Questo lavoro è supportato dal New York State Ufficio di Scienza, Tecnologia e ricerca accademica (NYSTAR) (sotto forma di un Centro per l&#39;avanzata tecnologia di sovvenzione), e da sovvenzioni provenienti dal Centro Nanobiotecnologie (NBTC), un programma STC del National Science Foundation sotto Accordo No. ECS-9876771, e l&#39;American Brain Tumor Association e la New York Academy of Medicine (JAB).

Procedura Diapositive rivestimento con fibronectina Prima del montaggio del dispositivo a microfluidi, sterilizzare vetrini con fibronectina. Cappotto le diapositive in una biohood per mantenere la sterilità. Allineare un distanziatore sterile PDMS lungo i bordi della diapositiva e contrassegnare il lato che è rivolto verso l&#39;alto con un pennarello indelebile. Pipettare 1 ml di mg / 5 ml soluzione di fibronectina (Sigma) all&#39;interno del distanziatore PDMS sulla totalità del vetrino. Lasciare le diapositive indisturbato per un&#39;ora, poi asciugare completamente con un N 2 pistola. Le slide possono essere conservati a 4 ° C per esperimenti successivi. Montaggio del dispositivo L&#39;intero protocollo di montaggio dispositivo è fatto in un biohood in condizioni sterili, utilizzando le seguenti procedure: <ol><li> Pulire il maestro di silicio con i microcanali modellata su di essa con l&#39;annientamento verso il basso con il 70% di etanolo e asciugare con la pistola 2 N. Inserire un distanziatore sterile PDMS di 1 mm di altezza con pinze attorno agli oggetti rilievo del maestro. </li><li> Preparare il gel utilizzato nel dispositivo pesa 0,3 g di polvere di agarosio (Fisher Scientific) e 10 ml di CO 2-media indipendenti (Invitrogen) in un bicchiere da 50 ml. Mescolate il composto con una spatola e calore in un forno a microonde per 20 secondi in alto. Se granuli non disciolti sono presenti, scaldare la miscela per altri 10 secondi e agitare la miscela calda di sbarazzarsi dei granuli ultime. Ripetere il processo con un tempo di riscaldamento di 8 secondi, e poi 5 secondi. </li><li> Versare rapidamente la soluzione di agarosio sul maestro silicio circondato da distanziatore PDMS coprire immediatamente la miscela di agarosio con un vetrino sterile. Applicare una costante, leggera pressione alla diapositiva per circa 2 minuti per assicurarsi che il gel di agarosio sarà allo stesso costante 1 mm di altezza come il distanziatore PDMS. </li><li> Dopo il gel di agarosio, rimuovere la fantasia gel con il distanziatore PDMS dal master silicio e il trasferimento a una diapositiva fibronectina vetro rivestito con la microcanali nel gel di agarosio fronte della diapositiva. Utilizzare una siringa calibro 16 per perforare fori nelle regioni serbatoio della microcanali per ingresso e uscita accessi. Aggiungere 500 ml di CO 2-media indipendenti al gel di agarosio modellata sulla diapositiva per prevenire l&#39;essiccamento dei microcanali. </li><li> Lavare il collettore acrilico usato nel dispositivo con il 70% di etanolo e sciacquare con acqua deionizzata. Allineare i fori nel collettore con i fori nel gel di agarosio con i microcanali. Poi, allineare il collettore con il gel, distanziatore PDMS, e la diapositiva fibronectina con la struttura metallica del dispositivo. Mettere le viti nel dispositivo e serrare al punto di resistenza con un cacciavite. Questo viene fatto per garantire che il dispositivo non è troppo stretto al punto da deformare la microcanali in agarosio. Serrare le viti in senso orario per assicurare che il gel all&#39;interno del dispositivo non si sposta. Prova il dispositivo per perdite e blocchi nel microcanali con una siringa da 1 ml. La siringa è dotata di tubi Tygon con un gel-loading puntale alla fine del tubo di iniettare CO 2-media indipendenti in microcanali. Un microcanali è considerato con successo forma quando i media si osserva per uscire solo dalla presa di microcanali quando il supporto viene iniettato nella presa corrispondente. Ora, il dispositivo è pronto all&#39;uso. </li></ol> Preparazione e semina delle cellule nel dispositivo Quando le cellule raggiungono il 70% (densità delle cellule circa 100.000 cellule / ml) confluenza, sono pronti per essere seminati nel dispositivo. Oggetto delle cellule a due DPBS (Invitrogen) lavaggi. Aggiungere 200 ml di tripsina-EDTA (Invitrogen) per staccare le cellule. Trasferire le cellule in una provetta da 15 ml per centrifuga contenente 5 ml di media M2 contenente siero per inattivare la tripsina. Centrifugati i mezzi di crescita con le cellule a 1000 giri per 5 minuti. Aspirato il sopranatante e risospendere il pellet di cellule 5 ml di DPBS. Centrifugare le cellule DPBS ancora una volta alle stesse condizioni. Aspirato il sopranatante di nuovo, e risospendere il pellet di cellule in 500 ml di CO 2-media indipendenti. Seme della sospensione risultante di cellule al centro microcanali del dispositivo tramite gravità-driven flusso. Aggiungere l&#39;ingresso el&#39;uscita del centro microcanali con 60 ml di sospensione cellulare e 20 ml di CO 2-indipendente di media, rispettivamente. Osservare il centro microcanali sotto un microscopio brightfield per cercare l&#39;adesione cellulare. Le cellule aderiscono solitamente dopo 10 minuti. Dopo che le cellule aderiscono al fondo del canale ad una giusta densità, pipeted la sospensione cellulare residua in entrata e in media in presa. Mettere 60 ml di CO 2-media indipendenti in entrambe ingresso e uscita del canale centrale. Luogo PDMS copre oltre ªe di ingresso e di uscita centrale per ridurre al minimo l&#39;evaporazione del supporto dal canale centrale. Imaging delle cellule nel dispositivo Prima del montaggio del dispositivo, infilare il tubo sterile peristaltica attraverso la stazione meteo del microscopio (Olympus X81) e collegare con la pompa peristaltica (Watson-Marlow 205U/CA). Flush PBS attraverso il tubo ad una velocità di 4 giri. Dopo il montaggio del dispositivo, preparare concentrazioni adeguate di fattore di crescita epidermico (EGF) (Sigma) soluzioni nel 2-media indipendenti CO in un tubo da 15 ml per centrifuga. Vortex le soluzioni FEG per 5 secondi e connettersi con il tubo. Collegare i tubi contrassegnati con concentrazioni di EGF corrispondente al dispositivo. Ci vuole circa un&#39;ora per il FEG per diffondere in tutto il crinale dei canali e stabilire una pendenza chimico. Un software di imaging, Slidebook, viene utilizzato per prendere una serie di immagini a ogni 10 minuti per circa 5 ore in una corsa sperimentale. La fase xy automatico è programmato in modo tale che due sub-aree (ciascuna con una superficie di x400μm 400μm) del canale stesso centro, e un totale di tre canali di centro sono esposte in un punto dato momento. Le cellule in diversi canali di centro (in genere 3 in una volta sola) hanno concentrazioni FEG diversi, come indicato sul tubo. Materiali e attrezzature Linee cellulari: le cellule sono C17.2 NSCs derivate dallo strato esterno germinale di topo cervelletto postnatale 6, 7. Usando questa linea cellulare, abbiamo sviluppato altre due linee di cellule staminali murine utilizzando il metodo di trasfezione retrovirus. Queste due linee cellulari stabilmente trasfettate sono (1) wtEGFR - che l&#39;eccesso di esprime l&#39;EGFR umana wild-type, e (2) ΔEGFR - che è un mutante costitutivamente attivo EGFR. Per facilità di rilevazione, i retrovirus portare una dorsale con il gene di interesse seguita da un sito interno per il legame ribosomiale (IRES) e la proteina verde fluorescente (GFP). Coltura cellulare: il C17.2 NSCs mouse e le loro varianti sono state coltivate in un 6-pozzetti in M2 media (DMEM (Invitrogen) con 10% siero fetale bovino (FBS) (Invitrogen), il 5% siero di cavallo (SA) (Invitrogen ), e 1% di penicillina / streptomicina (Invitrogen).) Le cellule sono state mantenute a 37 ° C in 80% di aria e il 5% di CO 2. Microfluidic dispositivo: un collettore di plastica, un distanziatore PDMS, e una cornice in acciaio per tenere il dispositivo in posizione. Imaging Un microscopio invertito a fluorescenza (Olympus IX-81) viene utilizzata, in connessione con un CCD intensificato fotocamera (Orca, Hamamatsu). Il dispositivo a microfluidi è montato su un palcoscenico automatizzato xyz, e la scena è racchiusa da una camera climatica che mantiene una temperatura di 37 ° C. Di solito ci sono dispositivi 3-4 sullo stesso chip, che sarà girato nel punto stesso tempo utilizzando il palcoscenico automatizzati xyz. Flusso mantenendo Una pompa peristaltica con 8 linee parallele (Watson-Marlow 205U/CA) automatica viene utilizzato per mantenere i flussi in tutte le lavello e canali sorgente. <img src="/files/ftp_upload/old/674_2008_9_29_6/674_Figure-01.jpg" alt="Figura 1" width="573" height="414" /> Fig. 1 motilità di tre ceppi NSC (genitori, wtEGFR, e D EGFR) in concentrazioni diverse FEG Tutte le traiettorie sono tratte da un film di monitoraggio di 5 ore (ad eccezione di wtEGF 100ng/ml, 4 ore), e l&#39;origine di tutti i brani sono stati riposizionato a (0,0) per scopi di confronto. <img src="/files/ftp_upload/old/674_2008_9_29_7/674_Figure-02.jpg" alt="Figura 2" width="576" height="546" /> Fig. 2 Correlazione tra livello di espressione di EGFR e motilità (a) due immagini di NSCs wtEGF sulla superficie di un canale microfluidica con 100ng/ml FEG. L&#39;immagine a sinistra è un&#39;immagine fluorescente, e il diritto è una immagine trasmessa campo chiaro. La barra di scala è 100μm, e il Larghezza del canale è di 400 micron. Le celle sono separati in due popolazioni con la luminosità della GFP espresso. Cellule nei cerchi blu sono dimmer, hanno quindi il livello di espressione di EGFR meno, e le cellule con cerchi rossi sono brigher, hanno così alto livello di espressione di EGFR. (B) Traiettorie di cellule con livello di EGFR a bassa ed alta espressione. Queste traiettorie sono tratti da quattro film della durata di un&#39;ora.

<ol>
	<li>Blow, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics:+in+search+of+a+killer+application.">Microfluidics: in search of a killer application.</a> Nature Methods. 4, 665-670 (2007).</li><li>Shing-Yi Cheng, S. H., Wassweman, M. a. x., Archer, S. h. i. v. a. u. n., Shuler, M. i. c. h. a. e. l. . L., Wu, M. i. n. g. m. i. n. g. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hydrogel-based+microfluidic+device+for+the+studies+of+directed+cell+migration.">A hydrogel-based microfluidic device for the studies of directed cell migration.</a> Lab-on-a-chip. 7, 763-769 (2007).</li><li>Pedersen, M. W., Tkach, V., Pedersen, N., Berezin, V., Poulsen, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+naturally+occurring+constitutively+active+variant+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+in+mouse+fibroblasts+increases+motility.">Expression of a naturally occurring constitutively active variant of the epidermal growth factor receptor in mouse fibroblasts increases motility.</a> Int J Cancer. 108, 643-653 (2004).</li><li>Ayuso-Sacido, A., Graham, C., Greenfield, J. P., Boockvar, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+duality+of+EGFR+signaling+and+neural+stem+cell+phenotype:+Cell+enhancer+or+cell+transformer.">The duality of EGFR signaling and neural stem cell phenotype: Cell enhancer or cell transformer.</a> Current Stem Cell Research and Therapy. 1, 231-238 (2006).</li><li>Eisenbach, M., Constantinou, C., Aloni, H., Shinitzky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repellents+for+Escherichia+coli+operate+neither+by+changing+membrane+fluidity+nor+by+being+sensed+by+periplasmic+receptors+during+chemotaxis.">Repellents for Escherichia coli operate neither by changing membrane fluidity nor by being sensed by periplasmic receptors during chemotaxis.</a> J Bacteriol. 172, 5218-5224 (1990).</li><li>Snyder, E. Y., Deitcher, D. L., Walsh, C., Arnold-Aldea, S., Hartwieg, E. A., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+neural+cell+lines+can+engraft+and+participate+in+development+of+mouse+cerebellum.">Multipotent neural cell lines can engraft and participate in development of mouse cerebellum.</a> Cell. 68, 33-51 (1992).</li><li>Snyder, E. Y., Yoon, C., Flax, J. D., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+neural+precursors+can+differentiate+toward+replacement+of+neurons+undergoing+targeted+apoptotic+degeneration+in+adult+mouse+neocortex.">Multipotent neural precursors can differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 11663-11668 (1997).</li></ol>

Fig. 1 mostra le traiettorie dei tre ceppi NSC, le cellule dei genitori, la wtEGFR e ΔEGFR (controllo). Ogni set di traiettorie sono stati ottenuti da un film di 5 ore. Per le cellule dei genitori, la motilità cellulare ha raggiunto un picco quando la concentrazione di FEG è stato ~ 10ng/ml; per le cellule wtEGFR, la motilità delle cellule picco spostato a 100ng/ml o superiore, per le cellule ΔEGFR, la motilità cellulare è indipendente dalla concentrazione di EGF come previsto. Le cellule wtEGF con 100ng/ml sono le cellule pi...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11971-025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CO2-independent media</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18045-088</td>
<td>A non-HEPES proprietary medium suitable for supporting cell growth for a variety of epithelial, fibroblast, and lymphoid cell lines in atmospheric conditions, contains no L-glutamine</td>
</tr>
<tr>
<td>Trypsin-EDTA</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25200-072</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14190-144</td>
<td>Phosphate-buffered saline, without calcium or magnesium</td>
</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>Contains 10,000 units of penicillin (base) and 10,000 g of streptomycin (base)/ml utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85% saline</td>
</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10437-028</td>
<td>Fetal Bovine Serum, Qualified</td>
</tr>
<tr>
<td>Horse Serum</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16050-130</td>
<td>Horse Serum, EIA tested (negative) serum</td>
</tr>
<tr>
<td>Fibronectin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>F0895</td>
<td>Fibronectin from human plasma, also called cold insoluble globulin</td>
</tr>
<tr>
<td>EGF</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>E4127</td>
<td>Epidermal Growth Factor from murine submaxillary gland, lyophilized</td>
</tr>
<tr>
<td>Agarose</td>
<td>Reagent</td>
<td>FisherScientific</td>
<td>BP1356-500</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

assessing neural stem cell motility using an agarose gel-based microfluidic device

Mentre la tecnologia microfluidica sta raggiungendo un nuovo livello di maturità per le analisi macromolecolare, saggi cellulari sono ancora ad uno stadio infantile 1. Ciò è dovuto alla difficoltà con cui si può creare un microambiente cellulare compatibile e costante con tecniche convenzionali di microfabbricazione e materiali. Abbiamo risolto questo problema tramite l&#39;introduzione di un materiale di microfabbricazione romanzo, gel, come materiale di base per il dispositivo a microfluidi. Gel è altamente malleabile, e permeabile ai gas e sostanze nutritive necessarie per la sopravvivenza delle cellule e, quindi, un materiale ideale per saggi cellulari. Abbiamo dimostrato in precedenza che i dispositivi di agarosio gel a base hanno avuto successo nello studio della migrazione delle cellule batteriche e dei neutrofili 2. In questo rapporto, tre canali paralleli microfluidica sono modellati in una membrana di gel di circa spessore 1mm. Flussi costanti con i media / tampone sono mantenute nei due canali laterali utilizzando una pompa peristaltica. Le cellule sono mantenute nel canale centrale per l&#39;osservazione. Dal momento che le sostanze nutrienti e sostanze chimiche nei canali laterali sono costantemente diffondendo dal lato al centro del canale, l&#39;ambiente chimico del canale centrale è facilmente controllato attraverso il flusso lungo i canali laterali. Utilizzando questo dispositivo, dimostriamo che il movimento delle cellule staminali neurali possono essere monitorati otticamente con facilità in condizioni chimiche diverse, ed i risultati sperimentali mostrano che l&#39;espressione dei recettori più fattore di crescita epidermico (EGFR) aumenta la motilità delle cellule staminali neurali. Motilità delle cellule staminali neurali è un biomarker importante per valutare l&#39;aggressività delle cellule, così fattore oncogeno 3. Decifrare il meccanismo alla base della motilità NSC produrrà comprensione entrambi i disturbi dello sviluppo neurale e in invasione di cellule di cancro al cervello staminali.

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Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

Abbiamo dimostrato che l&#39;espressione dei recettori più fattore di crescita epidermico (EGFR) aumenta la motilità delle cellule staminali neurali (NSC) utilizzando un nuovo gel dispositivo basato microfluidica. Questa tecnologia può essere facilmente adattabile ad altri sistemi cellulari di mammifero, dove le fonti di cellule sono scarse, come le cellule staminali neurali, e il girarsi tempo è critico.

Valutare motilità delle cellule staminali neurali L&#39;utilizzo di un gel a base di Agarose dispositivo a microfluidi

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is ...

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Research

JoVE Journal

Biology

11.6K Views.  Cornell University. Abbiamo dimostrato che l'espressione dei recettori più fattore di crescita epidermico (EGFR) aumenta la motilità delle cellule staminali neurali (NSC) utilizzando un nuovo gel dispositivo basato microfluidica. Questa tecnologia può essere facilmente adattabile ad altri sistemi cellulari di mammifero, dove le fonti di cellule sono scarse, come le cellule staminali neurali, e il girarsi tempo è critico.

Video: Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

Culture of Mouse Neural Stem Cell Precursors

Primary neural stem cell cultures are useful for studying the mechanisms underlying central nervous system development. Stem cell research will increase our understanding of the nervous system and may allow us to develop treatments for currently incurable brain diseases and injuries. In addition, stem cells should be used for stem cell research aimed at the detailed study of mechanisms of neural differentiation and transdifferentiation and the genetic and environmental signals that direct the specialization of the cells into particular cell types.  This video demonstrates a technique used to disaggregate cells from the embryonic day 12.5 mouse dorsal forebrain. The dissection procedure includes harvesting E12.5 mouse embryos from the uterus, removing the "skin" with fine dissecting forceps and finally isolating pieces of cerebral cortex. Following the dissection, the tissue is digested and mechanically dissociated. The resuspended dissociated cells are then cultured in "stem cell" media that favors growth of neural stem cells.

This video describes the method used for isolation of neuroprecursors from the developing cortex of embryonic mice. The procedure for removing embryos from the uterus, dissecting the cortical tissue, and digesting the isolated cerebral cortex is shown.

Cultura di cellule precursori staminali neurali del mouse

Primary neural stem cell cultures are useful for studying the mechanisms underlying central nervous system development. Stem cell research will increase ...

Ricerca

Biologia

Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for culturing neurons. Previously, a silicon wafer was patterned with the design for the neuron microfluidic device using SU-8 and photolithography to create a master mold, or what we simply refer to as a "master". Next, we pour the silicon polymer PDMS on top of the master which is then cured by heating the PDMS to 80&deg;C for 1 hour. The PDMS forms a negative mold of the device. The PDMS is then carefully cut and lifted away from the master. Holes are punched where the reservoirs will be and the excess PDMS trimmed away from the device. Nitrogen is used to blow away any excess debris from the device. At this point the devices are now ready for use and can either bonded to corning No. 1 cover glass with a plasma sterilizer/cleaner or can be reversibly bound to the cover glass by simply placing the device on top of the cover glass. The reversible bonding of the device to glass is covered in a separate video and requires first that the device be sterilized either with 70% ethanol or by autoclaving. Plasma treating sterilizes the devices so no further treatment is necessary. It is, however, important, when plasma-treating the devices, to add liquid to the devices within 10 minutes of the plasma treatment while the surfaces are still hydrophilic. Waiting longer than 10 minutes to add liquid to the device makes it difficult for the liquid to enter the device. The neuron devices are typically plasma-bound to cover glass and 0.5 mg/ml poly-L-lysine (PLL) in pH 8.5 borate buffer is immediately added to the device. After a minimum of 3 hours incubating with PLL, the devices are washed with dH2O water a minimum of 3 times with at least 15 minutes between each wash. Next, the water is removed and fresh media is added to the device. At this point the device is ready for use. It is important to remember at this point to never remove all the media from the device. Always leave media in the main channel.

In this video we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to farbricate a microfluidic device for culturing neurons.

Fabbricazione di un dispositivo a microfluidi per la compartimentazione dei Neuron Soma e assoni

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for ...

Counting Human Neural Stem Cells

Knowledge of the exact number of viable cells in a given volume of a cell suspension is required for many routine tissue culture manipulations, such as plating cells for immunocytochemistry or for cell transfections. This protocol describes a straightforward and fast method for differentiating between live and dead cells and quantifying the cell concentration and total cell number using a hemacytometer. This procedure first requires detaching cells from a growth surface and resuspending them in media. Next, the cells are diluted in a solution of Trypan blue (ideally to a concentration that will give 20-50 cells per quadrant) and placed in the hemacytometer. Finally, averaging the counts of viable cells in several randomly selected quadrants, dividing the average by the volume of one 1 mm2 quadrant (0.1 &mu;l) and multiplying by the dilution factor gives the number of cells per l. Multiplying this cell concentration by the total volume in &mu;l gives the total cell number. This protocol describes counting human neural stem/precursor cells (hNSPCs), but can also be used for many other cell types.

Knowledge of the exact number of viable cells is required for many tissue culture manipulations. This protocol describes how to differentiate between live and dead cells and quantify cells using a hemacytometer. Although it describes counting human neural stem/precursor cells (hNSPCs), it can be used for other cell types.

Conteggio cellule staminali neuronali

Knowledge of the exact number of viable cells in a given volume of a cell suspension is required for many routine tissue culture manipulations, such as ...

Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells

Immunocytochemistry is a very powerful and fairly straightforward method for determining the presence, subcellular localization, and relative abundance of an antigen of interest, most commonly a protein, in cultured cells. This protocol presents an easy-to-follow series of steps that will enable researchers to conserve primary and secondary antibodies while getting high quality, reproducible qualitative and quantitative data out of their staining. There are two aspects of this protocol that help to conserve the volume of antibody necessary for staining. For one, the cells are grown on small, circular coverslips that are placed in wells of a tissue culture plate. After fixation, the cells on coverslips can be removed from the wells of the plate. For antibody staining, the coverslip with cells is inverted onto a small drop of antibody solution on parafilm and is covered with a second piece of parafilm to prevent drying. Using this method, only ~25 &mu;l of antibody solution is needed for each coverslip (or sample) to be stained. This protocol describes immunostaining of human neural stem/precursor cells (hNSPCs), but can be used for many other cell types.

Immunocytochemistry is a powerful method to determine the presence, subcellular localization, and relative abundance of an antigen of interest in cultured cells. This protocol presents an easy-to-follow series of steps that will enable one to conserve antibodies and get the most out of one's staining.

Immunocitochimica: cellule staminali neuronali

Immunocytochemistry is a very powerful and fairly straightforward method for determining the presence, subcellular localization, and relative abundance of ...

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

Un dispositivo a microfluidi con pattern Groove per studiare il comportamento cellulare

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an enabling experimental tool, because it can precisely manipulate fluid flows, enable high-throughput experiments, and generate stable soluble concentration gradients.  Compared to conventional gradient generators, poly(dimethylsiloxane) (PDMS)-based  microfluidic devices can generate stable concentration gradients of growth factors with well-defined profiles.  Here, we developed simple gradient-generating microfluidic devices with three separate inlets.  Three microchannels combined into one microchannel to generate concentration gradients.  The stability and shape of growth factor gradients were confirmed by fluorescein isothyiocyanate (FITC)-dextran with a molecular weight similar to epidermal growth factor (EGF).  Using this microfluidic device, we demonstrated that fibroblasts exposed to concentration gradients of EGF migrated toward higher concentrations.  The directional orientation of cell migration and motility of migrating cells were quantitatively assessed by cell tracking analysis.  Thus, this gradient-generating microfluidic device might be useful for studying and analyzing the behavior of migrating cells.

We describe a protocol for the microfabrication of the gradient-generating microfluidic device that can generate spatial and temporal gradients in well-defined microenvironment. In this approach, the gradient-generating microfluidic device can be used to study directed cell migration, embryogenesis, wound healing, and cancer metastasis.

Un gradiente di generazione del dispositivo Microfluidic di Biologia Cellulare

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an ...

Preparing E18 Cortical Rat Neurons for Compartmentalization in a Microfluidic Device

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously dissected and prepared. The E18 cortex is, upon dissection, immediately dissociated into individual neurons. It is possible to store E18 cortex in Hibernate E buffer containing B27 at 4&deg;C for up to a week before the dissociation is performed. However, there will be a drop in cell viability. Typically we obtain our E18 Cortex fresh. It is transported to the lab in ice cold Calcium free Magnesium free dissection buffer (CMFM). Upon arrival, trypsin is added to the cortex to a final concentration of 0.125%. The cortex is then incubated at 37&deg;C for 8 minutes. DMEM containing 10% FBS is added to the cortex to stop the reaction. The cortex is then centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is removed and 2 ml of Neural Basal Media (NBM) containing 2% B27 (vol/vol) and 0.25% Glutamax (vol/vol) is added to the cortex which is then re-suspended by pipetting up and down. Next, the cortex is triturated with previously fire polished glass pipettes, each with a successive smaller opening. After triturating, the cortex is once again centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is then removed and the cortex pellet re-suspended with 2 ml of NBM containing B27 and Glutamax. The cell suspension is then passed through a 40 um nylon cell strainer. Next the cells are counted. The neurons are now ready for loading into the neuron microfluidic device.

In this video we demonstrate the preparation of E18 Cortical Rat Neurons.

Preparazione E18 neuroni corticali di ratto per compartimentazione in un dispositivo a microfluidi

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously ...

Cell Capture Using a Microfluidic Device

Cattura cellula Utilizzando un dispositivo a microfluidi

Non-plasma Bonding of PDMS for Inexpensive Fabrication of Microfluidic Devices

In this video, we demonstrate how to use the neuron microfluidic device without plasma bonding.  In some cases it may be desirable to reversibly bond devices to the Corning No. 1 cover glass.  This could be due, perhaps, to a plasma cleaner not being available.  In other instances, it may be desirable to remove the device from the glass after the culturing of neurons for certain types of microscopy or for immunostaining, though it is not necessary to remove the device for immunostaining since the neurons can be stained in the device.  Some researchers, however, still prefer to remove the device.  In this case, reversible bonding of the device to the cover glass makes that possible.  There are some disadvantages to non-plasma bonding of the devices in that not as tight of a seal is formed.  In some cases axons may grow under the grooves rather than through them.  Also, because the glass and PDMS are hydrophobic, liquids do not readily enter the device making it necessary at times to force media and other reagents into the device.  Liquids will enter the device via capillary action, but it takes significantly longer as compared to devices that have been plasma bonded.  The plasma cleaner creates temporary hydrophilic charges on the glass and device that facilitate the flow of liquids through the device after bonding within seconds.  For non-plasma bound devices, liquid flow through the devices takes several minutes.  It is also important to note that the devices to be used with non-plasma bonding need to be sterilized first, whereas plasma treated devices do not need to be sterilized prior to use because the plasma cleaner will sterilize them.

In this video we demonstrate how to use the neuron microfluidic device without plasma bonding.

Non plasmatici Incollaggio di PDMS Economico per la Fabbricazione di dispositivi microfluidici

In this video, we demonstrate how to use the neuron microfluidic device without plasma bonding.  In some cases it may be desirable to reversibly bond ...

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the physiological property to generate a wide array of differentiated cell types, including neurons, nerve supporting cells, smooth muscle cells, bone/cartilage cells and melanocytes. EPI-NCSC are easily accessible in the hairy skin and can be isolated as a highly pure population of stem cells. This video provides a detailed protocol for preparing mouse EPI-NCSC cultures from whisker follicles. The whisker pad of an adult mouse is removed, and whisker follicles dissected. The follicles are then cut longitudinally and subsequently transversely above and below the bulge region. The bulge is removed from the collagen capsule and placed in a culture plate. EPI-NCSC start to emigrate from the bulge explants 3 to 4 days later.

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell EPI-NCSC Cultures

Here we show our method to isolate mouse epidermal neural crest stem cells (EPI-NCSC). Technique involves micro-dissecting whisker follicles, isolating the bulge and placeing it into tissue culture. EPI-NCSC start to emigrate from bulge explants onto the substratum within 3 - 4 days.

Topo Epidermal cresta neurale delle cellule staminali (EPI-NCSC) Culture

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the ...