La ricerca è stata sostenuta dal Premio H. Wallace Coulter carriera Fondazione All&#39;inizio della Ricerca Traslazionale. Grazie a Tim Andrews, Pediatric Hematology / Oncology, per aiutare con la raccolta del sangue del campione. Anche grazie al dottor Sam Wellhausen, Citometria a flusso core, James Graham Brown Cancer Center, per aiutare con l&#39;esecuzione di campioni citometria a flusso.

Parte 1. Dispositivo di fabbricazione Microfluidic Uno stampo in silicone maestro del dispositivo lisi microfluidi è stato creato utilizzando le normali tecniche di fotolitografia con l&#39;attrezzatura presso l&#39;Università di Louisville camera bianca [1]. AutoCAD (Autodesk, Inc., San Rafael, CA) è stato utilizzato per generare una maschera di trasparenza (Fineline Imaging, Colorado Springs, CO) per creare repliche negative dei canali. Il dispositivo lisi microfluidica è stato realizzato dal maestro stampo in silicone morbido utilizzando tecniche litografiche con l&#39;elastomero poliestere (dimetilsiloxano) (PDMS; Dow Corning, Midland, MI). L&#39;elastomero con i canali replicati è stato rilasciato, e fori di accesso al canale sono stati forati con una 20-gauge (parti piccole, Miramar, Florida.). Il wafer PDMS è stata irreversibilmente legato ad un vetrino via plasma di ossigeno e testati per la sperimentazione. Parte 2. Protocollo per l&#39;esecuzione di dispositivo di lisi Dopo che il dispositivo a microfluidi è stato fabbricato e collaudato, esperimenti con la lisi degli eritrociti sono pronti per iniziare. I dettagli sezione che segue il protocollo per il dispositivo a microfluidi. 2,1 Raccolta dei campioni <ol><li> Raccogliere 4 millilitri di campione di sangue dalla vena cubitale mediana, sulla vena dell&#39;avambraccio anteriore del paziente con eparina come anticoagulante in due 2 ml vaccutainers verde in alto. </li><li> Scartare primi 2 ml tubo in quanto contiene staccato cellule mature endoteliali (falsi positivi). </li><li> Risospendere il secondo tubo di mescolare il sangue con eparina girando su e giù; salvare immediatamente in ghiaccio. </li><li> Trasferire 1 ml di sangue in una provetta da 1,5 ml Eppendorf. Processo il campione di sangue immediatamente (entro un&#39;ora dalla raccolta). </li></ol> 2,2 Primo dispositivo microfluidica con PBS <ol><li> Ottenere un dispositivo a microfluidi incollato al vetro. Press-fit tubi di accesso (parti piccole, Miramar, FL) di diametro leggermente superiore nelle insenature e di uscita (Figura 1). </li><li> Fissare un 30-gauge siringa (parti piccole, Miramar, FL) per il tubo su ciascuna delle insenature, fornendo la macro per l&#39;interfaccia micro. </li><li> Riempire una siringa da 1 ml con PBS 1X e assicurarsi di sbarazzarsi di bolle sfogliando l&#39;ago della siringa. Collegare il PBS-caricato siringa da 1 ml di ingresso 1 sul dispositivo a microfluidi. Spingere la siringa contenente il PBS 1X delicatamente a mano fino a quando la soluzione fuoriesce di ingresso 2, e poi subito a morsetto di ingresso 2 con una clip standard Raccoglitore di Office </li><li> Continuare a spingere il PBS 1X finché il liquido raggiunge la porta di uscita del dispositivo microfluidica. Una volta che la soluzione esce la presa, bloccare il tubo di uscita con un altro clip legante. </li><li> Continuare a spingere la siringa da 1 ml fino a quando la PBS 1X flussi di ingresso 3, e bloccare l&#39;ingresso di 3 porte con un altro clip legante ufficio. Il dispositivo microfluidica è ora pienamente innescato. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Schema del dispositivo che indica ingressi per rispettive soluzioni e di uscita. 2.3 Preparazione di pompe siringa e soluzione <ol><li> Per calibrare le pompe attenersi alla seguente procedura: <ol class="lalpha"><li> Per la grande pompa a siringa di Harvard (Harvard, PHD Parte 22/2000 # 702000): impostare la configurazione del diametro di 22,5 mm, portata 600 microlitri / min. </li><li> Per la piccola pompa siringa di Harvard (Harvard, Pico Plus. Parte # 702213): impostare la configurazione del diametro di 4,61 millimetri, portata 20 l / min. </li></ol></li><li> Riempire una siringa da 30 ml con acqua deionizzata sterile. Questo può essere effettuato prelevando la soluzione direttamente dal tubetto da 50 ml. (Etichetta la siringa) </li><li> Riempire una seconda siringa da 30 ml con 2X tampone fosfato-salina (PBS), il 2% paraformaldeide (PFA) utilizzando la procedura descritta al punto 9. (Etichetta la siringa) </li><li> Riempire una siringa da 1 ml con PBS 1X dalle aliquote memorizzati nel provette da 15 ml coniche, utilizzando la procedura descritta al punto 9. </li><li> Collegare la siringa da 30 ml di acqua deionizzata a ingresso 2 e il 2X siringa da 30 ml di PBS per ingresso 3 (assicuratevi di indossare t trappola bolle nel tubo o dispositivo microfluidica). Rimuovere la fascetta da insenature 2 e 3 e il tubo di uscita. Collegare il PBS 1X siringa da 1 ml in entrata 1. Evitare di introdurre bolle compilando l&#39;ago della siringa con un liquido, che collega la siringa, e sfogliando l&#39;ago della siringa per eliminare le bolle. </li></ol> 2,4 lisi degli eritrociti <ol><li> Impostare tutte le siringhe sulle pompe di Harvard proprio come indicato di seguito: <ol class="lalpha"><li> Impostare le due siringhe 30 ml (quella che contiene sterile, acqua deionizzata e l&#39;altro con 2X PBS, 2% PFA) insieme sul grande pompa a siringa Harvard. </li><li> Impostare la siringa da 1 ml (contenente 1X PBS) sulla piccola pompa a siringa Harvard. </li><li> Posizionare il tubo di uscita in un raccoglitore (50 ml tubo conico che viene etichettato wAste). </li></ol></li><li> Accendere la grande pompa a siringa Harvard (con i 30 ml siringhe) e farlo funzionare per un minuto. (Assicurarsi che non ci siano bolle e le perdite nel dispositivo o nel tubo). </li><li> Accendere la piccola pompa a siringa Harvard e farlo funzionare per un altro minuto. (Assicurarsi che non ci siano bolle e le perdite nel dispositivo o nel tubo). Fermare le pompe. Il dispositivo microfluidica è ora pronto per essere utilizzato. </li><li> Rimuovere la siringa da 1 ml contenente PBS 1X dalla piccola pompa a siringa Harvard. </li><li> Dopo aver ottenuto un campione di sangue, riempire la siringa da 1 ml con 0,05 ml di soluzione sterile di PBS 1X senza intrappolare eventuali bolle. Successivamente, riempire la siringa con 0,5 ml di sangue ottenuto dalla provetta Eppendorf. (La siringa da 1 ml ora contengono un volume di 0,55 ml di sangue e tampone PBS 1X.) Nota: Conservare la siringa verticale durante il riempimento per evitare la miscelazione del 0,05 ml PBS con il sangue. </li><li> Collegare la siringa contenente il sangue di ingresso 1 e montare la siringa con attenzione (evitare di spingere il sangue attraverso il tubo nel dispositivo) sulla piccola pompa a siringa Harvard (la siringa è montato in verticale nella pompa). </li><li> Rimuovere il tubo di uscita dal tubo di scarico e mettere un tubo pulito centrifuga da 50 ml al suo posto e metterlo su un secchio di ghiaccio. </li><li> Accendere la grande pompa a siringa Harvard prima e farlo funzionare per 1 minuto. Iniziare a raccogliere il campione dalla presa di corrente nel tubo da centrifuga da 50 ml. </li><li> Accendere la piccola pompa a siringa Harvard. </li><li> Una volta che il campione di sangue nella siringa da 1 ml ha completamente viaggiato attraverso il dispositivo, stop entrambe le pompe. Questo dovrebbe durare circa 20 minuti. </li><li> Centrifugare il campione raccolto per 5 minuti a 350 xg a temperatura ambiente con l&#39;off freno. </li><li> Rimuovere il surnatante ponendo punta della pipetta sul lato opposto del pellet bianco. Rimuovere la maggior quantità possibile di surnatante, detriti cellulari in particolare quello rosso, senza disturbare il pellet bianco. </li><li> Risospendere il campione in 1 ml di buffer di flusso (1X PBS, 1% BSA [albumina di siero bovino], 2% PFA) pipettando su e giù. Versare il campione in una provetta Eppendorf da 1,5 ml. </li><li> Microcentrifuga prelevato il campione per 5 minuti a 4 xg a temperatura ambiente. Usa precisione come prima di rimuovere il surnatante. </li><li> Risospendere il campione in 1 ml di buffer di flusso con il vortex. </li></ol> 2.5 La preparazione per l&#39;analisi di citometria a flusso <ol><li> Per l&#39;analisi del campione in citometria a flusso, aggiungere 100 ml di campione in una provetta citometria a flusso. </li><li> Per la 100 microlitri di campione si aggiungano anticorpi specificato (garantire la concentrazione corretta). </li><li> Lasciare campione ad incubare per 30 minuti a 40 ° C. </li><li> Lavare due volte con tampone di flusso prima di citometria a flusso. Fase di lavaggio comprende l&#39;aggiunta di 250 microlitri di buffer di flusso, vortex, centrifugazione per 5 minuti a 350 xg, e rimuovere il surnatante con un giro fluido di tubo di citometria a flusso. </li><li> Risospendere il pellet in 250 ml di buffer di flusso. Campione è pronto per l&#39;analisi in citometria a flusso. </li></ol> Rappresentante Risultati Di sangue intero è stato eseguito attraverso il dispositivo lisi microfluidica e post-elaborazione del protocollo, liberarsi di eritrociti e arricchire circolanti cellule nucleate (CNC). Risultati ideali darà un pulito citometria a flusso scatter plot con separata popolazioni CNC. Visualizzati sotto nelle figure 2 e 3 sono i confronti dispersione trama di un campione di sangue intero senza lisi degli eritrociti e con la lisi degli eritrociti dal protocollo di microfluidica con assi come scatter in avanti (FSC) rispetto side scatter (SSC) della luce. Si può notare che il protocollo di arricchimento microfluidica è necessario per ottenere un ambiente pulito citometria a flusso scatter plot. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Citometria a flusso scatter plot del campione di sangue intero, senza la lisi degli eritrociti con FSC e SSC assi. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Citometria a flusso scatter plot di cellule nucleate circolanti con microfluidica lisi degli eritrociti etichettati da popolazioni con FSC e SSC assi. Regione 1 (rossa) rappresenta linfociti, Regione 2 (verde) rappresenta monociti, Regione 3 (blu) rappresenta granulociti e Regione 4 (viola) non è ancora stata caratterizzata. Rimozione dei detriti globuli rossi con pipetta nel protocollo è importante anche quando è necessario. Di seguito nella Figura 4 è un grafico a dispersione che mostra un surplus di detriti cellulari rosso. Anche se non opacità del grafico a dispersione come nella figura 2, si deve spiegare gli eventi aggiunti a causa di detriti degli eritrociti durante l&#39;analisi dei dati. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Citometria a flusso scatter plot raffiguranti frammenti di globuli rossi, visto come un clusterdegli eventi nella Regione 5 (ciano). La colorazione delle cellule per alcuni marcatori fenotipo anticorpi anche generare risultati caratteristici. Nelle figure che seguono sono le macchie di anticorpi fenotipo per 3 distinte popolazioni leucocitarie: linfociti, monociti e granulociti. Figura 5 mostra popolazioni di linfociti tracciati con assi CD3 e CD4. Monociti e granulociti sono illustrati nelle figure 6-7 con assi come FSC contro CD14 e CD66b, rispettivamente. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Citometria a flusso scatter plot raffigurante linfociti con CD3 e CD4 assi. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. Citometria a flusso scatter plot raffigurante monociti con FSC e CD14 assi. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig7.jpg" alt="Figura 7" /> Figura 7. Citometria a flusso scatter plot raffigurante granulociti con FSC e assi CD66b.

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	<li>White, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+application+of+microfluidic+leukocyte+enrichment+protocol+in+mild+phenotype+sickle+cell+disease+(SCD.">Clinical application of microfluidic leukocyte enrichment protocol in mild phenotype sickle cell disease (SCD.</a> Biomedical Microdevices. 11 (2), 477-483 (2009).</li><li>Sethu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+Flow+Microfluidic+Device+for+Rapid+Erythrocyte+Lysis.">Continuous Flow Microfluidic Device for Rapid Erythrocyte Lysis.</a> Anal. Chem. 76 (21), 6247-6253 (2004).</li></ol>

Un sistema automatizzato microfluidici protocollo di lisi del sangue è stata riportata. All&#39;interno del protocollo sono passaggi critici degni di nota. Nella sezione P.2.1, è importante per scartare il flaconcino prima sangue raccolto, come il campione contiene sloggiato cellule mature endoteliali in qualità di falsi positivi. Inoltre, assicurarsi di eseguire il campione di sangue entro un&#39;ora dalla raccolta. Priming il dispositivo a microfluidi nella sezione P.2.2, è importante per liberare inizialmente del...

automated microfluidic blood lysis protocol for enrichment of circulating nucleated cells

In tale relazione il protocollo per un dispositivo automatico microfluidi lisi del sangue è dettagliata. Circolanti cellule nucleate (CNC), tra leucociti e cellule endoteliali, offrono una piattaforma ideale per lo stato aggiornato sullo stato immunitario di un individuo. Il protocollo consente di microfluidica per l&#39;arricchimento di CNC, senza perdita di cellule selettive e preparazione variabilità del campione a causa di user-mediata passi. In breve, il protocollo prevede fabbricazione del dispositivo, la raccolta dei campioni, l&#39;installazione del dispositivo e l&#39;esecuzione del sangue attraverso la camera di microfluidica. All&#39;interno del dispositivo di sangue intero si sta rapidamente miscelato con acqua deionizzata per circa 10 secondi in un micron 50 x 150 micron canale microfluidica. In questo arco di tempo eritrociti vengono lisati a causa delle condizioni ipotoniche. Strutture a spina di pesce sul fondo del canale garantire completa miscelazione e l&#39;esposizione delle cellule ad un ambiente costante. Cellule rimanenti vengono restituiti alle condizioni isotonica all&#39;uscita del dispositivo, fisso con 2% paraformaldeide, centrifugato per separare i detriti degli eritrociti dal CNC, e sospese in tampone di flusso per la colorazione e analisi mediante citometria a flusso. I risultati mostrano trame citometria a flusso pulito dispersione con popolazioni CNC salvato. Significato di questo dispositivo e il protocollo entra nello studio e nella comprensione della patogenesi della malattia attraverso l&#39;analisi delle popolazioni CNC. Quindi, l&#39;automazione, l&#39;efficacia e la semplicità del protocollo microfluidica sono dimostrati.

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Automated Microfluidic Blood Lysis Protocol for Enrichment of Circulating Nucleated Cells

Un dispositivo automatico microfluidi è stato sviluppato per la circolazione di arricchimento delle cellule nucleate del sangue periferico attraverso la lisi degli eritrociti che garantisce l&#39;isolamento del campione di alta qualità senza perdita di cellule.

Automatizzato Microfluidic Lysis protocollo di sangue per l&#39;arricchimento di cellule nucleate circolanti

In this report the protocol for an automated microfluidic blood lysis device is detailed. Circulating nucleated cells (CNCs), including leukocytes and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.3K Views.  University of Louisville. Un dispositivo automatico microfluidi è stato sviluppato per la circolazione di arricchimento delle cellule nucleate del sangue periferico attraverso la lisi degli eritrociti che garantisce l'isolamento del campione di alta qualità senza perdita di cellule.

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Enrichment of NK Cells from Human Blood with the RosetteSep Kit from StemCell Technologies

Natural killer (NK) cells are large granular cytotoxic lymphocytes that belong to the innate immune system and play major roles in fighting against cancer and infections, but are also implicated in the early stages of pregnancy and transplant rejection. These cells are present in peripheral blood, from which they can be isolated. Cells can be isolated using either positive or negative selection. For positive selection we use antibodies directed to a surface marker present only on the cells of interest whereas for negative selection we use cocktails of antibodies targeted to surface markers present on all cells but the cells of interest. This latter technique presents the advantage of leaving the cells of interest free of antibodies, thereby reducing the risk of unwanted cell activation or differenciation. In this video-protocol we demonstrate how to separate NK cells from human blood by negative selection, using the RosetteSep kit from StemCell technologies. The procedure involves obtaining human peripheral blood (under an institutional review board-approved protocol to protect the human subjects) and mixing it with a cocktail of antibodies that will bind to markers absent on NK cells, but present on all other mononuclear cells present in peripheral blood (e.g., T lymphocytes, monocytes...). The antibodies present in the cocktail are conjugated to antibodies directed to glycophorin A on erythrocytes. All unwanted cells and red blood cells will therefore be trapped in complexes. The mix of blood and antibody cocktail is then diluted, overlayed on a Histopaque gradient, and centrifuged. NK cells (&gt;80% pure) can be collected at the interface between the Histopaque and the diluted plasma. Similar cocktails are available for enrichment of other cell populations, such as human T lymphocytes.

Natural killer cells are a small population of lymphocytes. Here we show how to isolate these cells from human blood by negative selection, using a kit from StemCell Technologies. The cells obtained are viable and untouched by antibodies, and therefore ready to be used for a number of procedures.

Arricchimento di cellule NK dal sangue umano con il kit RosetteSep Technologies StemCell

Natural killer (NK) cells are large granular cytotoxic lymphocytes that belong to the innate immune system and play major roles in fighting against cancer ...

Ricerca

Biologia

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has been proposed that the microenvironment that the pathogen encounters in the commensal layer is important in determining the extent of colonization. Current culture methods for investigating pathogen colonization are not well suited for investigating this hypothesis as they do not enable co-culture of bacteria and epithelial cells in a manner that mimics the GI tract microenvironment. Here we describe a microfluidic co-culture model that enables independent culture of eukaryotic cells and bacteria, and testing the effect of the commensal microenvironment on pathogen colonization. The co-culture model is demonstrated by developing a commensal Escherichia coli biofilm among HeLa cells, followed by introduction of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) into the commensal island, in a sequence that mimics the sequence of events in GI tract infection.

This protocol describes a microfluidic co-culture model for simultaneous and localized culture of epithelial cells and bacteria. This model can be used for investigating the role of different soluble molecular signals on pathogenesis as well as screen the effectiveness of putative probiotic bacterial strains.

Microfluidica Co-coltura di cellule epiteliali e batteri per le indagini solubile del segnale mediato da Interazioni

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Isolamento e la coltura di cellule endoteliali polmonari da topi neonati

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of centromere-kinetochore proteins during the cell cycle remains a fundamental tool in investigating the mechanism(s) of these proteins. Advanced imaging methods in fluorescence microscopy provide remarkable resolution of centromere-kinetochore components and allow direct observation of specific molecular components of the centromeres and kinetochores. In addition, methods of indirect immunofluorescent (IIF) staining using specific antibodies are crucial to these observations. However, despite numerous reports about IIF protocols, few discussed in detail problems of specific centromere-kinetochore proteins.1-4 Here we report optimized protocols to stain endogenous centromere-kinetochore proteins in human cells by using paraformaldehyde fixation and IIF staining. Furthermore, we report protocols to detect Flag-tagged exogenous CENP-A proteins in human cells subjected to acetone or methanol fixation. These methods are useful in detecting and quantifying endogenous centromere-kinetochore proteins and Flag-tagged CENP-A proteins, including those in human cells.

Here we report protocols to detect endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins in human cells and quantify these protein levels at centromeres-kinetochores by indirect immunofluorescent staining through the use of fixation (paraformaldehyde, acetone, or methanol fixation).

Le proteine ​​immunofluorescenza di endogeni ed esogeni Centromere-cinetocoro

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.

This article presents a protocol optimized for the production of microfluidic chips and the setup of microfluidic experiments to measure the lifespan and cellular phenotypes of single yeast cells.

Uso di dispositivi microfluidici misurare la durata della vita e cellulare fenotipi in singole cellule di lievito in erba

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Un&#39;interfaccia utente grafica per il monitoraggio assistito della concentrazione di proteine ​​in protrusioni cellulari dinamiche

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison techniques resulted in contradictory conclusions regarding the relevance of animal models for translational research. A major reason for the discrepancies between different gene expression analyses is the arbitrary filtering of differentially expressed genes. Furthermore, the comparison of single genes between different species and platforms often is limited by technical variance, leading to misinterpretation of the con/discordance between data from human and animal models. Thus, standardized approaches for systematic data analysis are needed. To overcome subjective gene filtering and ineffective gene-to-gene comparisons, we recently demonstrated that gene set enrichment analysis (GSEA) has the potential to avoid these problems. Therefore, we developed a standardized protocol for the use of GSEA to distinguish between appropriate and inappropriate animal models for translational research. This protocol is not suitable to predict how to design new model systems a-priori, as it requires existing experimental omics data. However, the protocol describes how to interpret existing data in a standardized manner in order to select the most suitable animal model, thus avoiding unnecessary animal experiments and misleading translational studies.

We provide a standardized protocol for the use of gene set enrichment analysis of transcriptomic data to identify an ideal mouse model for translational research. 
This protocol can be used with DNA microarray and RNA sequencing data and can further be extended to other omics data if data are available.

Un protocollo per l'utilizzo di Gene imposta analisi di arricchimento per identificare il modello animale adeguato per la ricerca traslazionale

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper (cTfh) Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Aberrant T-follicular helper (Tfh) cell activity is detectable in autoimmune conditions and their presence is associated with clinical outcomes when the lymph node microenvironment in B-cell non-Hodgkin&#39;s lymphoma is analyzed. Subsets of circulating T-follicular helper cells (cTfh), the circulating memory compartment of Tfh cells in the blood, are also perturbed in disease and therefore represent potential novel predictive biomarkers. Peripheral blood-based testing is advantageous because it is relatively non-invasive and allows simple serial monitoring.This article describes a method for isolating CD4+ T-cells from human blood, and further analysis by flow-cytometry to enumerate cTfh cells and the proportions of their various subsets (cTfhPD-1-/+/hi, cTfh1,2,17 and cTfh1/17). The level of these subsets was then compared between normal subjects and patients with lymphoma. We found that the method was robust enough to obtain reliable results from routinely collected patient material. The technique we describe for the analysis can be easily adapted to cell sorting and downstream applications such as RT-PCR.

Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper cTfh Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Here, a protocol for the isolation and characterization of CD4+ T-cell subsets from human peripheral blood is described. Purified CD4+ T-cells are analyzed by flow cytometry to determine proportions of T-follicular helper cell subsets.

Isolamento di CD4+ T-cellule e analisi della circolazione follicolare T Helper (cTfh) sottoinsiemi di cellule da sangue periferico mediante citometria a flusso di 6 colori

Aberrant T-follicular helper (Tfh) cell activity is detectable in autoimmune conditions and their presence is associated with clinical outcomes when the ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, epithelial progenitor cells can self-renew and generate differentiating progeny that exhibit cellular functions similar to those of their in vivo counterparts. Herein we describe a step-by-step protocol to isolate region-specific progenitors from human lung and generate 3D organoid cultures as an experimental and validation tool. We define proximal and distal regions of the lung with the goal of isolating region-specific progenitor cells. We utilized a combination of enzymatic and mechanical dissociation to isolate total cells from the lung and trachea. Specific progenitor cells were then fractionated from the proximal or distal origin cells using fluorescence associated cell sorting (FACS) based on cell type-specific surface markers, such as NGFR&#160;for sorting basal cells and HTII-280 for sorting alveolar type II cells. Isolated basal or alveolar type II progenitors were used to generate 3D organoid cultures. Both distal and proximal progenitors formed organoids with a colony forming efficiency of 9-13% in distal region and 7-10% in proximal region when plated 5000 cell/well on day 30. Distal organoids maintained HTII-280+ alveolar type II cells in culture whereas proximal organoids differentiated into ciliated and secretory cells by day 30. These 3D organoid cultures can be used as an experimental tool for studying the cell biology of lung epithelium and epithelial mesenchymal interactions, as well as for the development and validation of therapeutic strategies targeting epithelial dysfunction in a disease.

This article provides a detailed methodology for tissue dissociation and cellular fractionation approaches allowing enrichment of viable epithelial cells from proximal and distal regions of the human lung. Herein these approaches are applied for the functional analysis of lung epithelial progenitor cells through the use of 3D organoids culture models.

Isolamento e arricchimento di cellule progenitrici epiteliali polmonari umane per la coltura di organoidi

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...

Quantification of Circulating Pig-Specific DNA in the Blood of a Xenotransplantation Model

Xenotransplantation is a feasible method to treat organ failure. However, how to effectively monitor the immune rejection of xenotransplantation is a problem for physicians and researchers. This manuscript describes a simple and effective method to monitor immune rejection in pig-to-mouse cell transplantation models and pig-to-monkey artery patch transplantation models. Circulating DNA is a potentially non-invasive biomarker for organ damage. In this study, circulating pig-specific DNA (cpsDNA) was monitored during xenograft rejection by quantitative real-time PCR (qPCR). In this protocol, porcine specific primers were designed, plasmids-containing porcine specific DNA fragments were constructed, and standard curves for quantitation were established. Species-specific primers were then used to quantify cpsDNA by qPCR in pig-to-mouse cell transplantation models and pig-to-monkey artery patch transplantation models. The value of this method suggests that it can be used as a simple, convenient, low cost, and less invasive method to monitor the immune rejection of xenotransplantation.

In this protocol, porcine specific primers were designed, plasmids-containing porcine specific DNA fragments were constructed, and standard curves for quantitation were established. Using species-specific primers, cpsDNA was quantified by qPCR in pig-to-mouse cell transplantation models and pig-to-monkey artery patch transplantation models.

Quantificazione del DNA circolante specifico del maiale nel sangue di un modello di xenotrapianto

Xenotransplantation is a feasible method to treat organ failure. However, how to effectively monitor the immune rejection of xenotransplantation is a ...