Questo lavoro è stato sostenuto dal National Heart, Lung, and Blood Institute di Grant HL-36573. Ringraziamo il Sig. David Sowa per la modifica di questo manoscritto.

Tutte le ricerche sui topi è stato fatto secondo le procedure e le linee guida del National Institutes of Health, e i protocolli sono stati approvati dal Comitato delle Università di Toledo Istituzionale cura degli animali ed uso, Collegio di Medicina e Scienze della Vita. 1. Perfusione preparazione sistema <ol><li> Il giorno prima isolamento, riempire l&#39;intero sistema di perfusione (compresi serbatoi) con una soluzione di detersivo veloce senza residui alcalini. Lasciare che la soluzione di penetrare nel sistema per poche ore o durante la notte. </li><li> La mattina successiva, regolare la temperatura termociclatore a 37 ° C e lasciare la soluzione di scaldarsi. Rimuovere la soluzione detergente e lavare accuratamente il sistema con acqua distillata sterilizzata. Non dimenticare tutti i rami laterali. </li><li> Riempire il sistema con tampone di perfusione attraverso una pompa peristaltica costante e disegnare le bollicine d&#39;aria dalla camera aorta (gorgogliatore) con una siringa laterale per proteggereil cuore da occlusione coronarica. La portata della pompa peristaltica deve essere controllato regolarmente. </li></ol> 2. Preparazione del buffer, Cultura Media e Piatti <ol><li> Perfusione Buffer: Fai 500 ml di tampone di perfusione 1x prima dell&#39;uso. Questo buffer priva di calcio contiene 113 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 0,6 mM KH 2 PO 4, 0.6 mM Na 2 HPO 4, 1.2 MgSO mm 4, 10 mM Na-HEPES, 12 NaHCO mm 3, 10 KHCO mm 3, 0.032 fenolo mm Rosso, taurina 30 mm, BDM 10 mm, 5,5 mM di glucosio. Regolare il pH a 7.0 con 2 M HCl e filtrare attraverso un filtro di 0,2 micron, conservare a 4 ° C. Nota: a) La soluzione perfusione deve essere preparata nello stesso giorno in cui viene utilizzato. In alcuni casi, è accettabile per conservare la soluzione per meno di 3 giorni a 4 ° C. b) Questo buffer ha una concentrazione di potassio alti fino a 15,3 millimetri, che può mantenere i cardiomiociti riposo, ridurre ATP cONSUMO e aumentare la capacità di Ca 2 +-tolerant. </li><li> Digestion Buffer (300 U / ml, 25-50 ml / cuore): preparare appena prima di perfusione. Pesare 15.000 U di attività totale di tipo II collagenasi, sciogliere in 50 ml di tampone di perfusione in cappa di coltura. Aggiungere 25 ml di 100 mM CaCl 2 (soluzione, filtra sterilizzato) per rendere la concentrazione finale di calcio a 50 micron. Riscaldare il buffer di 37 ° C quando è pronto per l&#39;isolamento. Diversamente tripsina, collagenasi funziona meglio in presenza di 50-100 mM Ca 2 +. </li><li> Arresto Buffer (50 ml / cuore): Operare in cappa di coltura. Miscelare 45 ml di tampone di perfusione con 5 ml sterile FBS. <ol><li> Ca 2 + soluzione I (12.5 mM Ca 2 +): Aggiungere 2,5 ml di 100 mM CaCl 2 a 20 ml di tampone di arresto e mescolare. </li><li> Ca 2 + soluzione II (100 mM Ca 2 +): Aggiungere 10 ml di 100 mM CaCl 2 a 10 ml di tampone di arresto e mescolare. </li><li> Ca 2 + soluzione III (400 mM Ca 2 +): Aggiungere 40 ml di 100 mM CaCl 2 a 10 ml di tampone di arresto e mescolare. </li><li> Ca 2 + IV soluzione (900 mM Ca 2 +): Aggiungere 90 ml di 100 mM CaCl 2 a 10 ml di tampone di arresto e mescolare. </li></ol></li><li> Placcatura medio (50 ml / cuore): Trasferimento 43 ml di MEM contenente 2 mM L-glutammina e 1.26 mM CaCl 2 in una sterile tubo conico da 50 ml in cappa di coltura e aggiungere 5 ml di FBS, 1 ml di soluzione BDM ( 500 mM, sterilizzato per filtrazione), e 0,5 ml di penicillina / streptomicina (10.000 U / ml). Mescolare ed equilibrare per 2-3 ore prima dell&#39;isolamento miociti in 2% di CO 2, 37 ° C incubatore con i tappi allentati. Proprio prima placcatura miociti, aggiungere 0,5 ml di ATP 200 mM (pH 7.2, soluzione madre, filtra sterilizzato) nel mezzo. </li><li> Terreno di coltura (50 ml / heart): Trasferimento 48 ml di MEM contenente 2 mM L-glutammina e 1.26 mM CaCl 2 in una sterile tubo conico da 50 ml in cappa di coltura e aggiungere 1 ml di soluzione madre BDM (500 mm, filter sterilizzato), e 0,5 ml di penicillina / streptomicina (10.000 U / ml). Mescolare ed equilibrare in 2% di CO 2, 37 ° C incubatore prima dell&#39;isolamento miociti. Prima dell&#39;uso, aggiungere 0,5 ml di 100 mg / ml di BSA (filtro sterilizzato) nel mezzo. Nota: L&#39;utilizzo di un incubatore CO 2 2% facilita il mantenimento della cultura medio pH a 6,9-7,0, che aiuta i myoctyes mantengono la loro morfologia a forma di bastoncello fino a 24 ore. </li><li> Laminina (1-2 mg / cm 2) piatti rivestiti o piastre: Trasferire 200 microlitri di 1 mg / ml topo naturale laminina a 20 ml di PBS sterile (w / o calcio e magnesio) e mescolare. Aggiungere 1 ml di piatti da 35 mm, 2,5 ml di piatti da 60 mm, o 5 ml di piatti da 100 mm, agitare per coprire uniformemente le superfici, e il luogo in 2% di CO 2, 37 ° C incubatore fino placcatura miociti. Nota: Se le stoviglie o piastre non vengono utilizzati il giorno rivestito, possono essere sigillati con parafilm e conservati a 4 ° C per una notte (Coating Lento). Tenuta è required per evitare l&#39;evaporazione e la contaminazione. Piastre rivestite possono essere conservati a 4 ° C per 1 settimana. </li></ol> 3. Rimozione del mouse Cuore e Incannulamento <ol><li> Immergere le forbici e pinze nel 70% di etanolo per 30 minuti e lasciare asciugare. </li><li> Pesare il mouse con un&#39;approssimazione di 0,1 grammi. Registrare il suo peso corporeo, ceppo e sesso, e data di nascita. </li><li> Iniettare 200 ml di eparina (100 UI / mouse) ip 10 min prima dell&#39;anestesia per evitare la coagulazione del sangue nelle arterie coronarie. Anestetizzare il mouse con 200 mg / kg di peso corporeo di ketamina e 10 mg / kg di peso corporeo di xylazina per iniezione ip e attendere per 5-10 minuti fino a quando il mouse non risponde a pizzichi coda / punta. </li><li> Fissare il mouse nella posizione supina fissando delicatamente le zampe anteriori e hindpaws per una superficie di lavoro Pinnable (ad esempio polistirolo) su un vassoio chirurgico animale o panca tavolo vicino al sistema di perfusione. </li><li> Pulire il torace e l&#39;addome con il 70% di etanolo. Fai una pelle i linea medianancision da metà addome al diaframma con una forbice chirurgica. </li><li> Tagliare il diaframma con un altro forbice chirurgica e tenere lo sterno con le pinze dentate curve. Tagliare bilaterale e retroflect gabbia toracica per esporre il cuore. </li><li> Sollevare cuore leggermente utilizzando pinza sottile seghettati e atraumatica curvi e sezionare il cuore fuori della cavità toracica più vicino possibile alla parete toracica dorsale. </li><li> Trasferire il cuore ad un piatto da 100 mm contenente tampone perfusione fredda. Rifilare con cura via i tessuti connettivi come i polmoni, timo, e bronchi. </li><li> Identificare l&#39;aorta e le sue diramazioni del cranio, che di solito sono nascosti da timo e cuscinetto adiposo. Tagliare l&#39;aorta sotto del suo primo ramo 13, afferrare la parete aortica, alzare il cuore, e leggermente scivolare al perfusione cannula aortica pieno di liquido (1,0 mm di diametro cannula in acciaio inox con punta smussata / piatta e tacche 1 e 2 mm dal la punta, o un 22 G alimentazione riutilizzabile ago) utilizzando due ultra fine-tip forceps. Nota: a) Il liquido di perfusione deve essere gocciolamenti durante incannulazione cardiaca per evitare bolle di gas di entrare arterie coronarie; b) Mantenere la punta della cannula appena sopra la valvola aortica. </li><li> Bloccare l&#39;aorta alla cannula e legare l&#39;aorta alla cannula con 6-0 seta chirurgica. L&#39;intero incannulamento dovrebbe prendere meno di 120 sec. </li></ol> 4. Cuore di Perfusione e digestione <ol><li> Profumato cuore con tampone di perfusione privo di calcio a portata di 4 ml / min circa 4-5 minuti fino a quando gli effluenti diventano chiari, quindi passare al buffer di digestione contenente 50 mM CaCl 2 e profumato per 3,5-20 min a seconda del ceppo di topi, pressione di perfusione e l&#39;attività collagenasi. Se del caso, aumentare la pressione aorta di 70-80 mmHg durante la digestione. Quando necessario, enzima perfusato può essere ricircolata per la digestione. Tipicamente, 300 tampone U / ml enzima digerire un cuore in 10-12 min ad una velocità di flusso di 4 ml / min;Se applicando pressione post-carico a 70 mmHg, 300 U / ml impiegheranno solo 3.5-5.5 min ad una velocità di flusso di 4 ml / min. </li><li> Fermare la digestione quando il cuore diventa leggermente pallido e flaccido. Dovrebbe essere spugnoso quando pizzicato delicatamente. </li></ol> 5. Celle di dissociazione e Calcio reintroduzione <ol><li> Estrarre l&#39;aorta dalla cannula con il 70% pinza etanolo-bagnato e mettere il cuore in un piatto sterile di 60 mm contenente 2,5 ml di tampone di digestione. Spostatevi nella cappa coltura utilizzando materiali sterili, rimanendo consapevoli delle tecniche sterili per questo e gradini di follow-up. </li><li> Rimuovere aorta, atri, e dei grossi vasi con belle forbici chirurgiche. Stuzzicare delicatamente il ventricolo in 10-12 piccoli pezzi con due pinze fine-tip. </li><li> Pipettare delicatamente i pezzi del cuore e le cellule su e giù ~ 10x con una pipetta di trasferimento da 10 ml e poi trasferire in un tubo di polipropilene conica da 15 ml. Sciacquare il piatto con 7,5 ml di soluzione di calcio che contenga 12,5 mM CaCl 2 e il trasferimentoquesto nel tubo, risultante in un volume finale di 10 ml. </li><li> Pipetta delicatamente la sospensione cellulare su e giù con una pipetta fine-tip per disperdere i grandi pezzi di tessuto cardiaco. </li><li> Centrifugare per 3 minuti a 20 xg per separare piccole cellule non miociti quali cellule endoteliali e fibroblasti. </li><li> Aspirare il surnatante e risospendere il pellet miociti in 10 ml di soluzione di calcio che con un supplemento di 100 ml di ATP 200 mM (pH 7.2, soluzione madre, filtra sterilizzato). Lasciare il tubo nel cappuccio per 3-5 min. </li><li> Trasferimento duplicare 10 microlitri aliquote ad un emocitometro per contare miociti e rotondo a forma di asta. Calcolare il numero totale di miociti e calcolare la percentuale di miociti astiformi. </li><li> Centrifugare i miociti per 3 min a 20 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 10 ml di soluzione di calcio II contenente 100 mM CaCl 2. Disperdere i miociti con il trasferimento pipetta fine-tip pipettandosu e giù. </li><li> Ripetere il passaggio precedente (5.8) utilizzando rispettivamente soluzione di calcio III (400 mM CaCl 2) e IV (900 mM CaCl 2). </li><li> Per il mouse miociti coltura primaria, risospendere il pellet miociti finale in 5 ml di placcatura mezzo. Contare il numero totale di miociti e calcolare la percentuale di miociti astiformi. </li></ol> 6. Cell Culture <ol><li> Regolare la concentrazione dei miociti a forma di bastoncello a 25.000 a forma di bastoncello miociti / ml in una provetta da 50 ml. Pipettare delicatamente i miociti con una pipetta 10 ml di sospendere bene. Evitare di sedimentazione cella nella pipetta e provetta per garantire densità delle cellule uguali per ogni piatto o piatto. </li><li> Dopo aspirando al largo della soluzione di rivestimento laminina, piatto miociti in quei piatti o piatti. Scorrere delicatamente i piatti o piastre in avanti e da tre a quattro volte arretrate e da lato a lato in un modello a croce sulla superficie della cappa coltura. </li><li> Porre le capsule o le piastre in un 2% di CO2 incubatore a 37 ° C. Incubare per 1-3 ore per consentire attaccamento miociti ad una velocità di circa 80%. </li><li> Dopo l&#39;attacco, delicatamente aspirare fuori dal terreno contenente miociti slegati e detriti cellulari. Aggiungere delicatamente terreno di coltura ai lati dei piatti o piastre. Eseguire questo mezzo cambiamento uno per uno. Restituire immediatamente i piatti o piastre per l&#39;incubatore. </li><li> Dopo coltura O / N, i miociti possono essere modificati per lo stesso mezzo, senza BDM prima studi di segnalazione cellulare a breve termine. Tenere il BDM nella cultura lungo termine per le analisi ipertrofiche o apoptosi. Nota: BDM (2,3-butanedione monoxime) possono inibire la miosina-ATPasi e prevenire la contrazione. La sua inibizione della contrazione basata miosina-è facilmente reversibile. È stato riferito che BDM può avere alcuni effetti collaterali, come ad esempio in qualità di fosfatasi non specifico, aumentando il rilascio di calcio da SR, e l&#39;alterazione della concentrazione di calcio libero e cellulare prope elettricaproprietā, quindi prima del trattamento, il BDM deve essere rimosso. Inoltre, in alcuni casi, un inibitore specifico blebbistatin miosina II potrebbe essere un farmaco alternativo per inibire la contrazione dei cardiomiociti 8,9. Tuttavia, nel nostro caso, BDM è meglio che blebbistatin per motivi di qualità e quantità dei cardiomiociti. </li></ol>

<ol>
	<li>Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+cardiomyocyte+isolation,+culture,+and+gene+transfer.">Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer.</a> J. Mol. Cell. 51, 288-298 (2011).</li><li>Gross, D. R., Gross, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Isolated heart preparations, problems, and pitfalls. In: Animal Models in Cardiovascular Research. , 109-130 (2009).</li><li>Schl&#252;ter, K. D., Piper, H. M., Dheim, S., Mohr, F. W., Delmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+ventricular+cardiomyocytes.">Isolation and culture of adult ventricular cardiomyocytes.</a> Practical Methods in Cardiovascular Research. , 557-567 (2005).</li><li>O&#39;Connell, T. D., Ni, Y. G., Lin, K. M., Han, H. P., Yan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+cardiac+myocytes+for+signaling+studies.">Isolation and culture of adult cardiac myocytes for signaling studies.</a> AfCS research reports. 1 (5), 1-9 (2003).</li><li>O&#39;Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpon, P. C., Vivanco, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+mouse+cardiac+myocytes.">Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 35, 271-296 (2007).</li><li>Nilolskaya, A., Sharma, V., Sigg, D. C., Laizzo, P. S., Xiao, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+models+and+methods.">Cell culture models and methods.</a> Cardiac Electrophysiology Methods and Models. , 213-235 (2010).</li><li>Merx, M. W., Schrader, M., Dhein, S., Mohr, F. W., Delmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+working+heart.">The working heart.</a> Practical Methods in Cardiovascular Research. , 173-189 (2005).</li><li>Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+extends+culture+life+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+and+allows+efficient+and+stable+transgene+expression.">Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 294, 1667-1674 (2008).</li><li>Lou, Q., Li, W., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+dynamic+instability+and+wavelength+in+arrhythmia+maintenance+as+revealed+by+panoramic+imaging+with+blebbistatin+vs.+2,3-butanedione+monoxime.">The role of dynamic instability and wavelength in arrhythmia maintenance as revealed by panoramic imaging with blebbistatin vs. 2,3-butanedione monoxime.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 262-269 (2012).</li><li>Liu, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+Na/K-ATPase+potentiates+Marinobufagenin-induced+cardiac+dysfunction+and+myocyte+apoptosis.">Reduction of Na/K-ATPase potentiates Marinobufagenin-induced cardiac dysfunction and myocyte apoptosis.</a> J. Biol. Chem. 287 (20), 16390-16398 (2012).</li><li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+roles+of+the+cardiac+Na+/Ca2+-exchanger+in+ouabain-induced+inotropy,+cell+signaling,+and+hypertrophy.">Different roles of the cardiac Na+/Ca2+-exchanger in ouabain-induced inotropy, cell signaling, and hypertrophy.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 304, 427-435 (2013).</li><li>Liu, L. J., Zhao, X. C., Pierre, S. V., Askari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+PI3K-AKT+signaling+pathway+with+digitalis-induced+hypertrophy+of+cardiac+myocytes.">Association of PI3K-AKT signaling pathway with digitalis-induced hypertrophy of cardiac myocytes.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 293, 1489-1497 (2007).</li><li>Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Cell+Transcriptional+Profiling+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes.">Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes.</a> J. Vis. Exp. (58), (2011).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Per la migliore preparazione, i passaggi più critici sono: 1) prontamente agganciando il cuore del mouse alla cannula dopo l&#39;asportazione; 2) perfusione cardiaca appropriata. Si noti inoltre che la qualità dell&#39;acqua, la temperatura perfusione, pH del tampone, la sterilizzazione, la purezza chimica e pulito, tubi e camere non contaminati sono anche fattori importanti. 18.2 mW biologia molecolare-grade H 2 O è altamente raccomandato per la preparazione del buffer. Il pH della soluzione madre ATP 200 mM deve essere regol...

Cardiomiociti non sono proliferativa. Ci sono alcune linee cellulari cardiomiociti atriali, come HL-1 e cellule AT-1 derivate da tumori atriali topo; Tuttavia, non ci sono ventricolari adulto linee cellulari di cardiomiociti disponibili per la ricerca. Colture cellulari primarie di cardiomiociti adulti topo forniscono un modello potente per la ricerca di cuore a livello cellulare e molecolare. Ad oggi, sono stati ampiamente utilizzati per la biochimiche, fisiologiche e farmacologiche di ricerca 1. Inoltre, l&#39;uso frequente di topi geneticamente modificati ha richiesto metodi efficaci di isolamento dei cardiomiociti. Coltura pura permette condizioni di libero dall&#39;interazione con altri organi e circolazione sistemica, ad esempio attraverso fattori endogeni neurormonali e ormoni 2,3. Tuttavia, il successo isolamento di cardiomiociti può essere impegnativo. Il protocollo introduciamo contenute sono basate sulle nostre esperienze con adulti di ratto cardiomyocytes e il metodo descritto da O&#39;Connell et al 4,5. Soprattutto nel 2007 5, hanno descritto le tecniche dettagliate da preparazioni cuscinetto per coltura cellulare e saggio funzionale. Poiché miociti mouse sono molto sensibili alla contrattura rispetto ai cardiomiociti di ratto, i buffer o supporti utilizzati per la perfusione, digestione, Ca 2 + tolleranza, placcatura e cultura nel protocollo del mouse sono integrate con un inibitore di accoppiamento eccitazione-contrazione non specifico, 2, 3-butanedione monoxime (BDM) per inibire la loro contrazione spontanea, e quindi la redditività e la resa dei miociti a forma di bastoncello migliorare in modo significativo. Nel protocollo introdotto qui, i miociti sono separati in un buffer di potassio dal cuore isolato da modificata perfusione Langendorff con collagenasi di tipo II. Collagenase II rompe efficacemente la matrice intercellulare e cellule rilascia. La soluzione perfusione mantiene anche il metabolismo cellulare a un livello basso 6. In additi, il sistema cuore isolato dalla Harvard Apparatus che abbiamo usato qui è ben progettato per un preciso controllo della temperatura e pressione costante 7. Questo approccio fornisce preparazioni altamente riproducibili e popolazioni omogenee di tipo singola cellula, che può essere utilizzato in coltura durante la notte per misurare proteine ​​di segnalazione o coltura 2-3 settimane per saggi ipertrofiche cardiaci.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="774">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:257px;">Isolated heart system for small rodent</td>
			<td style="width:131px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:99px;">IHSR-mouse 73-4019</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Aortic Cannula, OD 1.0 mm</td>
			<td style="width:131px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:99px;">73-2816</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Dumont #4 Forceps</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">11294-00</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Straight sharp serrated scissors</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">14070-12</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Serrated Graefe forceps</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">11050-10</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Curved, serrated Graefe forceps</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">11052-10</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Straight Mini Serrefines clamps</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">18054-28</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">MEM</td>
			<td style="width:131px;">Gibco</td>
			<td style="width:99px;">11575-032</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Collagenase II</td>
			<td style="width:131px;">Worthington</td>
			<td style="width:99px;">4176</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mucosal universal detergent</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">Z637181</td>
			<td>Mucasol is a fast alkaline residue-free detergent.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy

I progressi tecnologici hanno reso i topi geneticamente modificati, compresi transgenici e topi knockout gene, uno strumento essenziale in molti campi della ricerca. Cardiomiociti adulti sono ampiamente accettati come un buon modello per la fisiologia cellulare cardiaca e fisiopatologia, così come per intervento farmaceutico. Topi geneticamente modificati escludono la necessità di processi di infezione cardiomiociti complicati per generare il genotipo desiderato, che sono inefficienti a causa differenziazione terminale cardiomiociti. Isolamento e la coltura di grande quantità e qualità cardiomiociti funzionali drammaticamente a beneficio ricerca cardiovascolare e fornire un importante strumento di segnalazione cellulare di ricerca trasduzione e lo sviluppo di farmaci. Qui, descriviamo un metodo consolidato per l&#39;isolamento di cardiomiociti adulti mouse che possono essere implementati con poca formazione. Il cuore del mouse viene asportato e cannulata per un sistema cuore isolato, poi perfusi con un p privo di calcio e altaotassium tampone seguito dal tipo II collagenasi digestione in Langendorff modalità di perfusione retrograda. Questo protocollo produce un risultato coerente per la raccolta dei cardiomiociti funzionali topo adulto da una varietà di topi geneticamente modificati.

1. Quantificazione Isolamento di successo Due sono i criteri utilizzati per quantificare il successo dell&#39;isolamento: in primo luogo, il numero totale di cardiomiociti isolati, e secondo, il rapporto calcio-tolerant per arrotondare miociti non tolleranti a forma di asta. Generalmente questo protocollo richiede intorno 75-90 minuti dalla rimozione di cuore a placcatura miociti e le rese circa 1 milione di cardiomiociti a forma di bastoncello (70-90% dei miociti totali raccolti) da un cuore d...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy at JoVE.com

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Descriviamo un metodo affidabile per l&#39;isolamento di cardiomiociti di topo adulto. Questo protocollo produce un risultato coerente per la cultura di cardiomiociti adulti funzionali da una varietà di topi geneticamente modificati.

Isolamento e Cultura del topo adulto Cardiomyocytes per Cell Signaling e<em&gt; In vitro</em&gt; Cardiaca Ipertrofia

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

isolation-culture-adult-mouse-cardiomyocytes-for-cell-signaling-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

47.3K Views.  University of Toledo College of Medicine and Life Sciences.  Descriviamo un metodo affidabile per l'isolamento di cardiomiociti di topo adulto. Questo protocollo produce un risultato coerente per la cultura di cardiomiociti adulti funzionali da una varietà di topi geneticamente modificati. 

Video: Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and a working heart on the other. Thus, cardiomyocytes serve as good models for cardiac cellular physiology and pathophysiology, for pharmaceutical investigations as well as for the exploration of transgenic animal models. Here we describe a method of isolating the cells from the heart. Furthermore we show how a genetic manipulation on cardiac myocytes can be performed without breeding a transgenic animal: This is the combination of long term culture (1 week) and adenoviral gene transfer. The latter one is described from the construction of the virus to the transduction of the cells. It can be used for the expression of genetically encoded biosensors (GEBs), fluorescent fusion proteins, but also for protein over expression and down regulation, e.g. using RNAi. Here we provide an example for the expression of a fusion protein staining a subcellular structure (Golgi). Such protein expression can be visualized by confocal imaging of z-stacks for a 3D-reconstruction of subcellular structures. The protocol comprises state-of-the-art in cell culture, molecular biology and biophysics and thus provides an approach for exploring new horizons in cellular cardiology.

Adult cardiac myocytes are primary cells that can be isolated from animal hearts and cultured for several days. Within this culture period adenoviral gene transfer can be used to express genetically encoded biosensors (GEBs) or fluorescent fusion proteins. Both approaches allow cellular investigations by means of confocal microscopy.

L&#39;isolamento e la manipolazione genetica di adulti miociti cardiaci per confocale Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Ricerca

Biologia

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation between cells within a tissue. Isolation of pure cardiomyocyte populations through a collagenase perfusion of mouse hearts facilitates the generation of single cell microarrays for whole transcriptome gene expression, or qPCR of specific targets using nanofluidic arrays. We describe here a procedure to examine single cell gene expression profiles of cardiomyocytes isolated from the heart. This paradigm allows for the evaluation of metrics of interest which are not reliant on the mean (for example variance between cells within a tissue) which is not possible when using conventional whole tissue workflows for the evaluation of gene expression (Figure 1). We have achieved robust amplification of the single cell transcriptome yielding micrograms of double stranded cDNA that facilitates the use of microarrays on individual cells. In the procedure we describe the use of NimbleGen arrays which were selected for their ease of use and ability to customize their design. Alternatively, a reverse transcriptase - specific target amplification (RT-STA) reaction, allows for qPCR of hundreds of targets by nanofluidic PCR. Using either of these approaches, it is possible to examine the variability of expression between cells, as well as examining expression profiles of rare cell types from within a tissue. Overall, the single cell gene expression approach allows for the generation of data that can potentially identify idiosyncratic expression profiles that are typically averaged out when examining expression of millions of cells from typical homogenates generated from whole tissues.

Single cell expression profiling allows the detailed gene expression analysis of individual cells. We describe methods for the isolation of cardiomyocytes, and preparing the resulting lysates for either whole transcriptome microarray or qPCR of specific targets.

Cella singola Profiling trascrizionale dei cardiomiociti adulti mouse

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

Isolamento e la coltura di miofibre individuali e delle loro cellule satelliti da adulto muscolo scheletrico

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

Isolamento e Cultura della neonatali mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

Isolamento, Cultura e caratterizzazione funzionale di topo adulto Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force used to pump blood. Individual cardiomyocytes were first isolated over 40 years ago in order to better study the physiology and structure of heart muscle. Techniques have rapidly improved to include enzymatic digestion via coronary perfusion. More recently, analyzing the contractility and calcium flux of isolated myocytes has provided a vital tool in the cellular and sub-cellular analysis of heart failure. Echocardiography and EKGs provide information about the heart at an organ level only. Cardiomyocyte cell culture systems exist, but cells lack physiologically essential structures such as organized sarcomeres and t-tubules required for myocyte function within the heart. In the protocol presented here, cardiomyocytes are isolated via Langendorff perfusion. The heart is removed from the mouse, mounted via the aorta to a cannula, perfused with digestion enzymes, and cells are introduced to increasing calcium concentrations. Edge and sarcomere detection software is used to analyze contractility, and a calcium binding fluorescent dye is used to visualize calcium transients of electrically paced cardiomyocytes; increasing understanding of the role cellular changes play in heart dysfunction. Traditionally used to test drug effects on cardiomyocytes, we employ this system to compare myocytes from WT mice and mice with a mutation that causes dilated cardiomyopathy. This protocol is unique in its comparison of live cells from mice with known heart function and known genetics. Many experimental conditions are reliably compared, including genetic or environmental manipulation, infection, drug treatment, and more. Beyond physiologic data, isolated cardiomyocytes are easily fixed and stained for cytoskeletal elements. Isolating cardiomyocytes via perfusion is an extremely versatile method, useful in studying cellular changes that accompany or lead to heart failure in a variety of experimental conditions.

Individual cardiomyocytes from wild type and mutant mice can be isolated from the heart in order to study their contractility and calcium transients. This allows characterization of the contribution of cellular dysfunction to heart dysfunction from any cause.

Isolamento e fisiologica Analisi di mouse Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Isolamento e Cultura della Dental epiteliali cellule staminali del topo adulto Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and accessibility of in vitro culture enables fine control over biochemical analyses, live imaging, and electrophysiology. Long-term culture of cardiomyocytes offers access to additional experimental approaches that cannot be completed in short term cultures. For example, the in vitro investigation of dedifferentiation, cell cycle re-entry, and cell division has thus far largely been restricted to rat cardiomyocytes, which appear to be more robust in long-term culture. However, the availability of a rich toolset of transgenic mouse lines and well-developed disease models make mouse systems attractive for cardiac research. Although several reports exist of adult mouse cardiomyocyte isolation, few studies demonstrate their long-term culture. Presented here, is a step-by-step method for the isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes. First, retrograde Langendorff perfusion is used to efficiently digest the heart with proteases, followed by gravity sedimentation purification. After a period of dedifferentiation following isolation, the cells gradually attach to the culture and can be cultured for weeks. Adenovirus cell lysate is used to efficiently transduce the isolated cardiomyocytes. These methods provide a simple, yet powerful model system to study cardiac biology.

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

Isolamento, cultura e trasduzione di topo adulto cardiomiociti

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

Isolamento e cultura dei cheratinociti primari del mouse dalla pelle dei neonati e adulti

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation of Mouse Epidermal Keratinocytes and Their In Vitro Clonogenic Culture

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately 30 x 106 viable cells per mouse. Primary adult mouse keratinocytes are harvested from the dorsal skin of female mice. Male mice (~6 weeks old) can be used for keratinocyte harvesting depending on the requirements of the experiment. Euthanized mice are shaved and sterilized with serial washes in povidone iodine and ethanol solutions (70% alcohol). After disinfecting the mice, the dorsal skin is removed and the subcutaneous fat and muscle are removed with a scalpel and discarded. The skins are cut into small pieces and treated with a mild, low temperature trypsinization to detach the lower dermis from the epidermis. The scraped epidermises are stirred at low speed, filtered to remove the hairs, counted, and re-suspended in culture medium. This method provides an excellent single cell suspension of highly culturable cells for many downstream applications.

The goal of this protocol is to isolate epidermal keratinocytes from the dorsal skin of adult mice for a variety of downstream applications such as molecular biology, biochemistry, fluorescence activated cell sorting, and primary in vitro uses (e.g., clonogenic keratinocytes).

Isolamento dei Keratinociti Epidermimi del topo e della loro cultura clonogenica in vitro

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately ...