stem cells (CSCs) in the adult heart and their endocrine and/or paracrine effects on cardiac regeneration. However, CSC isolation and their characterization and differentiation toward myocardial cells, especially cardiomyocytes, remains a technical challenge. In the present study, we provided a simple method for the isolation, characterization, and differentiation of CSCs from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient method for the isolation of CSCs, where the heart is digested by a 0.2% collagenase II solution. To characterize the isolated CSCs, we evaluated the expression of CSCs/cardiac markers Sca-1, NKX2-5, and GATA4, and pluripotency/stemness markers OCT4, SOX2, and Nanog. We also determined the proliferation potential of isolated CSCs by culturing them in a Petri dish and assessing the expression of the proliferation marker Ki-67. For evaluating the differentiation potential of CSCs, we selected seven- to ten-days cultured CSCs. We transferred them to a new plate with a cardiomyocyte differentiation medium. They are incubated in a cell culture incubator for 12 days, while the differentiation medium is changed every three days. The differentiated CSCs express cardiomyocyte-specific markers: actinin and troponin I. Thus, CSCs isolated with this protocol have stemness and cardiac markers, and they have a potential for proliferation and differentiation toward cardiomyocyte lineage.

The overall goal of this article is to standardize the protocol for the isolation, characterization, and differentiation of cardiac stem cells (CSCs) from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient centrifugation method to isolate murine CSCs and elaborated methods for CSC culture, proliferation, and differentiation into cardiomyocytes.

Isolamento, caratterizzazione e differenziamento di cellule staminali cardiache dal cuore di topo adulto

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that mitigate fibrosis. However, fibroblast research has been hindered due to the lack of universally acceptable fibroblast markers to identify quiescent as well as activated fibroblasts. Fibroblasts are a heterogenous cell population, making them difficult to isolate and characterize. The presented protocol describes three different methods to enrich fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts. Using a standard and reliable protocol to isolate fibroblasts will enable the study of their roles in homeostasis as well as fibrosis modulation.

Obtaining a pure population of fibroblasts is crucial to studying their role in wound repair and fibrosis. Described here is a detailed method to isolate fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts followed by characterization of their purity and functionality by immunofluorescence, RTPCR, fluorescence-assisted cell sorting, and collagen gel contraction.

Isolamento e caratterizzazione di fibroblasti cardiaci adulti e miofibroblasti

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Simultaneous Isolation and Culture of Atrial Myocytes, Ventricular Myocytes, and Non-Myocytes from an Adult Mouse Heart

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. While isolating myocytes from neonatal mouse hearts is relatively straightforward, myocytes from the adult murine heart are preferred. This is because compared to neonatal cells, adult myocytes more accurately recapitulate cell function as it occurs in the adult heart in vivo. However, it is technically difficult to isolate adult mouse cardiac myocytes in the necessary quantities and viability, which contributes to an experimental impasse. Furthermore, published procedures are specific for the isolation of either atrial or ventricular myocytes at the expense of atrial and ventricular non-myocyte cells. Described here is a detailed method for isolating both atrial and ventricular cardiac myocytes, along with atrial and ventricular non-myocytes, simultaneously from a single mouse heart. Also provided are the details for optimal cell-specific culturing methods, which enhance cell viability and function. This protocol aims not only to expedite the process of adult murine cardiac cell isolation, but also to increase the yield and viability of cells for investigations of atrial and ventricular cardiac cells.

A method is described for the simultaneous isolation of myocytes and non-myocytes from both the atria and ventricles of a single adult mouse heart. This protocol results in consistent yields of highly viable cardiac myocytes and non-myocytes and details optimal cell-specific culture conditions for phenotyping and in vitro analysis.

Isolamento simultaneo e cultura di miociti atriali, miociti ventricolari e non miociti da un cuore di topo adulto

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. ...