The authors were supported by: a CancerFree KIDS Research Grant, a March of Dimes Basil O&#8217;Connor Starter Scholar Award (#5-FY14-32), a Cincinnati Children&#8217;s Hospital Medical Center (CCHMC) Trustee Grant Award; a CCHMC Research Innovation and Pilot Funding Award; and CCHMC developmental funds. Authors also acknowledge the Capel laboratory for the initial optimization of this technique.

Tutti i topi utilizzati in questi studi erano topi CD-1 ottenuti da Charles River Laboratories. Cultura Precedenti esperimenti sono stati eseguiti su altri ceppi, quali C57BL / 6J (dati non mostrati), ma qualsiasi ceppo può essere utilizzato. Femmine adulte in stato di gravidanza sono stati di circa 2-3 mesi di vita e sono stati sacrificati tramite CO 2 inalazione seguita da dislocazione cervicale e toracotomia bilaterale prima della rimozione embrione. I topi sono stati alloggiati in conformità alle linee guida NIH, e protocolli sperimentali sono stati approvati dalla cura e l&#39;uso degli animali Comitato Istituzionale di Hospital Medical Center di Cincinnati per bambini. 1. Preparazione degli strumenti, terreni di coltura, e piatti <ol><li> Preparare una soluzione di etanolo al 70%. Acqua deionizzata Autoclave (per fare camere umidificati e per rendere / soluzioni diluizione). Sterilizzare strumenti di dissezione (pinze, forbici, e 27 G siringhe ad ago) a spruzzo verso il basso con il 70% di etanolo. </li><li> Preparare10X tampone fosfato salino (PBS) contenente calcio e magnesio (80 g di NaCl, 2 g KCl, 14,4 g di Na 2 HPO 4, 2,4 g KH 2 PO 4, 6,75 ml di 1 M CaCl 2, 3,75 ml di 1 M MgCl 2 ). Mescolare per sciogliere in 1 l di acqua in autoclave sterile e poi filtrare con carta da filtro. Diluire 10 volte con acqua per fare PBS 1X. </li><li> Calore inattivare siero fetale bovino (FBS), a 55 ° C per 30 min e filtro sterilizzare con un filtro a siringa da 0,22 micron. </li><li> Preparare 38 ml 1X terreno di coltura completo (chiamato completo DMEM, cDMEM), costituito da Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), il 10% filtrato diluizione inattivato al calore FBS e 1/100 di penicillina streptomicina magazzino. Questo di solito deve essere usato fresco, ma può essere conservato a 4 ° C per 1 mese. </li><li> Ricostituire il VEGFR tirosina chinasi Inhibitor II (TKI II) in DMSO per una concentrazione scorta di 5 mg / ml, e diluire azione con cDMEM per ottenere una soluzione di lavoro. L&#39;aria finalecentrazione per questo studio è 1.875 mg / ml in cDMEM. Secondo le raccomandazioni della società, soluzioni madre sono stabili per un massimo di 6 mesi a -20 ° C. Per quanto riguarda le soluzioni di lavoro, fare fresco e utilizzare lo stesso giorno. Nota: La concentrazione di questo farmaco nella soluzione di lavoro dovrebbe essere due volte superiore alla concentrazione finale desiderata (dal momento che sarà diluito duplice in droplet). Allo stesso tempo, preparare lo stesso volume di cDMEM contenente lo stesso volume di DMSO per il trattamento &quot;controllo&quot;. </li><li> Preparare i reagenti coda digestione (NaOH 50 mM e 1 M Tris-HCl [pH 8,0]) separatamente in acqua distillata. </li><li> Fare un bilancio dei primer XY PCR 25 micron (XY Forward 5&#39;-TGA AGC TTT TGG CTT TGA G-3 &#39;e XY Reverse 5&#39;-CCG CTG CCA AAT TCT TTG G-3&#39;) insieme in acqua priva di nucleasi. </li><li> Preparare tampone 50X TAE (242 g Trizma Base, 57,1 ml acido acetico glaciale, 100 ml di 0,5 M EDTA, pH 8,5, e aggiungere acqua per 1 L fiil volume finale). Preparare 1X tampone di corsa TAE (20 ml 50X TAE diluito con acqua a 1 L volume totale). </li><li> Per creare una soluzione di 2,5% di agarosio (0,625 g di agarosio, 0,5 ml 50X TAE Buffer, 24,5 ml di acqua), soluzione di agarosio calore nel forno a microonde fino a ebollizione, poi lasciate raffreddare fino a circa 55-65 ° C (in grado di toccare). Una volta fredda, aggiungere 2 ml di 1% soluzione di bromuro di etidio, e versare il gel. ATTENZIONE! Etidio bromuro è un agente mutageno e teratogeno; si prega di utilizzare guanti di nitrile e corretto protocollo di sicurezza durante la manipolazione. In alternativa, possono essere utilizzati altri agenti gel risolvere potenzialmente meno tossici o coloranti. </li><li> Preparare la soluzione di saturazione (PBS con Triton X-100, siero 0,1% 10% fetale bovino [FBS], e il 3% di albumina sierica bovina [ASC]) per immunofluorescenza. </li><li> Preparare la soluzione di lavaggio (PBS con 0,1% Triton X-100, 1% FBS e 3% BSA) per immunofluorescenza. </li><li> Preparare PBTx (PBS con 0,1% Triton X-100) per immunofluorescenza. </li><li> Preparare le camere di incubazione per culture. Riempire grandi piatti (diametro 100 mm) di Petri con 35 ml di acqua in autoclave. Posizionare vicino a dove saranno eseguite dissezione e culture. </li></ol> 2. Isolamento di fetale testicoli da Mus musculus <ol><li> Controllare il mouse femminile per tappi vaginali ogni mattina. Mezzogiorno del giorno in cui viene rilevato il tappo vaginale è considerato E0.5. Eutanasia la femmina incinta mouse E11.5, in modo coerente con i protocolli animali approvati. </li><li> Spray giù addome del mouse con il 70% di etanolo. </li><li> Aprire la pelle del ventre e del peritoneo con un&#39;incisione a forma di V con le forbici fini e tirare indietro lembo di tessuto per esporre gli organi interni. </li><li> Individuare le ovaie ad entrambe le estremità del corno uterino. Utilizzando le forbici, tagliare a dell&#39;ovaio e del tessuto connettivo di separare l&#39;utero contenente gli embrioni dal corpo della madre. </li><li> Aprire la parete uterina tagliando delicatamente il lato opposto della placenta, esponendo i sacchi di tuorlo. Essere attenti a non puncture sacco vitellino per evitare embrioni danneggiare o perdere. </li><li> Tagliare vicino alla placenta per rimuovere le sacche tuorlo-embrione contenente e metterli in un piatto contenente PBS con calcio e magnesio. La presenza di ioni calcio e magnesio contribuirà a molecole di adesione cellula di sostegno per mantenere l&#39;architettura dei tessuti e prevenire il tessuto di attaccarsi agli strumenti di dissezione. </li><li> Con una pinza, togliere il sacco vitellino e amnion dall&#39;embrione perforando con attenzione il sacco vitellino di creare un buco in cui l&#39;embrione può scivolare fuori. Una volta che l&#39;embrione è all&#39;esterno del sacco vitellino, tagliare il cordone ombelicale. </li><li> Da questo punto in avanti, utilizzare un microscopio situato in una cappa coltura tissutale sterili. Togliere la testa di embrione e scartare pizzicando con una pinza su entrambi i lati del collo. </li><li> Rimuovere la coda e riporre in nuova provetta per l&#39;analisi PCR XY per determinare il sesso dell&#39;embrione. Nota: Mentre è ottimale per gonadi coltura più presto possibile dopo la raccolta, è anche posbile togliere DNA coda ed eseguire XX / XY genotipizzazione prima coltura, in modo che il sesso di ciascun embrione è nota e solo il sesso desiderato deve essere coltivato. Mentre la genotipizzazione è stato fatto, gli embrioni possono essere tenuti separati (in modo che possano essere seguiti) a 4 ° C o in ghiaccio fino al momento per la cultura. Un avvertimento è che questo periodo al di fuori delle condizioni di utero o di coltura può potenzialmente influenzare la vitalità della cultura o successivo sviluppo durante la coltura. </li><li> Fissare l&#39;embrione in posizione supina contro il fondo del piatto cultura appuntando le ascelle di embrione con un paio di pinze (solitamente il forcipe tenuto in mano debole). Mantenere queste pinze in atto per tenere l&#39;embrione ancora durante l&#39;intero processo di dissezione. </li><li> Con altro paio di pinze, togliere la pelle che copre l&#39;addome e rimuovere delicatamente il fegato, l&#39;intestino e altri organi per esporre parete posteriore del corpo. </li><li> Come gonadi saranno situati sulla parete di fondo del corpo su entrambi i lati della aorta dorsale,un grande vaso sanguigno che corre lungo la linea mediana del corpo, paletta sotto la cresta urogenitale con una pinza chiuse e rimuovere la cresta urogenitale aprendo le pinze e sollevandolo. Come le gonadi saranno liberamente fissati alla parete, fare attenzione a non tirare troppo in fretta senza togliere queste connessioni o le gonadi possono allungare, causando danni agli organi. </li><li> Spostare la cresta urogenitale in cDMEM in un piatto per acclimatare il tessuto ai media. </li><li> Separare il complesso gonade-mesonefro dal resto della cresta urogenitale con 27 aghi G. Utilizzare un ago per tagliare premendo verso il basso, e utilizzare l&#39;altro per guidare correttamente il tessuto per consentire la separazione ottimale. Evitare di utilizzare un movimento di taglio contro il fondo piatto, come aghi taglienti creerà schegge di plastica che possono attaccare al tessuto. Assicurarsi di mantenere le mesonefro completamente attaccato al gonade. </li></ol> 3. Coltura di gonadi con un inibitore della piccola molecola <ol><li> Impostare due 20 μl pipette a 15 microlitri ciascuno. Tagliare a 1-2 mm fuori da una delle punte barriera pipetta usando una, lametta sterilizzata pulita per il trasferimento delle gonadi e l&#39;aggiunta di controllo cDMEM, mentre l&#39;altra pipetta saranno utilizzati esclusivamente per la droga trattati cDMEM. </li><li> Allineare gonadi con il loro asse lungo parallelo alla punta della pipetta in modo che possano facilmente essere pipettati usando la punta di cut-off. Fare attenzione di gonadi che attaccano all&#39;interno del puntale. </li><li> Etichettare un lato come la goccia di controllo e l&#39;altro come droplet-contenente il farmaco. Solo due gocce possono stare su un coperchio piatto da 35 mm. Assicurarsi che le etichette sui coperchi corrispondono le etichette sulle provette da microcentrifuga-tail-tessuto contenente. </li><li> Pipettare 15 ml di cDMEM contenenti una singola gonade in una goccia nel coperchio di una piccola (35 mm) piatto di coltura (utilizzare solo le palpebre, come i fondi sono troppo alti per adattarsi all&#39;interno di una camera umidificata capsula di Petri). Mettere due gocce-gonadi contenente separati su entrambi i lati del piatto, fr ben separati,uno om un&#39;altra. Controllare al microscopio per garantire che le gonadi sono state trasferite le goccioline. </li><li> Per la goccia designato come il controllo, aggiungere altri 15 ml di cDMEM contenenti DMSO (made in fase 1.5) per fare una goccia con un volume totale di 30 microlitri. Utilizzare solo la pipetta &quot;di controllo&quot;, che non si metterà in contatto il farmaco. </li><li> All&#39;altro droplet (droga campione trattato), aggiungere 15 ml di TKI-II contenente cDMEM fare una gocciolina con un volume totale di 30 microlitri. Usare solo la pipetta designato per i campioni trattati con farmaci. </li><li> Utilizzando la pipetta, sparsi le goccioline in un modello circolare in espansione fino a circa 15-18 mm di diametro e gonade si trova all&#39;incirca a metà. Orientare gonade modo che si trova su un lato e gonade e mesonefro sono facilmente distinguibili. Orientare il polmone in modo che i due lobi distesi. <ol><li> Anche se il diametro delle gocce può variare leggermente, in modo che le gonadi non sono floating e sono tenuti in posizione da tensione superficiale. Assicurarsi che le goccioline non si tocchino tra loro o il lato del coperchio. Senza la tensione superficiale, gli organi cresceranno sul coperchio durante la cultura e appiattire distorcendo organo morfologia. </li></ol></li><li> Posizionare accuratamente il coperchio piatto di coltura contenente goccioline verticalmente sulla superficie dell&#39;acqua nel grande (100 mm) piatto umidificatore. Assicurarsi che non ci siano bolle intrappolate sotto il fondo del coperchio e che sia ben distesi sulla superficie dell&#39;acqua. Non invertire il coperchio e fare attenzione a non lasciare che l&#39;acqua tocca la parte superiore del coperchio dove si trovano le goccioline. </li><li> Per creare una piccola camera umidificata, coprire immediatamente con il coperchio del piatto dell&#39;umidificatore più grande per racchiudere le culture gonade. Agire il più rapidamente possibile per minimizzare l&#39;evaporazione dei media. Assicurarsi che il piatto più piccola ha spazio tra essa e il coperchio del piatto più grande per muoversi liberamente; in caso contrario, condensa può fare un sigillo e bricambio d&#39;aria serratura al tessuto. </li><li> Una volta due piccoli coperchi sono poste nella camera, inserire immediatamente la camera nell&#39;incubatrice. Incubare le culture delle gocce per 48 ore in un umidificata incubatore CO 2 a 37 ° C. </li></ol> 4. Polymerase Chain Reaction per la determinazione del sesso degli embrioni <ol><li> Aggiungere le code embrionali di fondo di un tubo da microcentrifuga da 1,5 ml. </li><li> Aggiungere a ciascuna provetta 200 ml di NaOH 50 mM. </li><li> Posizionare a 95 ° C per 15 minuti o fino a quando il tessuto è completamente sciolto. </li><li> Aggiungere 50 ml di 1 M Tris-HCl e vortice leggermente e brevemente. </li><li> In una provetta da 1,5 ml microcentrifuga, fare un nuovo master mix PCR moltiplicando ogni volume per il numero totale di campioni: 0.5 ml 25 micron soluzione Primer, 2,5 microlitri 10X Taq Buffer, 0,5 microlitri dNTP 10 mm (nucleotidi), 19.3 ml nuclease- acqua gratuita, 0,2 microlitri DNA polimerasi Taq. Mescolare bene. </li><li> Aggiungere 23ml di PCR master mix PCR tubi contenenti 3 ml lisato di code digerito. </li><li> Tubi Flick mescolarli, quindi eseguire una breve centrifuga per portare i campioni al fondo della provetta. </li><li> Eseguire il programma XY (Short) PCR (Tabella 1). </li><li> Caricare i campioni (con 5x colorante) e scala in un gel di agarosio 2,5% in tampone TAE 1X. </li><li> Eseguire l&#39;elettroforesi su gel di agarosio fino bande XX e XY possono essere risolti. </li><li> Immagine il gel con l&#39;immagine cattura la luce UV e. </li><li> Analizzare il vs bande specifiche del cromosoma Y X-specifico cromosoma (cromosoma X = 331 paia di basi [bp] e XY = 302 bp) 13; XY campioni (maschi) avranno due bande di 331 e di 302 bp, mentre i campioni XX (femmina) apparirà come una singola banda 331 bp. </li></ol> 5. Tutta immunofluorescenza Monte Organo Giorno 1: <ol><li> Rimuovere le gonadi della cultura con una pipetta 1000 ml con una punta di cut-off. Se lo si desidera, possono esserecollocato in un piatto di PBS per lavare media e di reagenti. Mettere in PBS in una provetta da 0,5 ml microcentrifuga. Il tubo di dimensioni inferiori conserverà reagenti e rendere più facile per tenere traccia dei campioni nel tubo. <ol><li> Essere sicuri di mantenere il controllo e campioni trattati, così come campioni XX e XY, in tubi separati e rimuoverli dalla cultura con gruppi separati di pipette per evitare la contaminazione potenziale farmaco. </li></ol></li><li> Lavare le gonadi due volte con PBS. Da questo punto in poi, questo protocollo può utilizzare 1X PBS privo di calcio e magnesio. Lavarli, consentono gonadi a depositarsi sul fondo della provetta (per gravità) e quindi rimuovere il liquido sopra. Fare attenzione a non perdere gonadi pipettando troppo vicino a loro. </li><li> Rimuovere il più possibile PBS dal tubo. Aggiungere 250 ml di 4% paraformaldeide in PBS contenente 0,1% Triton X-100, e lasciate incubare O / N a 4 ° C su un agitatore meccanico. In alternativa, questa fissazione può essere fatto per 2 ore a 4 ° C su un agitatore meccanico. ATTENZIONE! Paraforformaldeide è una sostanza tossica, in modo da seguire il protocollo di sicurezza durante la manipolazione. </li></ol> 2 ° giorno: <ol start="4"><li> Sciacquare le gonadi due volte in 250 microlitri PBTx a temperatura ambiente. </li><li> Lavare le gonadi 3 volte con 250 microlitri PBTx per 10 minuti ciascuno a temperatura ambiente su una sedia a dondolo. </li><li> Bloccare le gonadi almeno 1 ora a 250 microlitri soluzione bloccante a temperatura ambiente su una sedia a dondolo. </li><li> Macchiare le gonadi O / N a 4 ° C su una sedia a dondolo in 250 microlitri anticorpo primario diluito in Blocking Solution. </li></ol> 3 ° giorno: <ol start="8"><li> Sciacquare le gonadi due volte in 250 ml Soluzione di Lavaggio. </li><li> Lavare le gonadi 3 volte con 250 microlitri soluzione di lavaggio per 10 minuti ciascuno a RT su una sedia a dondolo. </li><li> Bloccare le gonadi 1 ora a 250 microlitri soluzione bloccante a temperatura ambiente su una sedia a dondolo. </li><li> Coprire il provetta con un foglio di alluminio per proteggere anticorpi secondari fluorescenti dalla luce. </li><li> Incubare le gonadi 2-4 ore a temperatura ambiente su arocker in 250 microlitri anticorpo secondario diluito in Blocking Solution contenente Hoechst 33342. In alternativa, eseguire anticorpo secondario e Hoechst 33342 incubazione O / N a 4 ° C sull&#39;attuatore. </li><li> Sciacquare le gonadi due volte in 250 microlitri PBTx. </li><li> Lavare le gonadi 3 volte in 250 microlitri PBTx per 10 minuti ciascuno a temperatura ambiente su una sedia a dondolo. </li><li> Usando un puntale di cut-off, il trasferimento gonadi su un vetrino con liquido minimo. Rimuovere il liquido in eccesso con la pipetta, ma fare in modo che il tessuto non si asciughi. </li><li> Orientare le gonadi in modo desiderato con una pinza, e aggiungere rapidamente una goccia di supporti di montaggio per montare le gonadi sulla diapositiva. Assicurarsi che le mani di montaggio dei media tutti i campioni completamente; è fondamentale per evitare di lasciare i campioni asciugarsi. </li><li> Utilizzare i coprioggetti (numero 1,5 stile) di dimensioni adeguate per coprire delicatamente i campioni. Lasciate che il montaggio dei media diffusione di contattare l&#39;intera superficie del vetrino. Se necessario, premere molto leggermente sugli angoli del coprioggetto in modo chenon ci sono grosse bolle d&#39;aria. </li><li> Sigillare i vetrini con smalto trasparente intorno ai bordi per ridurre l&#39;evaporazione del mezzo di montaggio. Conservare diapositive montate al buio a 4 ° C. </li></ol>

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Biol. 7, 958-968 (1997).</li><li>Yokonishi, T., Sato, T., Katagiri, K., Ogawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+spermatogenesis+using+an+organ+culture+technique.">In vitro spermatogenesis using an organ culture technique.</a> Methods Mol. Biol. 927, 479-488 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+production+of+functional+sperm+in+cultured+neonatal+mouse+testes.">In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes.</a> Nature. 471, 504-507 (2011).</li><li>Gohbara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+murine+spermatogenesis+in+an+organ+culture+system.">In vitro murine spermatogenesis in an organ culture system.</a> Biol. Reprod. 83, 261-267 (2010).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Questo studio dimostra un intero metodo gocciolina organo ex vivo che ha molte potenziali applicazioni per lo studio dello sviluppo del feto. Questa tecnica può essere utilizzata per più organi, e permette al ricercatore di affrontare questioni biologiche che sono difficili da valutare in vivo utilizzando approcci a causa dell&#39;inaccessibilità di embrioni e potenziale letalità embrionale. Questo metodo di coltura ha ulteriori vantaggi rispetto ad altri approcci in vitro come linee cellu...

La rigenerazione di organi in vivo nell&#39;uomo è molto limitata; di conseguenza, l&#39;ingegneria dei tessuti, lo sviluppo di tessuti e organi da cellule individuali donati da un host, sta diventando una terapia potenziale interessante per la sostituzione degli organi. Tuttavia, per questa strategia terapeutica per avere successo, i fattori e le interazioni cellulari coinvolti nella morfogenesi dell&#39;organo devono essere accuratamente studiati e ben compresi. A causa della incapacità di studiare lo sviluppo di organi specifici con approcci tradizionali, i ricercatori si sono rivolti a embrione intero alternativa o intere culture d&#39;organo. Kalaskar et al. 1 hanno dimostrato che ex vivo cultura tutto l&#39;embriogenesi produce risultati comparabili (nel 58% degli embrioni coltivati) per lo sviluppo nell&#39;utero, suggerendo che ex vivo metodi di coltura sono un&#39;alternativa fattibile per gli studi dell&#39;organogenesi. Un sistema di coltura organo individualizzato, come questo ex vivo droplet sistema di coltura, consente intera analisi organo indipendente dagli effetti sistemici, pur consentendo manipolazione di un percorso di segnalazione specifica o interazioni cellulari tramite aggiunta di reagenti farmacologici o anticorpi. Tradizionalmente, lo studio di sviluppo degli organi fetali è stata limitata alle tecnologie transgeniche e di topi knockout, in aggiunta ai reagenti farmacologici consegnati materna. Tuttavia, ci sono questioni tecniche che coinvolgono queste tecniche e trattamenti in vivo; la maggior parte delle preoccupazioni ruotano attorno gli effetti di influenzare vari organi contemporaneamente che spesso si traduce in letalità embrionale. Un ulteriore problema degli studi di manipolare sviluppo fetale farmacologicamente è l&#39;effetto materno di farmaci in sviluppo embrionale in utero (ad esempio, il metabolismo materno della droga prima che raggiunga l&#39;embrione) e se tali reagenti possono passare attraverso la barriera placentare. La tecnica di tutta la cultura organo descrittaqui è stato adattato da un primo protocollo descritto da Maatouk et al. 2, in cui interi gonadi fetali sono incubati in ex vivo culture gocciolina verticali. Un vantaggio significativo di coltura gonadi fetali è che gli inibitori piccole molecole possono facilmente accedere tutto l&#39;organo per semplice diffusione. . DeFalco et al hanno dimostrato che utilizzando questo metodo ex vivo gocciolina cultura in combinazione con inibitori di piccole molecole può essere usato per studiare processi e interazioni che avvengono durante lo sviluppo delle gonadi 3 segnalazione; questi processi sarebbe difficile per esaminare in vivo a causa di problemi tecnici (ad esempio, il passaggio dei farmaci attraverso la placenta o letalità di incidere più organi che utilizzano approcci genetici e farmacologici). La cultura gocciolina non è solo un miglioramento in alcuni aspetti oltre in utero sperimentazione, ma anche che è un miglioramento rispetto in vitro ed ex visistemi vo pure. L&#39;uso di linee cellulari per studiare morfogenesi è estremamente difficile perché mancano i tipi cellulari diversi, mancano matrice extracellulare (ECM) componenti critici che permettano la formazione di architettura organo, e può esibire effetti in cascate di segnalazione. Anche se l&#39;ingegneria dei tessuti ha introdotto notevoli miglioramenti nella creazione di ponteggi che simulano ECM, la mancanza di conoscenza per quanto riguarda i segnali che sono richieste da ogni tipo di cellula durante l&#39;organogenesi rende difficile costruire un sistema di organi in vitro. Altri sistemi ex vivo sono stati precedentemente stabiliti per studiare organogenesi, o più specificamente morfogenesi, e hanno avuto molto successo per l&#39;imaging dal vivo di organi fetali in agar 4, transwells 5, filtri 6 e altre matrici ponteggio 7,8. Il vantaggio del sistema di coltura goccia è che permette lo studio della morfogenesi, fornendo la capacità di utilizzare meno reattivi, che sono oFten costoso, ma dando anche la tensione superficiale organo, che è importante per la crescita e di segnalazione capacità 9. Nel topo, del testicolo morfogenesi iniziale si svolge tra embrionale (E) mette in scena E11.5 e E13.5; queste fasi comprendono la finestra temporale ottimale per l&#39;esame i fattori che influenzano la differenziazione sesso-specifici. Tra i processi critici che si verificano durante la formazione del testicolo sono la generazione dell&#39;architettura cavo testicolo e la formazione di una rete vascolare specifico testicolo. Utilizzando questo ex vivo tutto l&#39;organo sistema di coltura gocciolina, si è in grado di alterare vascolarizzazione maschio-specifica e inibire testicolo morfogenesi attraverso l&#39;uso di un inibitore piccola molecola che blocca l&#39;attività dei recettori per il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF); VEGF-mediata rimodellamento vascolare è fondamentale per lo sviluppo del testicolo 10-12. Questa tecnica può essere applicata con successo ad altri organi e può bersagliare tempo specificofinestre di sviluppo. Whole-mount di imaging organo permette la visualizzazione di strutture vitali così come i cambiamenti strutturali e cellulari conseguenti alla somministrazione di vari inibitori. È importante sottolineare che questo sistema è vantaggioso in quanto il ricercatore può ignorare i potenziali effetti confondenti di somministrazione del farmaco materna o interruzione sistemico durante vivo strategie genetiche in mirate. Quindi, tutto questo organo ex vivo sistema di coltura delle gocce può migliorare significativamente la capacità di comprendere le interazioni e le segnalazioni che si verificano in particolare all&#39;interno di particolari organi durante lo sviluppo fetale.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glasses: Squares (22 mm x 22 mm, No. 1.5)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-541B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sally Hansen Xtreme Wear Nail Polish, Invisible</td>
			<td>Sally Hansen</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Strip 0.2 mL PCR Tubes &#38; Detached Flat Caps</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>T3218-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman L P1000L, P200L, P20L, P10L, P2L</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10006M, FA10005M, FA10003M, FA10002M, FA10001M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Posi-Click 1.7 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C2170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Posi-Click 0.6 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C2176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;l SHARP Precision Barrier Tips</td>
			<td>Denville</td>
			<td>P1096FR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#956;l SHARP Precision Barrier Tips</td>
			<td>Denville</td>
			<td>P1121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;l SHARP Precision Barrier Tips</td>
			<td>Denville</td>
			<td>P1122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;l SHARP Precision Barrier Tips</td>
			<td>Denville</td>
			<td>P1126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe with 27gauge needles</td>
			<td>BD PrecisionGlide</td>
			<td>309623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>305559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#956;M PES syringe filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grade 3 Qualitative Filter Paper Standard Grade, circle, 185 mm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1003-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primaria 35mm Easy Grip Style Cell Culture Dish</td>
			<td>Falcon/Corning</td>
			<td>353801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes, Sterile (100 mm x 15 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Galaxy 14 S CO2 Incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>CO14S-120-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet</td>
			<td>Nuare</td>
			<td>NU-425-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-centrifuge&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-090-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioExpress GyroMixer Variable XL</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>R-3200-1XL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mastercycler Pro Thermal Cycler with control panel</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>950040015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMZ445 stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiImage Light Cabinet with AlphaEase Software</td>
			<td>Alpha Innotech Corporation</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute 200 proof Ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP2818-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate (Dibasic MW 142) Na2HPO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S374-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate (Monobasic MW 136) KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5379-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S671-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2393-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5670-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion Nuclease-Free Water</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9938&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY PCR Primer&#160;</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A38-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP2482-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Ethidium bromide solution</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1302-10</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>E-3120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>367176-2.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Set, 100 mM Solutions</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Choice Taq polymerase with 10x Buffer</td>
			<td>Denville</td>
			<td>CB-4050-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>O4042-500</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluorMount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Chloride (HCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A144212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA), powder, Fraction V, Heat shock isolation</td>
			<td>Bioexpress</td>
			<td>0332-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS), triple 100-nm filtered</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-600-511</td>
			<td>Heat-inactivate before using</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Use at 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO), Hybri-max, sterile-filtered</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGFR Tyrosine Kinase Inhibitor II - CAS 269390-69-4 - Calbiochem</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>676481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Sox9 Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5535</td>
			<td>Use at dilution: 1:4,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Anti-Mouse PECAM1 (CD31) Antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553370</td>
			<td>Use at dilution: 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9661S</td>
			<td>Use at dilution: 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat E-cadherin / CDH1 Antibody (ECCD-2)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13-1900</td>
			<td>Use at dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 3342, trihydrochloride, trihydrate</td>
			<td>Invitrogen (Molecular Probes)</td>
			<td>H1399</td>
			<td>Use at 2ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>712-165-153</td>
			<td>Use at dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>712-605-153</td>
			<td>Use at dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A31572</td>
			<td>Use at dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Use at dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21208</td>
			<td>Use at dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A31573</td>
			<td>Use at dilution: 1:500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using ex vivo upright droplet cultures of whole fetal organs to study developmental processes during mouse organogenesis

Indagare organogenesis in utero è un processo tecnicamente impegnativo in mammiferi placentati a causa dell&#39;inaccessibilità di reagenti di embrioni che si sviluppano all&#39;interno dell&#39;utero. Un metodo di coltura delle gocce di nuova concezione ex vivo verticale fornisce una valida alternativa a studi effettuati in utero. L&#39;ex vivo cultura gocciolina offre la possibilità di esaminare e manipolare interazioni cellulari e vie di segnalazione diverse attraverso l&#39;uso di vari composti di blocco e attivazione; Inoltre, gli effetti di vari reagenti farmacologiche sullo sviluppo di organi specifici possono essere studiati senza effetti collaterali indesiderati di somministrazione di farmaci sistemici in utero. Rispetto ad altri sistemi in vitro, la cultura gocciolina consente non solo la capacità di studiare le interazioni tridimensionale morfogenesi e cellula-cellula, che non può essere riprodotto in linee cellulari di mammifero, ma richiede anche molto meno reagents di altri ex vivo e in vitro. protocolli Questo documento dimostra mouse corretta fetale dissezione organo e verticali tecniche di coltura gocciolina, seguito da tutta immunofluorescenza organo per dimostrare l&#39;efficacia del metodo. La gocciolina metodo di coltura ex vivo permette la formazione di architettura organo paragonabile a quello osservato in vivo e può essere utilizzato per studiare processi altrimenti difficili da studio causa letalità embrionale in modelli in vivo. Come sistema domanda di modello, un inibitore piccola molecola sarà utilizzato per sondare il ruolo della vascolarizzazione nella morfogenesi testicolare. Questo droplet metodo di coltura ex vivo è espandibile fino a altri organi fetali, come polmone e potenzialmente altri, anche se ogni organo deve essere ampiamente studiata per determinare eventuali modifiche organo-specifiche al protocollo. Questo sistema di coltura di organi fornisce la flessibilità nella sperimentazione con organi fetali, e risultati richiederlod utilizzando questa tecnica aiuterà i ricercatori Acquisire conoscenze in sviluppo del feto.

L&#39;ex vivo cultura gocciolina permette di manipolare interi organi, come la gonade, per studiare le interazioni e le dinamiche cellulari. La Figura 1 mostra in modo graduale come preparare una cultura E11.5 gonadica goccia. I primi passi nel protocollo coltura comprendono la rimozione iniziale del utero-embrione contenente dal mouse madre (Figura 1A e 1B). Dopo la rimozione dell&#39;utero dalla madre, la parete uterina viene tagliato e gli embrioni vengono liberati dal sacco...

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Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

The&#160;ex vivo&#160;upright droplet culture is an alternative to current&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo&#160;experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.

Utilizzando<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Upright Droplet Culture di interi organi fetali per studiare i processi evolutivi durante mouse Organogenesi

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

12.4K Views.  Cincinnati Children's Hospital Medical Center. The ex vivo upright droplet culture is an alternative to current in vitro and in vivo experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.

Video: Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

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The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head and heart progenitor cell development with pharyngeal arches (also known as branchial arches) ex vivo. Using this method, we have recently described that the second pharyngeal arch contains self-renewing heart progenitors and serves as a microenvironment for expansion of the progenitors during mouse heart development. The progenitor cells remain undifferentiated and expansive inside the arch, but quickly become functional cardiomyocytes as they migrate out of the arch. We also reported that first pharyngeal arch contains muscle progenitors giving rise to myotubes after leaving the arch. Here, we demonstrate the procedure for the dissection and ex vivo culture of first and second pharyngeal arches from developing mouse embryos. The method enables one to study head and heart progenitor/muscle development, including cardiomyocyte and myotube formation in detail ex vivo.

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Here, we present a protocol to culture pharyngeal arches to study the biology of heart and muscle progenitor cells and their microenvironment.

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The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, postnatal, and adult life. In addition, most differentiated neurons possess primary cilia that house signaling receptors, such as G-protein-coupled receptors, and signaling molecules, such as adenylyl cyclases. The primary cilium determines the activity of multiple developmental pathways, including the sonic hedgehog pathway during embryonic neuronal development, and also functions in promoting compartmentalized subcellular signaling during adult neuronal function. Unsurprisingly, defects in primary cilium biogenesis and function have been linked to developmental anomalies of the brain, central obesity, and learning and memory deficits. Thus, it is imperative to study primary cilium biogenesis and ciliary trafficking in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. However, culturing methods for primary neurons require considerable expertise and are not amenable to freeze-thaw cycles. In this protocol, we discuss culturing methods for mixed populations of neural stem/progenitor cells using primary neurospheres. The neurosphere-based culturing methods provide the combined benefits of studying primary neural stem/progenitor cells: amenability to multiple passages and freeze-thaw cycles, differentiation potential into neurons/glia, and transfectability. Importantly, we determined that neurosphere-derived neural stem/progenitor cells and differentiated neurons are ciliated in culture and localize signaling molecules relevant to ciliary function in these compartments. Utilizing these cultures, we further describe methods to study ciliogenesis and ciliary trafficking in neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. These neurosphere-based methods allow us to study cilia-regulated cellular pathways, including G-protein-coupled receptor and sonic hedgehog signaling, in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons.

The primary cilium is fundamentally important in neural progenitor cell proliferation, neuronal differentiation, and adult neuronal function. Here, we describe a method to study ciliogenesis and the trafficking of signaling proteins to cilia in neural stem/progenitor cells and differentiated neurons using primary neurosphere cultures.

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Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, especially, in plant reproductive biology. However, plant morphological, anatomical, and ultrastructural analyses traditionally involve time-consuming embedding and sectioning procedures for bright field, scanning, and electron microscopy. Recent progress in confocal fluorescence microscopy, state-of-the-art 3-D computer-aided microscopic analyses, and the continuous refinement of molecular techniques to be used on minimally processed whole-mount specimens, has led to an increased demand for developing efficient and minimal sample processing techniques. In this protocol, we describe techniques for properly dissecting Arabidopsis flowers and siliques, basic clearing techniques, and some staining procedures for whole-mount observations of reproductive structures.

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Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound (30/45MHZ) System

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular mechanisms of CHDs is&#160;crucial for inventing new preventive and therapeutic strategies. Mutant mouse models are powerful tools to discover new&#160;mechanisms&#160;and environmental stress modifiers that drive cardiac development and their potential&#160;alteration in CHDs. However, efforts to establish the causality of these putative contributors have been limited to histological&#160;and molecular studies&#160;in non-survival animal experiments, in which&#160;monitoring the key physiological and hemodynamic parameters is&#160;often absent. Live imaging technology has become an essential tool to establish the&#160;etiology of CHDs. In particular,&#160;ultrasound imaging can be used prenatally without surgically exposing the fetuses,&#160;allowing maintaining&#160;their baseline physiology while monitoring the impact of environmental stress&#160;on the hemodynamic and structural aspects of cardiac chamber development. Herein, we use the High-Frequency Ultrasound (30/45)&#160;system to examine the cardiovascular system in fetal mice at E18.5 in utero at the baseline and in response to prenatal hypoxia exposure. We demonstrate the feasibility of the system to measure cardiac chamber size, morphology, ventricular function, fetal heart rate, and umbilical artery flow indices, and their alterations in fetal mice exposed to systemic chronic hypoxia in utero in real time.

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound 30/45MHZ System

High-frequency ultrasound imaging of the fetal mouse has improved imaging resolution and can provide precise non-invasive characterization of cardiac development and structural defects. The protocol outlined herein is designed to perform real-time fetal mice echocardiography in vivo.

Fetali del Mouse cardiovascolari Imaging mediante un sistema a ultrasuoni ad alta frequenza (30 / 45MHZ)

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular ...

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. Moreover, although existing culture techniques allow biochemical perturbations, these methods do not provide a means to study the effects of mechanical force and tissue stiffness during development of the inner ear sensory organs. Here we describe a method for three-dimensional organotypic culture of the intact murine utricle and cochlea that overcomes these limitations. The technique for adjustment of a three-dimensional matrix stiffness described here permits manipulation of the elastic force opposing tissue growth. This method can therefore be used to study the role of mechanical forces during inner ear development. Additionally, the cultures permit virus-mediated gene delivery, which can be used for gain- and loss-of-function experiments. This culture method preserves innate hair cells and supporting cells and serves as a potentially superior alternative to the traditional two-dimensional culture of vestibular and auditory sensory organs.

Three-dimensional organotypic cultures of the murine utricle and cochlea in optically clear collagen I gels preserve innate tissue morphology, allow for mechanical stimulation through adjustment of matrix stiffness, and permit virus-mediated gene delivery.

Colture organotipiche tridimensionale degli organi sensoriali uditivi e vestibolari

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by Sertoli cell junctions at the blood-testis barrier (BTB), which is the tightest tissue barrier in the mammalian body and segregates the seminiferous epithelium into two compartments, a basal and an adluminal. The BTB creates a unique microenvironment for germ cells in meiosis I/II and for the development of postmeiotic spermatids into spermatozoa via spermiogenesis. Here, we describe a reliable assay to monitor BTB integrity of mouse testis in vivo. An intact BTB blocks the diffusion of FITC-conjugated inulin from the basal to the apical compartment of the seminiferous tubules. This technique is suitable for studying gene candidates, viruses, or environmental toxicants that may affect BTB function or integrity, with an easy procedure and a minimal requirement of surgical skills compared to alternative methods.

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Here, we present a protocol to assess the blood-testis barrier integrity by injecting inulin-FITC into testes. This is an efficient in vivo method to study blood-testis barrier integrity that can be compromised by genetic and environmental elements.

Un metodo In Vivo per studiare l'integrità della barriera ematotesticolare di Mouse

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during heart development using ventricular specific fluorescent reporter knock-in mice (MLC-2v-tdTomato mice). Heart development involves a linear heart tube formation, the heart tube looping, and four chamber septation. These complex processes are highly conserved in all vertebrates. The mouse embryonic heart has been widely used for heart developmental studies. However, due to their extremely small size, dissecting mouse embryonic hearts is technically challenging. In addition, visualization of cardiac chamber formation often needs in situ hybridization, beta-galactosidase staining using LacZ reporter mice, or immunostaining of sectioned embryonic hearts. Here, we describe how to dissect mouse embryonic hearts and directly visualize ventricular chamber formation of MLC-2v-tdTomato mice using whole mount epifluorescent microscopy. With this method, it is possible to directly examine heart tube formation and looping, and four chamber formation without further experimental manipulation of mouse embryos. Although the MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mouse line is used in this protocol as an example, this protocol can be applied to other heart-specific fluorescent reporter transgenic mouse lines.

We present the protocols to examine mouse heart development using whole mount epifluorescent microscopy on mouse embryos dissected from ventricular specific MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mice. This method allows us to directly visualize each stage of the ventricular formation during mouse heart development without labor-intensive histochemical methods.

Analisi della camera cardiaca sviluppo durante l'embriogenesi del Mouse utilizzando l'intero Monte epifluorescenza

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Human Ex vivo Wound Model and Whole-Mount Staining Approach to Accurately Evaluate Skin Repair

Chronic non-healing wounds, which primarily affect the elderly and diabetic, are a significant area of clinical unmet need. Unfortunately, current chronic wound treatments are inadequate, while available pre-clinical models poorly predict the clinical efficacy of new therapies. Here we describe a high throughput, pre-clinical model to assess multiple aspects of the human skin repair response. Partial thickness wounds were created in human ex vivo skin and cultured across a healing time course. Skin wound biopsies were collected in fixative for the whole-mount staining procedure. Fixed samples were blocked and incubated in primary antibody, with detection achieved via fluorescently conjugated secondary antibody. Wounds were counterstained and imaged via confocal microscopy before calculating percentage wound closure (re-epithelialization) in each biopsy. Applying this protocol, we reveal that 2 mm excisional wounds created in healthy donor skin are fully re-epithelialized by day 4-5 post-wounding. On the contrary, closure rates of diabetic skin wounds are significantly reduced, accompanied by perturbed barrier reformation. Combining human skin wounding with a novel whole-mount staining approach allows a rapid and reproducible method to quantify ex vivo wound repair. Collectively, this protocol provides a valuable human platform to evaluate the effectiveness of potential wound therapies, transforming pre-clinical testing and validation.

Here we demonstrate an optimized technique for assessing wound repair using ex vivo human skin combined with a whole-mount staining approach. This methodology provides a pre-clinical platform for the evaluation of potential wound therapies.

Modello di ferita umana ex vivo e approccio di colorazione a montaggio intero per valutare con precisione la riparazione della pelle

Chronic non-healing wounds, which primarily affect the elderly and diabetic, are a significant area of clinical unmet need. Unfortunately, current chronic ...

Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis

Postimplantation mammalian embryo culture methods have been generally inefficient and limited to brief periods after dissection out of the uterus. Platforms have been recently developed for highly robust and prolonged ex utero culture of mouse embryos from egg-cylinder stages until advanced organogenesis. These platforms enable appropriate and faithful development of pregastrulating embryos (E5.5) until the hind limb formation stage (E11). Late gastrulating embryos (E7.5) are grown in rotating bottles in these settings, while extended culture from pregastrulation stages (E5.5 or E6.5) requires a combination of static and rotating bottle cultures. In addition, sensitive regulation of O2 and CO2 concentration, gas pressure, glucose levels, and the use of a specific ex utero culture medium are critical for proper embryo development. Here, a detailed step-by-step protocol for extended ex utero mouse embryo culture is provided. The ability to grow normal mouse embryos ex utero from gastrulation to organogenesis represents a valuable tool for characterizing the effect of different experimental perturbations during embryonic development.

Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis

An enhanced platform for whole-embryo culture allows continuous and robust ex utero development of postimplantation mouse embryos for up to six days, from pregastrulation stages until advanced organogenesis. In this protocol, we detail the standard procedure for successful embryo culture using static plates and rotating bottle systems.

Ex Utero Coltura di embrioni di topo dalla pregastrulazione all'organogenesi avanzata

Postimplantation mammalian embryo culture methods have been generally inefficient and limited to brief periods after dissection out of the uterus. ...

Isolation of Whole Cell Protein Lysates from Mouse Facial Processes and Cultured Palatal Mesenchyme Cells for Phosphoprotein Analysis

Mammalian craniofacial development is a complex morphological process during which multiple cell populations coordinate to generate the frontonasal skeleton. These morphological changes are initiated and sustained through diverse signaling interactions, which often include protein phosphorylation by kinases. Here, two examples of physiologically-relevant contexts in which to study phosphorylation of proteins during mammalian craniofacial development are provided: mouse facial processes, in particular E11.5 maxillary processes, and cultured mouse embryonic palatal mesenchyme cells derived from E13.5 secondary palatal shelves. To overcome the common barrier of dephosphorylation during protein isolation, adaptations and modifications to standard laboratory methods that allow for isolation of phosphoproteins are discussed. Additionally, best practices are provided for proper analysis and quantification of phosphoproteins following western blotting of whole cell protein lysates. These techniques, particularly in combination with pharmacological inhibitors and/or murine genetic models, can be used to gain greater insight into the dynamics and roles of various phosphoproteins active during craniofacial development.

The protocol presents a method for isolating whole cell protein lysates from dissected mouse embryo facial processes or cultured mouse embryonic palatal mesenchyme cells and performing subsequent western blotting to assess phosphorylated protein levels.

Isolamento di lisati proteici a cellule intere da processi facciali di topo e cellule mesenchimali palatali coltivate per l'analisi delle fosfoproteine

Mammalian craniofacial development is a complex morphological process during which multiple cell populations coordinate to generate the frontonasal ...