Il lavoro è stato sostenuto da NIH concede AI57159 (a SCH) e AI72346 (a AMvO). SCH è un Howard Hughes Medical Institute.

Vetro di copertura funzionalizzazione slittamento Il doppio strato planare utilizzata nel test di fusione è supportato da un film idrati di destrano. Destrano funge da distanziatore tra il doppio strato planare e superficie di vetro. Questo impedisce che i componenti della membrana di diventare bloccato sulla superficie del vetro e fornisce anche lo spazio in cui il contenuto di una particella virale può sfuggire alla fusione. Coprioggetto di vetro sono funzionalizzati con il trattamento con una resina epossidica silano, che ci permette di legame chimico destrano al vetro (Elender, et al. 1996). <ol><li> Disporre 25 coprioggetto mm in un rack per colorazione ceramica, e posto il rack in un vaso o bicchiere. </li><li> Riempire il contenitore con una soluzione al 10% di detersivo da laboratorio vetreria. Mettere il recipiente in un bagno ad ultrasuoni per 30 minuti. </li><li> Sciacquare il contenitore e rack coprioggetto con acqua deionizzata, e riempire con idrossido postassium 1M. Restituire il contenitore per il bagno sonicatore per altri 30 minuti. </li><li> Ripetere questa procedura di pulizia con acetone ed etanolo. </li><li> Sciacquare il coverlips in acqua e asciugare. </li><li> Infine, pulire il coprioggetto con una spogliarellista di ossigeno nel plasma per tre minuti. </li><li> La fase di pulizia ultima ossida la superficie, rendendo il vetro in modo uniforme idrofila e reattiva nelle fasi silanizzazione seguenti. </li><li> Preparare una soluzione allo 0,2% di 3-glycidoxypropyltrimethoxy silano in isopropanolo. Immergere i coprioggetti in questa soluzione per cinque minuti. </li><li> Scartare la soluzione silano e risciacquare i tempi coprioggetto diverse in isopropanolo. </li><li> I coprioggetti ora sono rivestiti con uno strato di silano, ma devono essere curate per consentire al silano a legarsi covalentemente al vetro. Posizionare il coprioggetto in forno a 80 gradi Celsius per un&#39;ora. </li><li> Mentre i coprioggetti sono stagionatura, pesare destrano 500 e preparare un 30% w / v soluzione. Preriscaldamento l&#39;acqua facilitare la soluzione. Useremo circa 1 ml di questa soluzione per coprioggetto. Una volta che il destrano è sciolta, antischiuma la soluzione in un essiccatore a vuoto. </li><li> Quando i coprioggetti silanizzata hanno finito la cura, rimuoverli dal rack ceramica e disporle sul piatto all&#39;interno di una scatola di plastica congelatore. Usare una pipetta da 1 ml per coprire la superficie superiore di ogni coprioggetto con ~ 1 ml di soluzione di destrano. Chiudere la finestra di freezer e lasciare in un luogo tranquillo per 24-36 ore. </li><li> Mentre cogliere il coprioggetto con una pinza di plastica, versare l&#39;eccesso destrano e sostituirli nel rack ceramica. Risciacquare più volte il coprioggetto diverse in acqua, e lasciare i coprioggetti in ammollo in acqua per 48 ore. Il vaso può essere agitato delicatamente su un tavolo dei rotatori. </li><li> Asciugare il coprioggetto in forno a 80 gradi Celsius e conservare in un essiccatore a vuoto. </li></ol> Preparazione liposomi Doppi strati lipidici supportati sono formate da adsorbente liposomi per un coprioggetto destrano funzionalizzato. Il fusibile adsorbito liposomi con vicenda fino a rottura della membrana piatta e si diffonde sulla superficie. <ol><li> Una formulazione tipica liposomi utilizzati nel test è composto da 1,2, dioleoyl-sn-glicero-3-phosphocholine (DOPC), 1-oleoyl-2-palmitoil-sn-glicero-3-phosphocholine (POPC), colesterolo, cervello bovino Disialoganglioside (GD 1a), e N-((6 - (biotinoyl) ammino) Hexanoyl) -1,2-dihexadecanoyl-sn-glicero-3-phosphoethanolamine in un rapporto di 4:4:2:0.1:5 x10 -5. Tutti i componenti sono memorizzati in cloroformio o cloroformio e soluzioni di metanolo. </li><li> Preparare una miscela contenente due micromoli di lipidi con il trasferimento di volumi di ogni componente in una provetta di vetro. Far evaporare il solvente sotto un flusso di gas argon o azoto. Togliere il solvente rimanente lasciando la provetta in un essiccatore a vuoto per due ore. </li><li> Risospendere il film secca lipidica in 400 microlitri di buffer di HNE (5 HEPES mM, 145 mM NaCl, 0,1 mM EDTA). </li><li> Trasferire la sospensione in una provetta di plastica. Congelare la sospensione in un bagno di azoto liquido e scongelare in un bagno di acqua calda. Ripetere questa operazione al gelo / disgelo quattro volte. </li><li> Assemblare un estrusore lipidico 100 nm con una membrana in policarbonato, e estrudere la sospensione lipidica 25 volte. La sospensione deve apparire più trasparente dopo l&#39;estrusione. </li><li> Liposomi dovrebbe essere utilizzato il giorno di preparazione. Possono essere conservati a temperatura ambiente fino al momento dell&#39;uso. </li></ol> Microfluidic flusso preparazione cellulare Una cellula semplice flusso microfluidica è costituito da sandwich nastro doppio bastone tra una diapositiva quarzo e un copri funzionalizzato. <ol><li> Ottenere un 20x20x3 scivolo quarzo mm. Utilizzare una fresa diamantata a praticare due fori di 1 mm su lati opposti. </li><li> Tagliare un quadrato di 20 mm da uno strato di nastro doppio bastone, e con una lama di rasoio, tagliare una sezione di 2 x 15 mm dal centro. </li><li> Staccare un lato del supporto a nastro, e di aderire il nastro al quarto di gallone britannicoz diapositive. Rispettare l&#39;altro lato per un copri funzionalizzate. </li><li> Tagliate due lunghezze di 20 cm di tubo di polietilene e inserirli nei fori nella diapositiva quarzo. </li><li> Sigillare la cella di flusso con la colla epossidica 5 minuti. </li><li> Quando la colla è indurita, adescare la cella di flusso e il tubo con tampone. </li><li> Un doppio strato lipidico supportati possono essere formate in questa fase di disegno circa 80 microlitri della sospensione liposomi nei canali. </li></ol> Virus particelle etichettatura <ol><li> H3N2 influenza A (X-31) è in genere utilizzato per l&#39;analisi di fusione, ma altri ceppi influenzali e altri virus sono stati utilizzati con successo. </li><li> Virus è etichettato con un massimo di due diversi coloranti fluorescenti per consentire il rilevamento di hemifusion e poro-formazione. </li><li> Sciogliere solforodamina b (SRB) in tampone HNE per ottenere una soluzione 20 mM. Combina 20 microlitri della soluzione colorante con 10 microlitri della sospensione virale, e lasciare a temperatura ambiente per 20 ore. Durante questo periodo, colorante lentamente si accumulano all&#39;interno le particelle del virus. </li><li> Rimuovere il colorante in eccesso passando il virus attraverso la sospensione di una colonna PD-10 dissalazione. Se un numero sufficiente di materiale virale viene utilizzata, una banda colorata si può vedere nella colonna. Questa band contiene virus etichettati e possono essere raccolte in quanto è eluiti. </li><li> Se nessuna banda è visibile, raccogliere 200 microlitri frazioni e determinare quali frazioni contenenti virus etichettati misurando l&#39;assorbimento 565 nm in uno spettrofotometro. Il virus dovrebbe eluire in un volume totale di circa 0,8 ml. </li><li> Etichetta l&#39;involucro virale con l&#39;aggiunta di 13 microlitri di una formammide 2 mM dimetil (DMF), soluzione di ottadecile rodamina 110 (Rh110C18) per l&#39;etichetta sospensione virus SRB. </li><li> Mescolare la sospensione collegando il tubo di un rotatore di laboratorio e lasciare per 3 ore. </li><li> Purificare il virus da eccesso Rh110C18 con un PD-10 colonna dissalazione come descritto in precedenza. </li></ol> Microscopio configurazione L&#39;esperimento è eseguito su un microscopio a fluorescenza dotato di un obiettivo ad immersione olio NA adatto per un totale di microscopia a fluorescenza di riflessione interna. Le linee 488 e 568 nm da un argon / krypton gas laser sono utilizzati per eccitare il virus Rh110C18 e SRB etichettati. Elaborazione simultanea delle immagini di ogni etichetta si ottiene dividendo l&#39;emissione di fluorescenza verde e rosso con uno specchio dicroico e di messa a fuoco le immagini in modo indipendente su due metà separate di un elettrone telecamera CCD moltiplicando. Esecuzione del saggio L&#39;esecuzione del test fusione comporta una assemblea graduale dei componenti biochimici all&#39;interno della cella di flusso: montaggio del doppio strato lipidico planare, attracco di particelle virali etichettati, rivestimento della superficie con fluoresceina, e l&#39;avvio della reazione con tampone pH basso (Figura 1A) . <ol><li> Montare il flusso di cellule sul palco microscopio, e collegare il tubo di uscita ad una pompa siringa impostata portata ad una velocità di 40 microlitri al minuto. </li><li> Cancella i canali di flusso dei liposomi in eccesso che scorre in 300 microlitri di HNE. </li><li> Messa a fuoco il microscopio e regolare la potenza del laser per illuminare la superficie con 350 W / cm 2 di 488 nm e luce 70 W / cm 2 di 568 nm di luce. Se si utilizza un obiettivo 60x NA 1,45 immersione in olio, impostare le intensità laser a 100 Watt e 20 Watt micro micro, rispettivamente. </li><li> Pompa virus etichettati (diluito 1 / 100) in una cella di flusso. Poiché il virus si diffonde sulla superficie inferiore del canale di flusso, le particelle cominceranno a aderire alla gangliosidi incorporati nel doppio strato lipidico. </li><li> Quando una densità adeguata di particelle virali ancorata è stato raggiunto (fino a circa 1000 particelle per campo visivo). Accendere il tubo di aspirazione ad una soluzione contenente due microgrammi per millilitro streptavidina marcate con fluoresceina. La streptavidina etichettati legherà alla biotina molecole di lipidi nel doppio strato accoppiato, e alla fine uno sfondo verde debole sarà visibile. </li><li> Lavare il canale di flusso con 300 microlitri di HNE. </li><li> Scegliere un&#39;area di imaging, messa a fuoco del microscopio e preparare la camera CCD per tempo trascorso acquisizione di immagini. Impostare il tempo di esposizione di 100 ms e raccogliere i fotogrammi a una velocità di 10 Hz. </li><li> Avviare fusione per scorrere in un buffer acido contenente 10 mM citrato di sodio e 140 mM NaCl. Il pH del tampone deve essere regolato al di sotto del pH critico del virus viene testato. X-31 fusibili a pH al di sotto di 5.5. </li></ol> Rappresentante Risultati Figura 1B mostra le istantanee del doppio strato virioni ancorata prima e durante la fusione. Ogni spot diffrazione limitata rappresenta una singola particella di virus. Fluorescenza rossa e verde sono stati separatamente sul fotografato la metà superiore e inferiore di una camera CCD, permettendo l&#39;osservazione simultanea della busta virale e le etichette dei contenuti. Ci sono in genere luoghi doppio nel canale verde rispetto alil rosso, e questo riflette la minore efficienza di etichettatura da parte del colorante contenuto rispetto all&#39;etichetta busta. La fluorescenza di fondo verde emessa dalla superficie legato fluoresceina scompare all&#39;arrivo del buffer citrato e permette di determinare l&#39;orario di inizio della reazione di fusione. Hemifusion eventi vengono rilevati come esplosioni di fluorescenza verde come il Rh110C18 spento nel diffonde virale attraverso il gambo hemifusion ed è diluito nella membrana planare. Una nuvola di espansione verso l&#39;esterno fluorescenti può essere visto in giro particelle hemifused, dimostrando la libera diffusione dei grassi-acil colorante legato nella membrana planare. Formazione di pori si osserva come il decadimento della fluorescenza rossa da SRB intrappolati dentro l&#39;interno delle particelle virali. L&#39;apertura di un poro di fusione permette la tintura di fuggire nello spazio acqueo sottostante il doppio strato planare e fuori della regione di osservazione. Traiettorie intensità di fluorescenza per ogni particella, tracciati dalla intensità integrata delle singole particelle, di facilitare la determinazione del rendimento e dei tempi di hemifusion e formazione di pori (Fig. 1C). Orari degli eventi Hemifusion e la formazione dei pori sono determinati come il punto in cui la pendenza massima di una raffica Rh110C18 fluorescenza o di decadimento del segnale SRB si verifica. In un esperimento di successo, circa il 50 per cento delle particelle etichettate con segnali di resa Rh110C18 dequenching, e il 30 per cento delle particelle SRB etichettato dare segnale utilizzabile. Delle particelle etichettate con entrambe le tinture, circa il 10 per cento mostrano sia la miscelazione e la formazione dei pori segnali lipidici. Fig. 2A-C mostra la distribuzione dei pori hemifusion e tempi di latenza formazione di un tipico esperimento. Fig.2D-F mostra distribuzioni caso di eventi combinati da cinque esperimenti effettuati nelle stesse condizioni. Anche con un modesto numero di osservazioni, la forma degli istogrammi è evidente. Poiché ogni esperimento è sincronizzato con il rilevamento del tempo caduta del pH, gli esperimenti multipli possono essere combinati e informazioni dettagliate sulla limitazione della velocità passi intermedi possono essere ottenuti. <img src="/files/ftp_upload/1484/1484fig1a.jpg" border="0" alt="figura 1" /> <img src="/files/ftp_upload/1484/1484fig1b.jpg" border="0" alt="figura 1" /> Figura 1. Disegno sperimentale. A) Le particelle virali vengono etichettati con due coloranti fluorescenti per il monitoraggio della cinetica di hemifusion e la formazione dei pori di fusione. Fluorescenza viene raccolto da un alto-NA obiettivo microscopio e ripreso su un CCD. B) le immagini a fluorescenza prima (a sinistra) e durante (a destra) la fusione delle singole particelle virali. Metà superiore e inferiore di ogni immagine corrisponde alla fluorescenza rossa e verde, rispettivamente, della stessa area ~ 50 x 100 mm 2 del doppio strato supportati. C) L&#39;intensità della fluorescenza del tracciante contenuto SRB rosso virale (traccia superiore), il verde Rh110C18 membrana colorante (al centro tracce), e il sensore del pH fluoresceina (traccia inferiore) forniscono orari esatti trascorsi tra calo del pH, hemifusion, e la fusione. Si prega di <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1484/1484fig1.jpg">cliccare qui</a> per vedere una versione più grande della figura 1. <img border="0" src="/files/ftp_upload/1484/1484fig2tmb.jpg" alt="figura 2" /> Figura 2. Cinetica fusione del virus fluorescente. Distribuzioni del tempo trascorso tra la caduta del pH e hemifusion (A, D) e formazione di pori (B, E). L&#39;ascesa e la decadenza delle distribuzioni indicano la presenza di molteplici passaggi intermedi. La transizione tra hemifusion e l&#39;apertura di un poro di fusione per singole particelle è distribuito esponenzialmente, suggerendo un unico fattore limitante. Pannelli AC mostrano i risultati di un singolo esperimento. DF pannelli sono compilati da cinque esperimenti separati eseguiti alle stesse condizioni. Si prega di <a href="/files/ftp_upload/1484/1484fig2.jpg1484">cliccare qui</a> per vedere una versione più grande della figura 2.

<ol>
	<li>Elender, G., Kuhner, M., Sackmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalisation+of+Si/SiO2+and+glass+surfaces+with+ultrathin+dextran+films+and+deposition+of+lipid+bilayers.">Functionalisation of Si/SiO2 and glass surfaces with ultrathin dextran films and deposition of lipid bilayers.</a> Biosens Bioelectron. 11, 565-577 (1996).</li><li>Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+kinetics+of+influenza+virus+membrane+fusion.">Single-particle kinetics of influenza virus membrane fusion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15382-15387 (2008).</li></ol>

Preparazione di liquido e continuo doppi strati lipidici supportati può essere impegnativo. Tracce di contaminanti difetti di materiale o superficie impediscono la diffusione di doppi strati. Pulizia accurata e la deposizione di uno strato uniforme di destrano sono essenziali. L&#39;imaging prolungata di particelle di virus può candeggina le etichette fluorescenti o farli diventare inattivato. Foto-danni di questo tipo è ben noto nella bio-imaging e campi di singola molecola ed è general...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Corning cover glass squares, 25 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>CLS286525</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fused silica slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Technical Glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Staining rack</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thomas Scientific</td>
<td>8542E40</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>(3- glycidoxypropyl)trimethoxysilane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gelest</td>
<td>SIG5840.1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dextran T-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pharmacosmos</td>
<td>5510 0500 4006</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti</td>
<td>850375</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-palmitoyl-2oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti</td>
<td>850457</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cholesterol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti</td>
<td>700000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N-((6-(biotinoyl)amino)hexanoyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt (biotin-X DHPE)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>B1616</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptavidin, fluorescein conjugate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>S-869</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Disialoganglioside GD1a from bovine brain</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G2392</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mini Extruder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti</td>
<td>610000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.1 micron polycarbonate membrane filters</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>800309</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 mm drain discs (membrane supports)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>230300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sulforhodamine b sodium salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>S1402</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Octadecyl rhodamine 110 (Rh110C18)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>See Floyd et al. 2008 for synthesis protocol</td>
</tr>
<tr>
<td>PD-10 desalting columns</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-0851-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nikon fluorescence microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>TE2000-U</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plan Apo TIRF 60x 1.45 NA objective</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Innova 70C Spectrum Ar/Kr laser</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Coherent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Syringe Pump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>702213</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

method for measurement of viral fusion kinetics at the single particle level

Fusione della membrana è un passo essenziale durante l&#39;immissione di virus con involucro in cellule. Saggi di fusione convenzionale tipicamente rapporto su un gran numero di eventi di fusione, il che rende difficile analizzare quantitativamente la sequenza delle fasi molecolari coinvolti. Abbiamo sviluppato un in vitro, a due colori saggio a fluorescenza per monitorare la cinetica di fusione singole particelle virali con un doppio strato obiettivo su un supporto essenzialmente fluido. L&#39;influenza delle particelle virali sono incubati con un fluoroforo verde lipofile di macchiare la membrana e un fluoroforo rosso idrofilo per colorare l&#39;interno virale. Abbiamo un deposito gangliosidi contenenti doppio strato lipidico sul destrano-functionilized superficie di vetro di una cella a flusso, incubare le particelle virali nel doppio strato planare e l&#39;immagine della fluorescenza di un x 100 100 micron 2 Superficie, contenente diverse centinaia di particelle, su un CCD fotocamera. Per immagini sia la fluorescenza rossa e verde, siamo in grado di monitorare contemporaneamente il comportamento del colorante membrana (verde) e il contenuto acquoso (rosso) delle particelle. Su abbassando il pH ad un valore al di sotto del pH fusione, le particelle si fondono con la membrana. Hemifusion, la fusione dei foglietto esterno della membrana virale con il foglietto esterno della membrana bersaglio, sarà visibile come un cambiamento improvviso della fluorescenza verde di una particella. Al momento della fusione dei due successivi volantini rimasti distale un poro sarà formata e il rosso che emettono fluoroforo nella particella virale sarà rilasciato sotto la membrana di destinazione. Questo evento darà luogo ad una diminuzione della fluorescenza rossa delle singole particelle. Infine, la fluorescenza integrato da un pH-sensibile fluoroforo che è incorporato nella membrana di destinazione indica il momento esatto della caduta di pH. Dai tre fluorescenza in tempo le tracce, tutti gli eventi importanti (calo del pH, lipidi miscelazione su hemifusion, i contenuti di miscelazione sulla formazione dei pori) possono ora essere estratte in modo diretto e per ogni particella singolarmente. Raccogliendo i tempi trascorsi per le transizioni diverse per molte singole particelle in istogrammi, possiamo determinare la durata degli intermedi corrispondenti. Anche intermedi nascosti che non hanno un diretto osservabile fluorescenti possono essere visualizzati direttamente da questi istogrammi.

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Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Vi presentiamo uno<em&gt; In vitro,</em&gt; Bicolore saggio fluorescenza per visualizzare la fusione di particelle virali singolo con un doppio strato obiettivo fluido. Mediante l&#39;etichettatura particelle virali con fluorofori che macchia in modo differenziato la membrana virale e il suo interno, siamo in grado di monitorare la cinetica di hemifusion e formazione di pori.

Metodo per la misurazione di Cinetica fusione virale a livello di singola particella

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

method-for-measurement-viral-fusion-kinetics-at-single-particle

Research

JoVE Journal

Biology

12.8K Views.  Harvard Medical School. Vi presentiamo uno In vitro, Bicolore saggio fluorescenza per visualizzare la fusione di particelle virali singolo con un doppio strato obiettivo fluido. Mediante l'etichettatura particelle virali con fluorofori che macchia in modo differenziato la membrana virale e il suo interno, siamo in grado di monitorare la cinetica di hemifusion e formazione di pori.

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Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large macromolecular complexes. Compared to X-ray crystallography, it has some unique advantages. First, single particle EM reconstruction does not need to crystallize the protein sample, which is the bottleneck in X-ray crystallography, especially for large macromolecular complexes. Secondly, it does not need large amounts of protein samples. Compared with milligrams of proteins necessary for crystallization, single particle EM reconstruction only needs several micro-liters of protein solution at nano-molar concentrations, using the negative staining EM method. However, despite a few macromolecular assemblies with high symmetry, single particle EM is limited at relatively low resolution (lower than 1 nm resolution) for many specimens especially those without symmetry. This technique is also limited by the size of the molecules under study, i.e. 100 kDa for negatively stained specimens and 300 kDa for frozen-hydrated specimens in general.
For a new sample of unknown structure, we generally use a heavy metal solution to embed the molecules by negative staining. The specimen is then examined in a transmission electron microscope to take two-dimensional (2D) micrographs of the molecules. Ideally, the protein molecules have a homogeneous 3D structure but exhibit different orientations in the micrographs. These micrographs are digitized and processed in computers as "single particles". Using two-dimensional alignment and classification techniques, homogenous molecules in the same views are clustered into classes. Their averages enhance the signal of the molecule's 2D shapes. After we assign the particles with the proper relative orientation (Euler angles), we will be able to reconstruct the 2D particle images into a 3D virtual volume.
In single particle 3D reconstruction, an essential step is to correctly assign the proper orientation of each single particle. There are several methods to assign the view for each particle, including the angular reconstitution1 and random conical tilt (RCT) method2. In this protocol, we describe our practice in getting the 3D reconstruction of yeast exosome complex using negative staining EM and RCT. It should be noted that our protocol of electron microscopy and image processing follows the basic principle of RCT but is not the only way to perform the method. We first describe how to embed the protein sample into a layer of Uranyl-Formate with a thickness comparable to the protein size, using a holey carbon grid covered with a layer of continuous thin carbon film. Then the specimen is inserted into a transmission electron microscope to collect untilted (0-degree) and tilted (55-degree) pairs of micrographs that will be used later for processing and obtaining an initial 3D model of the yeast exosome. To this end, we perform RCT and then refine the initial 3D model by using the projection matching refinement method3.

This article describes a standard method to get a three-dimensional (3D) reconstruction of biological macromolecules using negative staining electron microscopy (EM). In this protocol, we explain how to get the 3D structure of the Saccharomyces cerevisiae exosome complex at medium resolution using the random conical tilt reconstruction method (RCT).

Singola particella Microscopia Elettronica ricostruzione del complesso Exosome Utilizzo del metodo casuale Tilt conico

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large ...

Ricerca

Biologia

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in vivo is of importance. Pol II kinetics have been measured using biochemical or molecular methods.1-3 In recent years, with the development of new visualization methods, it has become possible to follow transcription as it occurs in real time in single living cells.4 Herein we describe how to perform analysis of Pol II elongation kinetics on a specific gene in living cells.5, 6 Using a cell line in which a specific gene locus (DNA), its mRNA product, and the final protein product can be fluorescently labeled and visualized in vivo, it is possible to detect the actual transcription of mRNAs on the gene of interest.7, 8 The mRNA is fluorescently tagged using the MS2 system for tagging mRNAs in vivo, where the 3'UTR of the mRNA transcripts contain 24 MS2 stem-loop repeats, which provide highly specific binding sites for the YFP-MS2 coat protein that labels the mRNA as it is transcribed.9 To monitor the kinetics of transcription we use the Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) method. By photobleaching the YFP-MS2-tagged nascent transcripts at the site of transcription and then following the recovery of this signal over time, we obtain the synthesis rate of the newly made mRNAs.5 In other words, YFP-MS2 fluorescence recovery reflects the generation of new MS2 stem-loops in the nascent transcripts and their binding by fluorescent free YFP-MS2 molecules entering from the surrounding nucleoplasm. The FRAP recovery curves are then analyzed using mathematical mechanistic models formalized by a series of differential equations, in order to retrieve the kinetic time parameters of transcription.

RNA polymerase II transcriptional kinetics are measured on specific genes in living cells. mRNAs transcribed from the gene of interest are fluorescently tagged and using Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) the in vivo kinetics of transcriptional elongation are obtained.

Misurazione della Cinetica di Trascrizione mRNA nelle cellule viventi singolo

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Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies during chromosome separation are a hallmark of malignancy and associated with progressive disease 2-4. The spindle assembly checkpoint (SAC) is a mitotic surveillance mechanism that holds back cells at metaphase until every single chromosome has established a stable bipolar attachment to the mitotic spindle1. The SAC exerts its function by interference with the activating APC/C subunit Cdc20 to block proteolysis of securin and cyclin B and thus chromosome separation and mitotic exit. Improper attachment of chromosomes prevents silencing of SAC signaling and causes continued inhibition of APC/CCdc20 until the problem is solved to avoid chromosome missegregation, aneuploidy and malignant growths1.
Most studies that addressed the influence of improper chromosomal attachment on APC/C-dependent proteolysis took advantage of spindle disruption using depolymerizing or microtubule-stabilizing drugs to interfere with chromosomal attachment to microtubules. Since interference with microtubule kinetics can affect the transport and localization of critical regulators, these procedures bear a risk of inducing artificial effects 5.
To study how the SAC interferes with APC/C-dependent proteolysis of cyclin B during mitosis in unperturbed cell populations, we established a histone H2-GFP-based system which allowed the simultaneous monitoring of metaphase alignment of mitotic chromosomes and proteolysis of cyclin B 6.
To depict proteolytic profiles, we generated a chimeric cyclin B reporter molecule with a C-terminal SNAP moiety 6 (Figure 1). In a self-labeling reaction, the SNAP-moiety is able to form covalent bonds with alkylguanine-carriers (SNAP substrate) 7,8 (Figure 1). SNAP substrate molecules are readily available and carry a broad spectrum of different fluorochromes. Chimeric cyclin B-SNAP molecules become labeled upon addition of the membrane-permeable SNAP substrate to the growth medium 7 (Figure 1). Following the labeling reaction, the cyclin B-SNAP fluorescence intensity drops in a pulse-chase reaction-like manner and fluorescence intensities reflect levels of cyclin B degradation 6 (Figure 1). Our system facilitates the monitoring of mitotic APC/C-dependent proteolysis in large numbers of cells (or several cell populations) in parallel. Thereby, the system may be a valuable tool to identify agents/small molecules that are able to interfere with proteolytic activity at the metaphase to anaphase transition. Moreover, as synthesis of cyclin B during mitosis has recently been suggested as an important mechanism in fostering a mitotic block in mice and humans by keeping cyclin B expression levels stable 9,10, this system enabled us to analyze cyclin B proteolysis as one element of a balanced equilibrium 6.

Metaphase to anaphase transition is triggered through anaphase-promoting complex (APC/C)-dependent ubiquitination and subsequent destruction of cyclin B. Here, we established a system which, following pulse-chase labeling, allows monitoring cyclin B proteolysis in entire cell populations and facilitates the detection of interference by the mitotic checkpoint.

Studiare proteolisi della ciclina B a livello di singola cellula in popolazioni di cellule intere

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analisi globale di RNA Sintesi a livello di singola cellula seguente ipossia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are inactive due to 5' truncations, ~80-100 of these elements remain retrotransposition competent and propagate to different locations throughout the genome via RNA intermediates. While older L1s are believed to target AT rich regions of the genome, the chromosomal targets of newer, more active L1s remain poorly defined. Here we describe fluorescence in situ hybridization (FISH) methodology that can be used to track patterns of L1 insertion and rates of ectopic L1 incorporation at the single nucleus level. In these experiments, fluorescein isothiocyanate/cyanine-3 (FITC/CY3) labeled neomycin probes were employed to track L1 retrotransposition in vitro in HepG2 cells stably expressing ectopic L1. This methodology prevents errors in the estimation of rates of retrotransposition posed by toxicity and account for the occurrence of multiple insertions into a single nucleus.

Here we employ FISH methodology to track LINE-1 retrotransposition at the single nuclei level in chromosome spreads of HepG2 cell lines stably expressing synthetic LINE-1.

Analisi di LINE-1 retrotrasposizione al Nucleo livello singolo

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

Analisi singola particella open-source per Super-risoluzione Microscopia con VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological approach to analyzing protein kinetics at DNA lesions over time or protein-protein interactions on locally microirradiated chromatin. We also show how to recognize individual phases of the cell cycle using the Fucci cellular system to study cell-cycle-dependent protein kinetics at DNA lesions. A methodological description of the use of two UV lasers (355 nm and 405 nm) to induce different types of DNA damage is also presented. Only the cells microirradiated by the 405-nm diode laser proceeded through mitosis normally and were devoid of cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs). We also show how microirradiated cells can be fixed at a given time point to perform immunodetection of the endogenous proteins of interest. For the DNA repair studies, we additionally describe the use of biophysical methods including FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) and FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) in cells with spontaneously occurring DNA damage foci. We also show an application of FLIM-FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) in experimental studies of protein-protein interactions.

Laser microirradiation is a useful tool for studies of DNA repair in living cells. A methodological approach for the use of UVA lasers to induce various DNA lesions is shown. We have optimized a method for local microirradiation that maintains the normal cell cycle; thus, irradiated cells proceed through mitosis.

Avanzate tecniche di microscopia confocale per studiare le interazioni proteina-proteina e cinetica alle lesioni del DNA

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, implantation of transgenic cells and tiny optical sensors. However, intravenous microinjections into small animals, which are mostly used in biological and veterinary laboratories, are very difficult and require trained personnel. Herein, we demonstrate a robust and efficient method for the introduction of microparticles into the circulatory system of adult zebrafish (Danio rerio) by injection into the fish kidney. To visualize the introduced microparticles in the vasculature, we propose a simple intravital imaging technique in fish gills. In vivo monitoring of the zebrafish blood pH was accomplished using an injected microencapsulated fluorescent probe, SNARF-1, to demonstrate one of the possible applications of the described technique. This article provides a detailed description of the encapsulation of pH-sensitive dye and demonstrates the principles of the quick injection and visualization of the obtained microcapsules for in vivo recording of the fluorescent signal. The proposed method of injection is characterized by a low mortality rate (0-20%) and high efficiency (70-90% success), and it is easy to institute using commonly available equipment. All described procedures can be performed on other small fish species, such as guppies and medaka.

This article demonstrates the principles of a quick, minimally invasive injection of fluorescent microparticles into the circulatory system of small fishes and the in vivo visualization of the microparticles in fish blood.

Amministrazione semplice ed efficace e la visualizzazione di microparticelle nell'apparato circolatorio di piccoli pesci mediante l'inserimento di rene

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified &#955; DNA at the Single Molecule Level

The fluorescence microscopy&#160;has made great contributions in dissecting the mechanisms of complex biological processes at the single molecule level. In single molecule assays for studying DNA-protein interactions, there are two important factors for consideration: the DNA substrate with enough length for easy observation and labeling a protein with a suitable fluorescent probe. 48.5 kb &#955; DNA is a good candidate for the DNA substrate. Quantum dots (Qdots), as a class of fluorescent probes, allow long-time observation (minutes to hours) and high-quality image acquisition. In this paper, we present a protocol to study DNA-protein interactions at the single-molecule level, which includes preparing a site-specifically modified &#955; DNA and labeling a target protein with streptavidin-coated Qdots. For a proof of concept, we choose ORC (origin recognition complex) in budding yeast as a protein of interest and visualize its interaction with an ARS (autonomously replicating sequence) using TIRFM. Compared with other fluorescent probes, Qdots have obvious advantages in single molecule studies due to its high stability against photobleaching, but it should be noted that this property limits its application in quantitative assays.

Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified &amp;#955; DNA at the Single Molecule Level

Here, we present a protocol to study DNA-protein interactions by total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) using a site-specifically modified &#955; DNA substrate and a Quantum-dot labeled protein.

Visualizzare l'interazione tra la proteina Qdot-labeled e DNA λ site-specifically modificate a livello di singola molecola

The fluorescence microscopy&#160;has made great contributions in dissecting the mechanisms of complex biological processes at the single molecule level. ...

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell motility, or cell signaling. The green algae Chlamydomonas reinhardtii has proven to be an insightful model in the study of centriole architecture, function, and protein composition. Despite great advances toward understanding centriolar architecture, one of the current challenges is to determine the precise localization of centriolar components within structural regions of the centriole in order to better understand their role in centriole biogenesis. A major limitation lies in the resolution of fluorescence microscopy, which complicates the interpretation of protein localization in this organelle with dimensions close to the diffraction limit. To tackle this question, we are providing a method to purify and image a large number of C. reinhardtii centrioles with different orientations using super-resolution microscopy. This technique allows further processing of data through fluorescent single-particle averaging (Fluo-SPA) owing to the large number of centrioles acquired. Fluo-SPA generates averages of stained C. reinhardtii centrioles in different orientations, thus facilitating the localization of distinct proteins in centriolar sub-regions. Importantly, this method can be applied to image centrioles from other species or other large macromolecular assemblies.

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

We have developed a strategy to purify and image a large number of centrioles in different orientations amenable for super-resolution microscopy and single-particle averaging.

Isolamento e formazione immagine di fluorescenza per la ricostruzione di singola particella di Chlamydomonas centrioli

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell ...