Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalla National Science Foundation (cbet 0846453).

1. Fabbricazione di maestri silicio utilizzando le normali SU-8 fotolitografia 1 (non mostrato in questo video). <ol><li> Uso standard SU-8 metodi di fotolitografia per creare un SU-8 &quot;master&quot; (SU-8 2025, MicroChem, Newton, MA) per la realizzazione dello stampo PDMS che contiene la rete microfluidica e la camera di chemiotassi. Stampi maestro tale può essere fabbricato in qualunque impianto di microfabbricazione (ad esempio, Stanford Microfluidica Fonderia; <a href="http://thebigone.stanford.edu/foundry/">http://thebigone.stanford.edu/foundry/</a> ). </li><li> Prima della replica PDMS, esporre il SU-8 master fluorosilane vapore in un essiccatore collegato ad una fonte di vuoto per facilitare il rilascio facile PDMS dal master. Aggiungere una goccia di fluorosilane ad un tovagliolo di carta e si applicano a vuoto per un min. Rimuovere il vuoto e attendere 30 minuti per la deposizione di fluorosilane. Tenere il SU-8 master in un contenitore chiuso per un uso futuro. </li></ol> 2. Stampaggio replica del PDMS da SU-8 master: Lo strato di fluidi e il livello di controllo sono realizzati per stampaggio replica del PDMS da SU-8 master. <ol><li> Miscelare il PDMS pre-polimero e cross-linker ad un peso 10:1. rapporto e Degas in essiccatore per 1 ora (o fino a quando le bolle d&#39;aria vengono rimossi dalla miscela PDMS). </li><li> Posizionare il SU-8 master in una capsula di Petri e con attenzione versare il composto PDMS sulla parte superiore del SU-8 master per lo spessore desiderato. </li><li> Riscaldare la capsula di Petri contenente il PDMS e il SU-8 stampo maestro a 80 ° C per due ore per curare il PDMS. </li><li> Rimuovere il curato PDMS coperto SU-8 master dalla piastra e la buccia di stampo PDMS dal SU-8 master. La struttura desiderata verrà incorporato nello stampo PDMS. </li><li> Fori pugno nello stampo PDMS per tubi al generatore di gradiente e di ingresso delle cellule utilizzando un calibro 20 smussato-end ago. </li></ol> 3. Incollaggio di dispositivi PDMS: <ol><li> Pulire un vetrino da microscopio in vetro con isopropanolo e asciugare con azoto o un flusso d&#39;aria. </li><li> Esporre il PDMS e vetrino di plasma di ossigeno in un plasma asher. </li><li> Portare lo stampo PDMS a contatto con il vetrino. Calore la diapositiva contattato e PDMS stampo a 65 ° C per 15 min. </li></ol> 4. Montaggio del dispositivo PDMS <ol><li> Utilizzando una lama di rasoio, taglio tubi ad un angolo di 45 ° la lunghezza corretta necessaria per il dispositivo. </li><li> Inserire un&#39;estremità del tubo nel fori nel dispositivo (ad esempio, outlet) con pinze. </li><li> Uso di pinze, inserire un brusco da 30 gauge in l&#39;altra estremità del tubo. </li><li> Ripetere il punto 4.2 per tutte le lacune ancora esistenti. </li><li> Raccogliere 1 ml di buffer di chemiotassi (CB) in una siringa da 3 ml, avendo cura di eliminare le bolle d&#39;aria dalla siringa. </li><li> Fissare un hub ago per una estremità del tubo di uscita. </li><li> Aggiungi CB al mozzo ago, e toccare il mozzo ago per rimuovere eventuali bolle d&#39;aria. </li><li> Spingere un po &#39;fuori CB della punta della siringa e collegare la siringa 3 ml al mozzo dell&#39;ago senza intrappolare l&#39;aria. </li><li> Spingere CB attraverso il dispositivo fino a quando tutti gli hub ago rimanenti sono pieni di CB. Questo dovrebbe rimuovere la maggior parte delle bolle d&#39;aria. </li><li> Riempire due siringhe 500μL con CB contenente le concentrazioni adeguate di chemoeffector in fase di test. Eliminare la formazione di bolle d&#39;aria, spingendo fuori una piccola goccia dei contenuti siringa e toccare la goccia di liquido nel mozzo ago e fissaggio. </li><li> Allo stesso modo, collegare una siringa contenente CB verso l&#39;ingresso del batterio. Questo sarà rimosso quando i batteri vengono introdotti nel dispositivo. </li></ol> 5. Crescita altamente mobili E. coli <ol><li> Grow culture durante la notte di E. coli RP437 con un&#39;espressione GFP plasmide in 20 ml di brodo triptone (TB) a 32 ° C con agitazione. Aggiungi concentrazioni di antibiotico appropriato per mantenere il plasmide. Nel nostro protocollo, utilizziamo una pCM182 plasmide basso copia per la rilevazione di batteri sulla base di fluorescenza nel dispositivo. Per E. coli, le culture in crescita a 32 ° C è raccomandata per la motilità elevato, come la motilità è inferiore a temperature più elevate. </li><li> Utilizzare la lingua durante la notte per inoculare a 20 mL di cultura TB in un Erlenmeyer da 250 ml a una densità ottica a 600nm di ~ 0,05. Far crescere la coltura in agitazione a 32 ° C. </li><li> Raccogliere le cellule con un diametro esterno di 600 ~ 0,35 0,45 da bassa velocità di centrifugazione a 400 xg per 5 min. </li><li> Risospendere le cellule ad un diametro esterno di 600 ~ 0.35 in CB contenente il chemoeffector alla concentrazione prevista nel bel mezzo del canale. </li><li> Aggiungere RFP marcato le cellule morte con un diametro esterno di 600 ~ 0,35 alla GFP che esprimono cellule vive. I morti (rosso), le cellule vengono utilizzati come controllo interno per garantire che qualsiasi migrazione non è dovuto agli effetti del flusso. </li></ol> 6. Monitoraggio chemiotassi <ol><li> Rimuovere alcuni dei CB dall&#39;ago ingresso cellulamozzo. Riempire con la sospensione cellulare. </li><li> Delicatamente riempire la siringa 50μL con le cellule risospese. Questo passo deve essere fatto lentamente come flagelli possono essere tranciati e ridurre la motilità. </li><li> Attaccare la siringa 50μL verso l&#39;ingresso del centro-ago come descritto al punto passi 4.10. </li><li> Posizionare il dispositivo sul palco di un microscopio a fluorescenza dotato di una telecamera ad alta velocità per l&#39;acquisizione delle immagini. Posizionare le siringhe di aspirazione (sia la 500 siringhe gradiente microlitri e la siringa da 50 celle mL) nella pompa a siringa e avviare il flusso in modo tale che il gradiente è formato e le celle sono che scorre attraverso il tubo. </li><li> Una volta che le cellule entrano nella camera chemiotassi, attendere circa 20 minuti per il sistema si stabilizzi prima di imaging. </li><li> Raccogliere verde (dal vivo) e rosso (morti) le immagini di fluorescenza a diverse posizioni lungo la lunghezza della camera (corrispondenti a diversi tempi di esposizione). Di solito, raccogliamo 100 immagini in ogni posizione ad intervalli di 3 secondi. </li></ol> 7. Analisi dei dati: la procedura seguente può essere eseguito utilizzando qualsiasi programma di analisi disponibili in commercio di immagini (ad esempio, ImageJ, Metamorph) o con semplici codici scritti in Matlab. <ol><li> Rimuovere i pixel di sfondo dell&#39;immagine (cioè la soglia di intensità dei pixel e rimuovere tutti i pixel che hanno un&#39;intensità inferiore alla soglia). Questo riduce al minimo rumore nell&#39;analisi. </li><li> Utilizzare la posizione delle cellule morte (fluorescenza rossa) per determinare il centro dell&#39;immagine. Dal momento che le cellule morte non mostrano chemiotassi, questa rappresenta la posizione in cui le cellule entrato nella camera di chemiotassi e sarebbe rilevato in assenza di migrazioni. </li><li> Individuare le cellule vive (fluorescenza verde) nell&#39;immagine. </li><li> Dividere l&#39;immagine in canali e determinare il numero di cellule vive in ogni canale. Nel nostro lavoro precedente 3, il micron 1050 chemiotassi ampia camera era divisa in 64 canali che sono ogni ~ 16 micron di larghezza. </li><li> Ripetere i passi 7,1 7.3 per tutte le immagini e la somma del numero di cellule totale per ogni canale in tutte le immagini. Questo dà il conteggio totale delle cellule rilevato in ciascun canale per tutta la durata dell&#39;esperimento. </li><li> Calcolare il coefficiente di partizione chemiotassi (CPC), che rappresenta la direzione della migrazione, come segue: ogni cellula si trova nella alta concentrazione (a destra) e bassa concentrazione (a sinistra) i lati della cellule morte viene assegnato un moltiplicatore pari a +1 e -1 , rispettivamente. Ovvero, una cellula che migra un gradiente viene moltiplicata per 1, mentre le cellule in movimento lungo il gradiente sono moltiplicati per -1. Tutti i valori moltiplicati vengono sommati e normalizzati al numero totale di cellule rilevate. Per esempio, un valore CPC di 0,40 indica che il 40% in più dei batteri totale spostato sul lato alta concentrazione rispetto al lato bassa concentrazione (cioè la chemoeffector è un attrattivo come più batteri sono stati rilevati in movimento il gradiente). </li><li> Calcolare il coefficiente di migrazione chemiotassi (CMC), che pesa la migrazione delle cellule dalla distanza percorsa, come segue: Peso contare le celle in ogni canale di un fattore che è proporzionale alla distanza che le cellule migrano. Una cellula che si muove di più lontano ad alta concentrazione di posizione (canale 64) viene assegnato un fattore di ponderazione di +1, mentre quello che si muove a metà strada nel lato maggiore concentrazione è assegnato un fattore di ponderazione di 0,5, e una cellula di passare al più lontano bassa concentrazione posizione ponderata per -1. Sommare tutti i conteggi delle cellule ponderato e normalizzare il numero di cellule per generare il CMC. </li></ol> Risultati Rappresentante 3,4: Abbiamo usato il dispositivo a microfluidi (Figura 1A) descritto qui di indagare chemiotassi di E. coli in gradienti di attrattivi (acido aspartico, autoinducer-2) e repellenti (NISO 4, indolo) 3,4. Il prototipo chemiotassi ceppo 5 E. coli RP437 GFP che esprimono è stato utilizzato, insieme a kanamicina, ucciso E. coli TG1 cellule che esprimono proteine ​​fluorescenti rossi per monitorare gli effetti del flusso. Il gradiente di concentrazione formata nel dispositivo μFlow è mostrato nella Figura 1B. L&#39;ingresso cella era massimale, in modo che non vi era alcun flusso attraverso di essa e un gradiente stabile di 0 100 è stata fondata ng / mL di fluoresscein nel dispositivo. L&#39;intensità dei pixel attraverso il dispositivo è stato utilizzato per determinare il profilo di concentrazione di fluorescina. I dati mostrano che i batteri incontrano una sfumatura lineare quando entrano nella camera di chemiotassi. Figura 2A e B mostra le immagini di fluorescenza di E. coli RP437 migrare in risposta a gradienti di acido aspartico (0 100 mM) e Niso 4 (0 225 mM). Le risposte osservate a questi attrattivo canonico e repellenti sono come previsto. 3A La figura mostra la distribuzione quantificati di E. coli RP437 in assenza di un gradiente di concentrazione (cioè, il gradiente nullo di acido aspartico), mentreFigure 3B e C mostrano la distribuzione in gradienti di acido aspartico e NISO 4. La specificità di queste risposte (cioè, il bias in migrazione) è evidente come E. coli RP437 Δ catrame ceppo (cioè privi del ceppo chemoreceptor Tar che viene utilizzato in E. coli a senso acido aspartico e nichel) non dimostra la parzialità nella migrazione, in presenza di un gradiente di concentrazione di acido aspartico o NISO 4. Le tendenze evidenti nei profili di distribuzione spaziale sono inoltre coerenti con i valori calcolati CPC e CMC. I valori CPC per la migrazione di E. coli RP437 in gradienti di acido aspartico o Niso 4 sono 0,33 e -0,33, rispettivamente. I corrispondenti valori CMC sono 0,13 e -0,14, rispettivamente. Al contrario, la CPC e CMC valori con la E. coli RP437 Δ ceppo di catrame in gradienti di acido aspartico o Niso 4 sono trascurabili. Inoltre, il CPC e CMC in un gradiente nullo di acido aspartico sono 0,03 e 0,02, rispettivamente, e indicano la mancanza di pregiudizi nella migrazione, in assenza di un gradiente. <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig1a.jpg" alt="Figura 1a" /> <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig1b.jpg" alt="Figura 1b" /> Figura 1. Dispositivo schematica e gradiente di concentrazione. (A) Rappresentazione schematica del dispositivo chemiotassi microfluidica. Il dispositivo è costituito da un gradiente di miscelazione modulo (20 x 100 x 18750 micron) e un modulo di osservazione chemiotassi (20 x 1050 x 11500 micron). Le larghezze dei due canali gradiente entrare nel dispositivo sono 500 micron e la larghezza della presa batteri è di 50 micron. L&#39;inserto mostra un gradiente di molecola di segnalazione (grigio) e batteri migrano in risposta ad essa. Batteri vivi sono dipinti come ovali solido, mentre i batteri morti sono mostrati come ovali aperte. (B) Un gradiente di concentrazione tra 0 e 100 ng / mL fluoresceina è stata generata in dispositivo e ripreso usando la microscopia a fluorescenza. Immagini di fluorescenza sono state acquisite dopo 30 minuti e quantificato l&#39;analisi dell&#39;immagine. <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Chemiotassi di E. coli RP437 nel dispositivo microfluidica. E. coli RP437 è stato esposto ad un gradiente di (A) 0-100 mM L-aspartato (B) 0-225 mM NISO 4 nel dispositivo e la migrazione di batteri vivi (verde) in direzione di L-aspartato o lontano da nichel ripreso ogni 2,5 sec per 30 min. Batteri morti (rosso) è servito come il controllo per gli effetti del flusso nel dispositivo. Le immagini sono state quantificate con un in-house ha sviluppato l&#39;analisi program3. I dati riportati sono rappresentativi pseudo-colore delle immagini provenienti da tre esperimenti indipendenti. <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig3a.jpg" alt="Figura 3a" /> <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig3b.jpg" alt="Figura 3b" /> <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig3c.jpg" alt="Figura 3c" /> Figura 3: Quantificazione dei profili di migrazione a un attrattivo canonica e repellente. Distribuzione spaziale dei RP437 nel dispositivo a microfluidi in risposta a (A) uniforme 100 mM L-aspartato (cioè, senza pendenza), (B) un gradiente 0 100 mM di aspartato, e (C) un gradiente 0 225 mM di NISO 4 . La distribuzione delle cellule morte viene visualizzato come una linea continua, la distribuzione di cellule RP437 è indicato come una linea tratteggiata, e la distribuzione di RP437 eda + Δ cellule tar è mostrata come una linea tratteggiata. I dati riportati sono una media di tre esperimenti indipendenti.

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	<li>McDonald, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prototyping+of+microfluidic+devices+in+poly(dimethylsiloxane)+using+solid-object+printing.">Prototyping of microfluidic devices in poly(dimethylsiloxane) using solid-object printing.</a> Anal Chem. 74, 1537-1545 (2002).</li><li>Hansen, M. C., Palmer, R. J. J., Udsen, C., White, D. C., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+GFP+fluorescence+in+cells+of+Streptococcus+gordonii+under+conditions+of+low+pH+and+low+oxygen+concentration.">Assessment of GFP fluorescence in cells of Streptococcus gordonii under conditions of low pH and low oxygen concentration.</a> Microbiol. 147, 1383-1391 (2001).</li><li>Englert, D. L., Manson, M. D., Jayaraman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Flow-Based+Microfluidic+Device+for+Quantifying+Bacterial+Chemotaxis+in+Stable,+Competing+Gradients.">A Flow-Based Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable, Competing Gradients.</a> Appl Environ Microbiol. 75, 4557-4564 (2009).</li><li>Englert, D. L., Jayaraman, A., Manson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microfluidic techniques for the analysis of bacterial chemotaxis. , (2009).</li><li>Mao, H., Cremer, P. S., &amp;amp, M. a. n. s. o. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive,+versatile+microfluidic+assay+for+bacterial+chemotaxis.">A sensitive, versatile microfluidic assay for bacterial chemotaxis.</a> PNAS. 100 (9), 5449-5454 (2003).</li></ol>

Il coefficiente di partizione chemiotassi (CPC) e il coefficiente di migrazione chemiotassi (CMC) può essere calcolato come descritto in Mao et al 5. Se una cellula viene rilevato sul lato alta concentrazione, si è dato un valore di +1, mentre una cella individuata sul lato bassa concentrazione viene assegnato un valore di -1. I valori sono riassunti e diviso per il numero totale di cellule per generare il CPC. Il segno del CPC (positivo o negativo) dà la direzione della migrazione (verso o lonta...

a microfluidic device for quantifying bacterial chemotaxis in stable concentration gradients

Chemiotassi permette ai batteri di approccio fonti di sostanze chimiche attractant o per evitare le fonti di sostanze repellenti. I batteri di monitorare costantemente la concentrazione di chemoeffectors specifiche confrontando la concentrazione attuale alla concentrazione rilevata pochi secondi prima. Questo confronto determina la direzione netto di movimento. Anche se diversi, i gradienti concorrenti spesso coesistono in natura, gli approcci convenzionali per lo studio chemiotassi batterica non sono ottimali per quantificare la migrazione in risposta a gradienti di concentrazione di attrattivi e repellenti. Qui, descriviamo lo sviluppo di un modello di chemiotassi microfluidica per presentare i gradienti di concentrazione precisa e stabile di chemoeffectors a batteri e quantitativamente indagando la loro risposta al gradiente applicato. Il dispositivo è versatile in quanto gradienti di concentrazione di qualsiasi concentrazione desiderata in assoluto e la forza del gradiente può essere facilmente generato da miscelazione diffusivo. Il dispositivo è dimostrata utilizzando la risposta del<em&gt; Escherichia coli</em&gt; RP437 a gradienti di aminoacidi e ioni nichel.

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A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Questo protocollo descrive lo sviluppo di un dispositivo a microfluidi per indagare chemiotassi batterica in gradienti di concentrazione stabile di chemoeffectors.

Un dispositivo a microfluidi per quantificare chemiotassi batterica in gradienti di concentrazione stabile

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.1K Views.  Texas A&M University. Questo protocollo descrive lo sviluppo di un dispositivo a microfluidi per indagare chemiotassi batterica in gradienti di concentrazione stabile di chemoeffectors.

Video: A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Studies of Bacterial Chemotaxis Using Microfluidics - Interview

Gli studi di chemiotassi batterica Utilizzando Microfluidica - Intervista

Ricerca

Biologia

Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for culturing neurons. Previously, a silicon wafer was patterned with the design for the neuron microfluidic device using SU-8 and photolithography to create a master mold, or what we simply refer to as a "master". Next, we pour the silicon polymer PDMS on top of the master which is then cured by heating the PDMS to 80&deg;C for 1 hour. The PDMS forms a negative mold of the device. The PDMS is then carefully cut and lifted away from the master. Holes are punched where the reservoirs will be and the excess PDMS trimmed away from the device. Nitrogen is used to blow away any excess debris from the device. At this point the devices are now ready for use and can either bonded to corning No. 1 cover glass with a plasma sterilizer/cleaner or can be reversibly bound to the cover glass by simply placing the device on top of the cover glass. The reversible bonding of the device to glass is covered in a separate video and requires first that the device be sterilized either with 70% ethanol or by autoclaving. Plasma treating sterilizes the devices so no further treatment is necessary. It is, however, important, when plasma-treating the devices, to add liquid to the devices within 10 minutes of the plasma treatment while the surfaces are still hydrophilic. Waiting longer than 10 minutes to add liquid to the device makes it difficult for the liquid to enter the device. The neuron devices are typically plasma-bound to cover glass and 0.5 mg/ml poly-L-lysine (PLL) in pH 8.5 borate buffer is immediately added to the device. After a minimum of 3 hours incubating with PLL, the devices are washed with dH2O water a minimum of 3 times with at least 15 minutes between each wash. Next, the water is removed and fresh media is added to the device. At this point the device is ready for use. It is important to remember at this point to never remove all the media from the device. Always leave media in the main channel.

In this video we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to farbricate a microfluidic device for culturing neurons.

Fabbricazione di un dispositivo a microfluidi per la compartimentazione dei Neuron Soma e assoni

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for ...

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

Un dispositivo a microfluidi con pattern Groove per studiare il comportamento cellulare

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an enabling experimental tool, because it can precisely manipulate fluid flows, enable high-throughput experiments, and generate stable soluble concentration gradients.  Compared to conventional gradient generators, poly(dimethylsiloxane) (PDMS)-based  microfluidic devices can generate stable concentration gradients of growth factors with well-defined profiles.  Here, we developed simple gradient-generating microfluidic devices with three separate inlets.  Three microchannels combined into one microchannel to generate concentration gradients.  The stability and shape of growth factor gradients were confirmed by fluorescein isothyiocyanate (FITC)-dextran with a molecular weight similar to epidermal growth factor (EGF).  Using this microfluidic device, we demonstrated that fibroblasts exposed to concentration gradients of EGF migrated toward higher concentrations.  The directional orientation of cell migration and motility of migrating cells were quantitatively assessed by cell tracking analysis.  Thus, this gradient-generating microfluidic device might be useful for studying and analyzing the behavior of migrating cells.

We describe a protocol for the microfabrication of the gradient-generating microfluidic device that can generate spatial and temporal gradients in well-defined microenvironment. In this approach, the gradient-generating microfluidic device can be used to study directed cell migration, embryogenesis, wound healing, and cancer metastasis.

Un gradiente di generazione del dispositivo Microfluidic di Biologia Cellulare

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an ...

Preparing E18 Cortical Rat Neurons for Compartmentalization in a Microfluidic Device

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously dissected and prepared. The E18 cortex is, upon dissection, immediately dissociated into individual neurons. It is possible to store E18 cortex in Hibernate E buffer containing B27 at 4&deg;C for up to a week before the dissociation is performed. However, there will be a drop in cell viability. Typically we obtain our E18 Cortex fresh. It is transported to the lab in ice cold Calcium free Magnesium free dissection buffer (CMFM). Upon arrival, trypsin is added to the cortex to a final concentration of 0.125%. The cortex is then incubated at 37&deg;C for 8 minutes. DMEM containing 10% FBS is added to the cortex to stop the reaction. The cortex is then centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is removed and 2 ml of Neural Basal Media (NBM) containing 2% B27 (vol/vol) and 0.25% Glutamax (vol/vol) is added to the cortex which is then re-suspended by pipetting up and down. Next, the cortex is triturated with previously fire polished glass pipettes, each with a successive smaller opening. After triturating, the cortex is once again centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is then removed and the cortex pellet re-suspended with 2 ml of NBM containing B27 and Glutamax. The cell suspension is then passed through a 40 um nylon cell strainer. Next the cells are counted. The neurons are now ready for loading into the neuron microfluidic device.

In this video we demonstrate the preparation of E18 Cortical Rat Neurons.

Preparazione E18 neuroni corticali di ratto per compartimentazione in un dispositivo a microfluidi

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously ...

CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV

CD4 + T-linfociti Capture utilizzando un chip monouso Microfluidic per l&#39;HIV

Cell Capture Using a Microfluidic Device

Cattura cellula Utilizzando un dispositivo a microfluidi

Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is largely due to the difficulty with which one can create a cell-compatible and steady microenvironment using conventional microfabrication techniques and materials. We address this problem via the introduction of a novel microfabrication material, agarose gel, as the base material for the microfluidic device. Agarose gel is highly malleable, and permeable to gas and nutrients necessary for cell survival, and thus an ideal material for cell-based assays. We have shown previously that agarose gel based devices have been successful in studying bacterial and neutrophil cell migration2. In this report, three parallel microfluidic channels are patterned in an agarose gel membrane of about 1mm thickness. Constant flows with media/buffer are maintained in the two side channels using a peristaltic pump. Cells are maintained in the center channel for observation. Since the nutrients and chemicals in the side channels are constantly diffusing from the side to center channel, the chemical environment of the center channel is easily controlled via the flow along the side channels. Using this device, we demonstrate that the movement of neural stem cells can be monitored optically with ease under various chemical conditions, and the experimental results show that the over expression of epidermal growth factor receptors (EGFR) enhances the motility of neural stem cells. Motility of neural stem cells is an important biomarker for assessing cells aggressiveness, thus tumorigenic factor3. Deciphering the mechanism underlying NSC motility will yield insight into both disorders of neural development and into brain cancer stem cell invasion.

We demonstrate that the over expression of epidermal growth factor receptors (EGFR) enhances the motility of neural stem cells(NSCs) using a novel agarose gel based microfluidic device. This technology can be readily adaptable to other mammalian cell systems where cell sources are scarce, such as human neural stem cells, and the turn around time is critical.

Valutare motilità delle cellule staminali neurali L&#39;utilizzo di un gel a base di Agarose dispositivo a microfluidi

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is ...

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Generazione di Stabile transgenici C. elegans Utilizzando Microiniezione

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence imaging of calcium influx and mitochondrial potential changes. The device consists of three layers: first layer contains an array of microscale wells (500 &mu;m diameter and 150 &mu;m depth) that help to immobilize the islets while exposed to flow and maximize the exposed surface area of the islets; the second layer contains a circular perifusion chamber (3 mm deep, 7 mm diameter); and the third layer contains an inlet-mixing channel that fans out before injection into the perifusion chamber (2 mm in width, 19 mm in length, and 500 &mu;m in height) for optimizing the mixing efficiency prior to entering the perifusion chamber. The creation of various glucose gradients including a linear, bell shape, and square shapes also can be created in the microfluidic perifusion network and is demonstrated.

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence imaging of calcium influx and mitochondrial potential changes.

Un multi-parametrica Perifusion Sistema isolotto all&#39;interno di un dispositivo Perifusion Microfluidic

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence ...