Per iniziare, il giorno zero, preriscaldare il terreno di differenziazione senza siero o il terreno SFD contenente Mescolare 1 citochina a 37 gradi Celsius. Quindi, sotto una cappa sterile per coltura tissutale, aggiungere il terreno integrato con citochine Mix 1 a ciascun pozzetto di una piastra repellente per cellule a sei pozzetti. Per preparare le cellule, aspirare il terreno di coltura da una piastra a sei pozzetti contenente cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo o cellule IPS umane.
Lavarli con DPBS seguito dall'aspirazione del DPBS. Quindi, aggiungere il reagente di dissociazione alle cellule e incubarle a temperatura ambiente per un minuto. Dopo aver aspirato questo reagente di dissociazione, incubare le cellule per altri tre minuti a temperatura ambiente.
Quindi, tocca la piastra contenente le celle 10 volte su ciascun lato per staccare i gruppi di celle. Aggiungere un millilitro di terreno SFD integrato con citochine Mix 1 preriscaldato alle cellule per pozzetto. Utilizzando una pipetta da pascolo, trasferire i cluster di cellule da ciascun pozzetto a un pozzetto della piastra repellente cellulare contenente il terreno con la citochina Mix 1.
Dopo aver introdotto la piastra nell'incubatrice, muoverla avanti e indietro, così come da un lato all'altro, per disperdere il contenuto in modo uniforme e incubarlo per la formazione di corpi embrioidi, o EB. Il giorno successivo, agitare la piastra repellente per cellule contenente gli EB per raccoglierli al centro dei pozzetti. Utilizzando una pipetta Pasteur, trasferire la sospensione EB dai pozzetti a una provetta da centrifuga da 15 millilitri.
Attendere da cinque a 10 minuti affinché gli EB si depositino sul fondo del tubo. Nel frattempo, lavare le piastre repellenti per cellule con acqua sterile o DPBS per rimuovere singole cellule o detriti. Aggiungere due millilitri di terreno SFD integrato con citochine Mix 1 in ciascun pozzetto della piastra.
A questo punto, aspirare delicatamente il surnatante dalla provetta da centrifuga senza rimuovere gli EB. Risospendere gli EB nel volume calcolato del terreno SFD contenente la citochina Mix 1. Aggiungere un millilitro di sospensione EB a ciascun pozzetto della piastra repellente per cellule lavate contenente già due millilitri di terreno.
Incubare la piastra dopo aver disperso gli EB muovendo delicatamente la piastra come accennato in precedenza. Dopo aver raccolto gli EB al centro dei pozzetti, aggiungere il chirone sul lato di ogni pozzetto, evitando il contatto diretto con le cellule, incubare i pozzetti come dimostrato in precedenza. Nei giorni tre e sei di differenziazione, raccogliere gli EB ed eseguire le modifiche ai supporti come dimostrato in precedenza per il primo giorno.
Utilizzare il terreno SFD integrato con citochine Mix 3 il terzo giorno e utilizzare il terreno SFD integrato con citochine Mix 4 il sesto giorno. Dopo aver raccolto e depositato gli EB dalla piastra repellente cellulare in una provetta da centrifuga da 15 millilitri, come dimostrato in precedenza, aspirare il surnatante, quindi aggiungere un millilitro di reagente di dissociazione cellulare per pozzetto di EB raccolto nella provetta per risospendere gli EB. Successivamente, trasferire un millilitro di questa sospensione EB in ciascun pozzetto della piastra repellente per cellule lavata con acqua.
Dopo aver incubato la piastra per 10 minuti nell'incubatore, utilizzare una pipetta P1000 per dissociare gli EB in ciascun pozzetto pipettando delicatamente su e giù non più di 10 volte. Quindi, aggiungere cinque millilitri di tampone di lavaggio per pozzetto di EB dissociati. Raccogli le cellule in una provetta da centrifuga da 50 millilitri facendole passare attraverso un colino da 40 micron.
Dopo aver contato le cellule nella sospensione filtrata, centrifugare le cellule per 10 minuti a 300 g. Risospendere le cellule in 300 microlitri di tampone di lavaggio pipettando delicatamente alcune volte, assicurandosi che non siano presenti grumi. Procedere all'isolamento delle cellule CD34-positive utilizzando un kit di microsfere CD34 secondo le istruzioni del produttore.
Gli EB di buona qualità hanno mostrato un bordo definito entro il secondo giorno di differenziazione e sono apparsi chiari e luminosi quando osservati al microscopio. La presenza di aree più scure indicava la morte cellulare all'interno degli EB. Dopo il trattamento con chirone con concentrazioni variabili il secondo giorno, la quantificazione del numero di cellule CD34-positive all'ottavo giorno di differenziazione ha rivelato la risposta della linea cellulare al trattamento.
La citometria a flusso ha mostrato che l'arricchimento CD34-positivo utilizzando le biglie magnetiche ha fornito circa l'85% di cellule CD34-positive.
