Vogliamo riconoscere lo spirito di cooperazione di tutti i membri Lab Caldwell. Disturbi del movimento di ricerca in laboratorio è stato sostenuto dalla Bachmann-Strauss Fondazione Parkinson e distonia, Regno Parkinson Foundation, American Parkinson Disease Association, il morbo di Parkinson Associazione dell&#39;Alabama, Michael J. Fox Foundation for Parkinson Research, e una ricerca di laurea.

Espressione Costruzione plasmidi Due plasmidi sono necessari: uno per espressione tessuto-specifica del gene di interesse e un secondo come marcatore trasformazione selezionabili. Sperimentale plasmidi <ol><li> Selezionare un promotore che si esprime nel tessuto / cellula tipo di interesse, ad esempio, un nervo o muscolo-specifico promotore. Se uno è di esprimere geni multipli all&#39;interno del tessuto stesso, una cassetta promotore plasmide nel sistema Gateway (Invitrogen) può essere utilizzato. Questo approccio consente l&#39;inserimento di un gene di interesse a valle del promotore di 4 clonazione ricombinazione. Generalmente, 2-5 kb di sequenze a monte è sufficiente disporre di espressione corretta e precisa. </li><li> Il cDNA del gene di interesse può essere clonato in due modi: <ol><li> Clonazione convenzionale utilizzando enzimi di restrizione. </li><li> Gateway per la clonazione, è amplificato mediante PCR utilizzando primers che contengono il Gateway att sequenza B ricombinazione. Il cDNA amplificato viene prima ricombinato nel pDONR201 vettore donatore per creare il vettore di ingresso e poi trasformato in E. coli ceppo DH5a. A seguito di selezione dei ricombinanti successo e mini-prep isolamento del DNA, il vettore di ingresso viene ricombinato nel promotore contenenti vettore destinazione per creare il plasmide di espressione. Dettagli sulla clonazione ricombinazione sono disponibili sia dal manuale Gateway Invitrogen o in Caldwell et al. 5. </li></ol></li></ol> Marker selezionabile plasmidi Esempi di plasmidi marcatore transgenici sono rol-6 o utilizzo del promotore muscolo del corpo muro unc-54 per guidare l&#39;espressione di proteine ​​fluorescenti. Questi plasmidi marker sono generalmente disponibili all&#39;interno della comunità scientifica su richiesta. Microiniezione di C. elegans Preparazione <ol><li> Procedere all&#39;isolamento del DNA dei due plasmidi che devono essere iniettati. Quantificare loro e si mescolano in un rapporto 1:1 di 50 ng / mL ciascuno. </li><li> Preparare pastiglie agar: <ol><li> Fare una soluzione al 2% di agarosio in acqua, calore o microonde fino alla dissoluzione. </li><li> Sono di varie 22 x 50 bicchieri di copertura mm su un banco. </li><li> Utilizzando una pipetta Pasteur, una goccia di agarosio fuso su una copertura in vetro e collocare immediatamente un secondo bicchiere coprire il calo a 90 alla prima. Ripetere l&#39;operazione per diversi bicchieri coprire altre. Il diametro del disco appiattito di agarosio deve essere compreso tra 15-20 mm. </li><li> Dopo l&#39;agarosio si è solidificato (questo richiede solo momenti), togliere il vetro di copertura e permettere al pad per asciugare completamente (diverse ore a notte). </li><li> Conservare le pastiglie in una scatola di vetro di copertura a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Fai caricatori aghi per soluzione di DNA: Caricatori aghi vengono creati da 100 microlitri tubi capillari che vengono riscaldate in mezzo su una fiamma aperta e rapidamente tirato a circa il doppio della loro lunghezza. Le due metà sono scattato a parte una volta che il tubo capillare si raffredda. Accumulo 10-20 caricatori ago per l&#39;iniezione. Conservare in posizione verticale in un rack provetta. Prestare attenzione per non impalare se stessi i punti. </li><li> Fai aghi microiniezione: L&#39;ago è costituito da un tubo capillare speciale che contiene un filamento interno in vetro, questo filamento funge da stoppino per la soluzione del DNA. Questi sono tirati su un ago-estrattore macchina. Usiamo un Narishige PP-830 estrattore con una regolazione di calore di 24,8. Aghi diversi sono tirati alla volta e sono memorizzati in una scatola di plastica di piccole dimensioni. Aghi multipli possono essere facilmente &quot;montata&quot; su una striscia di plastilina per la conservazione a lungo termine. </li><li> La punta dell&#39;ago &quot;interruttori&quot;: La punta dell&#39;ago microiniezione viene tirato così fine che in realtà è chiuso a finire e deve essere rotto aperto con frammenti di piccole di vetro di copertura. Questi sono preparati avvolgendo una x 18 18 vetro di copertura mm in un tovagliolo di carta e delicatamente applicando una pressione fino a quando si rompe in vari pezzi. Frammenti di dimensioni utili sono circa 3 x 4 mm. </li><li> Crescono wild type (N2) vermi allo stadio adulto in anticipo per iniezione utilizzando le procedure standard 6. Preparare adeguatamente messo in scena circa 100 worm / costruire iniettato. </li></ol> Procedura <ol><li> Aprire la valvola principale di un serbatoio di elio che è collegato ad un braccio l&#39;ago microiniezione e supporto. Chiudere la valvola di regolazione per consentire al gas di entrare nella linea, portando la pressione a 35 bar. Si noti che il gas può essere rilasciato con un pedale. </li><li> Inserire un caricatore ago in una tubazione tradizionale pipetter bocca (che si trova in contenitori di vetro, tubi capillari) e redige una piccola quantità di miscela plasmide (~ 1 ml). </li><li> Il caricatore ago è accuratamente inserito nel back-end di un ago per l&#39;iniezione e delicatamente inserito tutto il percorso attraverso la lunghezza dell&#39;ago fino ad avvertire resistenza. Espellere la soluzione di DNA da parte soffia dolcemente, quindi rimuovere il caricatore. </li><li> Inserire l&#39;ago nel braccio microiniezione, avendo cura di collocarla all&#39;interno della guarnizione di gomma interno. </li><li> Inserire un ago-rottura scheggia di vetro di copertura su un bordo di un pad agar. Coprire il frammento, così come tutta la superficie del pad agar, con olio alocarburi. Posizionare il pad agar sul palcoscenico di un microscopio invertito. </li><li> Posizionare l&#39;ago nel centro del campo visivo con l&#39;obiettivo di 4X e di illuminazione in campo chiaro, ma non ancora la più bassa nell&#39;olio. Inoltre, la posizione del bordo interno del frammento di copertura in vetro del centro, per poi focalizzarsi su di esso (ancora con obiettivo 4X). Abbassare l&#39;ago nel petrolio, portandola nello stesso piano focale, come il frammento di vetro di copertura. Sollevare l&#39;ingrandimento passando per l&#39;obiettivo 40X. Ridefinire sul bordo del frammento e riposizionare la punta dell&#39;ago, se necessario. </li><li> Per aprire la punta di un ago per l&#39;iniezione, DELICATAMENTE spingere l&#39;ago contro il bordo del coperchio in vetro coccio, mentre allo stesso tempo, applicando un breve impulso di gas attraverso il pedale. L&#39;ago sarà sufficientemente rotto aperto quando piccole gocce di liquido sfuggire alla fine l&#39;ago. Eccesso di flusso di liquido a causa di un&#39;apertura troppo grande non è auspicabile, in quanto uccidono gli animali. </li><li> Rimuovere il tampone di agar dal palco sollevando l&#39;ago, ma non cambiare la X o Y. posizione. Far scorrere il palco fuori da sotto l&#39;ago, rimuovere il pad agar e mettetelo su un microscopio da dissezione. Trasferire un worm sul pad, sotto la superficie dell&#39;olio. Se il verme si contorce, DELICATAMENTE accarezzarlo finché non tocca la tastiera agar. Il worm umido dovrebbe aderire al secco agarosio. </li><li> Iniezione <ol><li> Rapidamente posto sul retro pad agar sul palco, centrando il verme nel campo visivo. </li><li> Abbassare l&#39;ago nel stesso piano di messa a fuoco come il verme. </li><li> Passa i filtri per Hoffman illuminazione (un tipo di filtro di contrasto). Questo permette dettaglio morfologico del worm per diventare visibili. Se Nomarski / DIC ottica sono disponibili sulla portata rovesciata che funziona altrettanto bene. Utilizzando l&#39;obiettivo 40X, si concentrano sul centro &quot;sgranata&quot; sinciziale della gonade verme, sotto il pattern &quot;a nido d&#39;ape&quot; dei nuclei germinali (scegliere quale gonade è posizionato sul lato del worm verso l&#39;ago). </li><li> Ottimizzare la posizione dell&#39;ago fino a quando la punta è messa a fuoco (sullo stesso piano della gonade &quot;granulosità&quot;). </li><li> Inserire delicatamente l&#39;ago nel centro della gonade e applicare un breve impulso di pressione del gas per espellere una goccia o due di DNA nel braccio gonade. Si dovrebbe osservare un&#39;onda di diffusione in tutto il liquido gonade distale. Non assumere più liquidi è meglio, in quanto il liquido troppo può fluire nel piegare prossimale del braccio gonade, che può fermare la produzione di ovociti. Se possibile, a seconda della posizione del worm, iniettare l&#39;altro braccio gonade nello stesso modo. </li><li> E &#39;importante lavorare velocemente, mentre l&#39;iniezione di un verme, come si può facilmente essiccare. La decisione di iniettare il secondo braccio gonade dipende da quanto velocemente si può riposizionare l&#39;ago e worm. L&#39;intero processo è effettuato, a meno di 1-2 minuti. </li></ol></li><li> Togliere il vetro di copertura dal palco e posizionarlo su una portata dissezione. Applicare 1ml di M9 tampone (22mm KH 2 PO 4, 42mm Na 2 HPO 4, 85mm NaCl, 1 mM MgSO 4) direttamente sul verme iniettato (questo potrebbe comportare immergendo la punta della pipetta sotto la superficie del petrolio alocarburi). Il buffer dovrebbe reidratare il worm, che sarà poi galleggiare sulla superficie pad agarosio. Trasferimento al worm di un piatto normale con un pick verme. Il pad agarosio può essere riutilizzato più volte fino a quando non è diventato troppo saturo di buffer e il worm non aderire. </li></ol> Selezione transgenici <ol><li> Vermi iniettato, il P 0 generazione, vengono trasferiti ai singoli fresca, piatti batteri seminati (60 mm) e ha permesso di riprodurre. Tipicamente, gli animali iniettati vengono incubate a 20 ° C per 2-3 giorni fino a quando la prole apparire. </li><li> Il 1 prole F sono osservati per la prova del marcatore transgenici (come fluorescenza) utilizzando uno stereomicroscopio a fluorescenza. Ogni fluorescente, vettore F 1, animale è clonato separatamente su una piastra di nuovo (in quanto discendenti da ogni F 1 sono considerati una linea distinta). La F 1 ermafroditi sono autorizzati a riprodurre. Di nuovo, questo è tipicamente effettuata a 20 ° C per 2-3 giorni fino a quando la prole apparire. </li><li> La generazione F 2 è osservato per gli animali transgenici pure. F 2 animali che hanno ereditato ed esprimere l&#39;array transgenici sono considerati una linea di &quot;stabile&quot;. NOTA: Al 1 ° Fetà ci possono essere molti animali transgenici, ma non sono stabili. La maggior parte degli F 1 animali transgenici non saranno diffusi in F 2 linee stabili. NOTA: Per controllare la variabilità del numero di copie del gene, generare un minimo di tre linee indipendenti stabile per costruire iniettato. </li><li> Ogni linea indipendente stabile dovrebbe essere mantenuto come una linea separata di vermi. Ogni linea può essere propagato con il trasferimento di diversi animali transgenici per un piatto di nuovo ad ogni generazione, questo deve essere eseguita utilizzando uno stereomicroscopio a fluorescenza se il marcatore è fluorescente. </li></ol>

<ol>
	<li>Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrachromosomal+DNA+transformation+of+Caenorhabditis+elegans.">Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).</li><li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.elegans:+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).</li><li>Kelly, W. G., Xu, S., Montgomery, M. K., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+requirements+for+somatic+and+germline+expression+of+a+generally+expressed+Caenorhabditis+elegans+gene.">Distinct requirements for somatic and germline expression of a generally expressed Caenorhabditis elegans gene.</a> Genetics. 146, 227-238 (1997).</li><li>Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Torsin-mediated+neuroprotection+from+cellular+stresses+to+dopaminergic+neurons+of+C.+elegans.">Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans.</a> J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).</li><li>Caldwell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. , (2006).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li></ol>

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordarsi di: - Iniettare direttamente nel centro della gonade - Non iniettare liquidi troppo - Lavorare velocemente per evitare essiccazione. Se si verificano problemi con l&#39;ago, come si è rotto troppo grande, è meglio rifare un ago fresco, piuttosto che cercare di iniettare con meno di aghi ideale. La generazione di vermi transgenici ha molte applicazioni quali: - Identificazione di geni mutanti, nel metodo chiamato soccorso trasformazione ...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Agarose</td>
<td>Ultrapure</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15510-027</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Halocarbon Oil, Voltalef</td>
<td>Hulle 10S</td>
<td>elfatochem, France</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverglass 18x18 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-548-A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverglass 20x30 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-548-5A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverglass 22x50 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-545-E</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100 ul Capillary</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>53432-921</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Capillary for Needles</td>
<td>"Kwik-Fil"</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>1B100F-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Needle Puller</td>
<td>Tool</td>
<td>Narishige</td>
<td>Model PP-830</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>microINJECTOR System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Tritech Research</td>
<td>MINJ-1000</td>
<td>Scope, Stage, Manipulator</td>
</tr>
<tr>
<td>Dissecting, with Fluorescence</td>
<td>Microscope</td>
<td>Nikon</td>
<td>SMZ800</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting</td>
<td>Microscope</td>
<td>Nikon</td>
<td>SMZ645</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

generation of stable transgenic c. elegans using microinjection

Transgenici Caenorhabditis elegans possono essere facilmente create tramite microiniezione di una soluzione di DNA plasmidico in gonade 1. Il DNA plasmidico riorganizza per formare concatamers extracromosomico che sono stabilmente ereditato, anche se non con la stessa efficienza di cromosomi effettivo 2. Un gene di interesse è co-iniettata con un marker fenotipici evidenti, come ad esempio rol-6 o GFP, per consentire la selezione di animali transgenici sotto un microscopio da dissezione. Il gene esogeno può essere espresso dal suo promotore nativo per gli studi di localizzazione cellulare. In alternativa, il transgene può essere guidata da un diverso tessuto-specifica promotore di valutare il ruolo del prodotto genico in quella cella particolare o tessuto. Questa tecnica di guida in modo efficiente l&#39;espressione genica in tutti i tessuti del C. elegans, tranne per l&#39;embrione linea germinale o ai primi 3. Creazione di animali transgenici è ampiamente utilizzata per una vasta gamma di paradigmi sperimentali. Questo video mostra la procedura di microiniezione di generare vermi transgenici. Inoltre, la selezione e la manutenzione di stabili transgenici C. elegans linee è descritto.

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Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Questo video mostra la tecnica di microiniezione nella gonade di C. elegans per creare animali transgenici.

Generazione di Stabile transgenici C. elegans Utilizzando Microiniezione

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

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Research

JoVE Journal

Biology

52.7K Views.  University of Alabama. Questo video mostra la tecnica di microiniezione nella gonade di C. elegans per creare animali transgenici.

Video: Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

Microiniezione di A. aegypti embrioni per ottenere zanzare transgeniche

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Ricerca

Biologia

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

Generazione di transgenici C. elegans Di Trasformazione Biolistic

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

Imaging C. elegans Gli embrioni utilizzando un microscopio epifluorescente e Software Open Source

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

Attivazione di apoptosi da Microiniezione citoplasmatici del Citocromo C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

Determinare profili di espressione genetica in C. elegans Utilizzo Microarray e Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans Chemiotassi Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

Antibody colorazione in<em&gt; C. Elegans</em&gt; Uso di &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

Misurare gli effetti dei batteri su<em&gt; C. Elegans</em&gt; Comportamento utilizzando un saggio di ritenzione dell&#39;uovo

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

Generazione di transgenici<em&gt; Hydra</em&gt; Da Embryo microiniezione

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for the conversion and replication of their benign cellular isoform. Accumulating evidence suggests that many protein aggregates can act as self-propagating templates and corrupt the folding of cognate proteins. Although aggregates can be functional under certain circumstances, this process often leads to the disruption of the cellular protein homeostasis (proteostasis), eventually leading to devastating diseases such as Alzheimer&#8217;s disease (AD), Parkinson&#8217;s disease (PD), Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). The exact mechanisms of prion propagation and cell-to-cell spreading of protein aggregates are still subjects of intense investigation. To further this knowledge, recently a new metazoan model in Caenorhabditis elegans, for expression of the prion domain of the cytosolic yeast prion protein Sup35 has been established. This prion model offers several advantages, as it allows direct monitoring of the fluorescently tagged prion domain in living animals and ease of genetic approaches. Described here are methods to study prion-like behavior of protein aggregates and to identify modifiers of prion-induced toxicity using C. elegans.

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

Indagare le proteine ​​prioniche-come diffusione e tossicità di utilizzare i metazoi Organismo modello<em&gt; C. elegans</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...

Methods Article

Generazione di Stabile transgenici C. elegans Utilizzando Microiniezione