Name: using ex vivo upright droplet cultures of whole fetal organs to study developmental processes during mouse organogenesis
Uploaded: 2015-10-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
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The authors were supported by: a CancerFree KIDS Research Grant, a March of Dimes Basil O&#8217;Connor Starter Scholar Award (#5-FY14-32), a Cincinnati Children&#8217;s Hospital Medical Center (CCHMC) Trustee Grant Award; a CCHMC Research Innovation and Pilot Funding Award; and CCHMC developmental funds. Authors also acknowledge the Capel laboratory for the initial optimization of this technique.

Tutti i topi utilizzati in questi studi erano topi CD-1 ottenuti da Charles River Laboratories. Cultura Precedenti esperimenti sono stati eseguiti su altri ceppi, quali C57BL / 6J (dati non mostrati), ma qualsiasi ceppo può essere utilizzato. Femmine adulte in stato di gravidanza sono stati di circa 2-3 mesi di vita e sono stati sacrificati tramite CO 2 inalazione seguita da dislocazione cervicale e toracotomia bilaterale prima della rimozione embrione. I topi sono stati alloggiati in conformità alle linee guida NIH, e protocolli sperimentali sono stati approvati dalla cura e l&#39;uso degli animali Comitato Istituzionale di Hospital Medical Center di Cincinnati per bambini. 1. Preparazione degli strumenti, terreni di coltura, e piatti <ol><li> Preparare una soluzione di etanolo al 70%. Acqua deionizzata Autoclave (per fare camere umidificati e per rendere / soluzioni diluizione). Sterilizzare strumenti di dissezione (pinze, forbici, e 27 G siringhe ad ago) a spruzzo verso il basso con il 70% di etanolo. </li><li> Preparare10X tampone fosfato salino (PBS) contenente calcio e magnesio (80 g di NaCl, 2 g KCl, 14,4 g di Na 2 HPO 4, 2,4 g KH 2 PO 4, 6,75 ml di 1 M CaCl 2, 3,75 ml di 1 M MgCl 2 ). Mescolare per sciogliere in 1 l di acqua in autoclave sterile e poi filtrare con carta da filtro. Diluire 10 volte con acqua per fare PBS 1X. </li><li> Calore inattivare siero fetale bovino (FBS), a 55 ° C per 30 min e filtro sterilizzare con un filtro a siringa da 0,22 micron. </li><li> Preparare 38 ml 1X terreno di coltura completo (chiamato completo DMEM, cDMEM), costituito da Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), il 10% filtrato diluizione inattivato al calore FBS e 1/100 di penicillina streptomicina magazzino. Questo di solito deve essere usato fresco, ma può essere conservato a 4 ° C per 1 mese. </li><li> Ricostituire il VEGFR tirosina chinasi Inhibitor II (TKI II) in DMSO per una concentrazione scorta di 5 mg / ml, e diluire azione con cDMEM per ottenere una soluzione di lavoro. L&#39;aria finalecentrazione per questo studio è 1.875 mg / ml in cDMEM. Secondo le raccomandazioni della società, soluzioni madre sono stabili per un massimo di 6 mesi a -20 ° C. Per quanto riguarda le soluzioni di lavoro, fare fresco e utilizzare lo stesso giorno. Nota: La concentrazione di questo farmaco nella soluzione di lavoro dovrebbe essere due volte superiore alla concentrazione finale desiderata (dal momento che sarà diluito duplice in droplet). Allo stesso tempo, preparare lo stesso volume di cDMEM contenente lo stesso volume di DMSO per il trattamento &quot;controllo&quot;. </li><li> Preparare i reagenti coda digestione (NaOH 50 mM e 1 M Tris-HCl [pH 8,0]) separatamente in acqua distillata. </li><li> Fare un bilancio dei primer XY PCR 25 micron (XY Forward 5&#39;-TGA AGC TTT TGG CTT TGA G-3 &#39;e XY Reverse 5&#39;-CCG CTG CCA AAT TCT TTG G-3&#39;) insieme in acqua priva di nucleasi. </li><li> Preparare tampone 50X TAE (242 g Trizma Base, 57,1 ml acido acetico glaciale, 100 ml di 0,5 M EDTA, pH 8,5, e aggiungere acqua per 1 L fiil volume finale). Preparare 1X tampone di corsa TAE (20 ml 50X TAE diluito con acqua a 1 L volume totale). </li><li> Per creare una soluzione di 2,5% di agarosio (0,625 g di agarosio, 0,5 ml 50X TAE Buffer, 24,5 ml di acqua), soluzione di agarosio calore nel forno a microonde fino a ebollizione, poi lasciate raffreddare fino a circa 55-65 ° C (in grado di toccare). Una volta fredda, aggiungere 2 ml di 1% soluzione di bromuro di etidio, e versare il gel. ATTENZIONE! Etidio bromuro è un agente mutageno e teratogeno; si prega di utilizzare guanti di nitrile e corretto protocollo di sicurezza durante la manipolazione. In alternativa, possono essere utilizzati altri agenti gel risolvere potenzialmente meno tossici o coloranti. </li><li> Preparare la soluzione di saturazione (PBS con Triton X-100, siero 0,1% 10% fetale bovino [FBS], e il 3% di albumina sierica bovina [ASC]) per immunofluorescenza. </li><li> Preparare la soluzione di lavaggio (PBS con 0,1% Triton X-100, 1% FBS e 3% BSA) per immunofluorescenza. </li><li> Preparare PBTx (PBS con 0,1% Triton X-100) per immunofluorescenza. </li><li> Preparare le camere di incubazione per culture. Riempire grandi piatti (diametro 100 mm) di Petri con 35 ml di acqua in autoclave. Posizionare vicino a dove saranno eseguite dissezione e culture. </li></ol> 2. Isolamento di fetale testicoli da Mus musculus <ol><li> Controllare il mouse femminile per tappi vaginali ogni mattina. Mezzogiorno del giorno in cui viene rilevato il tappo vaginale è considerato E0.5. Eutanasia la femmina incinta mouse E11.5, in modo coerente con i protocolli animali approvati. </li><li> Spray giù addome del mouse con il 70% di etanolo. </li><li> Aprire la pelle del ventre e del peritoneo con un&#39;incisione a forma di V con le forbici fini e tirare indietro lembo di tessuto per esporre gli organi interni. </li><li> Individuare le ovaie ad entrambe le estremità del corno uterino. Utilizzando le forbici, tagliare a dell&#39;ovaio e del tessuto connettivo di separare l&#39;utero contenente gli embrioni dal corpo della madre. </li><li> Aprire la parete uterina tagliando delicatamente il lato opposto della placenta, esponendo i sacchi di tuorlo. Essere attenti a non puncture sacco vitellino per evitare embrioni danneggiare o perdere. </li><li> Tagliare vicino alla placenta per rimuovere le sacche tuorlo-embrione contenente e metterli in un piatto contenente PBS con calcio e magnesio. La presenza di ioni calcio e magnesio contribuirà a molecole di adesione cellula di sostegno per mantenere l&#39;architettura dei tessuti e prevenire il tessuto di attaccarsi agli strumenti di dissezione. </li><li> Con una pinza, togliere il sacco vitellino e amnion dall&#39;embrione perforando con attenzione il sacco vitellino di creare un buco in cui l&#39;embrione può scivolare fuori. Una volta che l&#39;embrione è all&#39;esterno del sacco vitellino, tagliare il cordone ombelicale. </li><li> Da questo punto in avanti, utilizzare un microscopio situato in una cappa coltura tissutale sterili. Togliere la testa di embrione e scartare pizzicando con una pinza su entrambi i lati del collo. </li><li> Rimuovere la coda e riporre in nuova provetta per l&#39;analisi PCR XY per determinare il sesso dell&#39;embrione. Nota: Mentre è ottimale per gonadi coltura più presto possibile dopo la raccolta, è anche posbile togliere DNA coda ed eseguire XX / XY genotipizzazione prima coltura, in modo che il sesso di ciascun embrione è nota e solo il sesso desiderato deve essere coltivato. Mentre la genotipizzazione è stato fatto, gli embrioni possono essere tenuti separati (in modo che possano essere seguiti) a 4 ° C o in ghiaccio fino al momento per la cultura. Un avvertimento è che questo periodo al di fuori delle condizioni di utero o di coltura può potenzialmente influenzare la vitalità della cultura o successivo sviluppo durante la coltura. </li><li> Fissare l&#39;embrione in posizione supina contro il fondo del piatto cultura appuntando le ascelle di embrione con un paio di pinze (solitamente il forcipe tenuto in mano debole). Mantenere queste pinze in atto per tenere l&#39;embrione ancora durante l&#39;intero processo di dissezione. </li><li> Con altro paio di pinze, togliere la pelle che copre l&#39;addome e rimuovere delicatamente il fegato, l&#39;intestino e altri organi per esporre parete posteriore del corpo. </li><li> Come gonadi saranno situati sulla parete di fondo del corpo su entrambi i lati della aorta dorsale,un grande vaso sanguigno che corre lungo la linea mediana del corpo, paletta sotto la cresta urogenitale con una pinza chiuse e rimuovere la cresta urogenitale aprendo le pinze e sollevandolo. Come le gonadi saranno liberamente fissati alla parete, fare attenzione a non tirare troppo in fretta senza togliere queste connessioni o le gonadi possono allungare, causando danni agli organi. </li><li> Spostare la cresta urogenitale in cDMEM in un piatto per acclimatare il tessuto ai media. </li><li> Separare il complesso gonade-mesonefro dal resto della cresta urogenitale con 27 aghi G. Utilizzare un ago per tagliare premendo verso il basso, e utilizzare l&#39;altro per guidare correttamente il tessuto per consentire la separazione ottimale. Evitare di utilizzare un movimento di taglio contro il fondo piatto, come aghi taglienti creerà schegge di plastica che possono attaccare al tessuto. Assicurarsi di mantenere le mesonefro completamente attaccato al gonade. </li></ol> 3. Coltura di gonadi con un inibitore della piccola molecola <ol><li> Impostare due 20 μl pipette a 15 microlitri ciascuno. Tagliare a 1-2 mm fuori da una delle punte barriera pipetta usando una, lametta sterilizzata pulita per il trasferimento delle gonadi e l&#39;aggiunta di controllo cDMEM, mentre l&#39;altra pipetta saranno utilizzati esclusivamente per la droga trattati cDMEM. </li><li> Allineare gonadi con il loro asse lungo parallelo alla punta della pipetta in modo che possano facilmente essere pipettati usando la punta di cut-off. Fare attenzione di gonadi che attaccano all&#39;interno del puntale. </li><li> Etichettare un lato come la goccia di controllo e l&#39;altro come droplet-contenente il farmaco. Solo due gocce possono stare su un coperchio piatto da 35 mm. Assicurarsi che le etichette sui coperchi corrispondono le etichette sulle provette da microcentrifuga-tail-tessuto contenente. </li><li> Pipettare 15 ml di cDMEM contenenti una singola gonade in una goccia nel coperchio di una piccola (35 mm) piatto di coltura (utilizzare solo le palpebre, come i fondi sono troppo alti per adattarsi all&#39;interno di una camera umidificata capsula di Petri). Mettere due gocce-gonadi contenente separati su entrambi i lati del piatto, fr ben separati,uno om un&#39;altra. Controllare al microscopio per garantire che le gonadi sono state trasferite le goccioline. </li><li> Per la goccia designato come il controllo, aggiungere altri 15 ml di cDMEM contenenti DMSO (made in fase 1.5) per fare una goccia con un volume totale di 30 microlitri. Utilizzare solo la pipetta &quot;di controllo&quot;, che non si metterà in contatto il farmaco. </li><li> All&#39;altro droplet (droga campione trattato), aggiungere 15 ml di TKI-II contenente cDMEM fare una gocciolina con un volume totale di 30 microlitri. Usare solo la pipetta designato per i campioni trattati con farmaci. </li><li> Utilizzando la pipetta, sparsi le goccioline in un modello circolare in espansione fino a circa 15-18 mm di diametro e gonade si trova all&#39;incirca a metà. Orientare gonade modo che si trova su un lato e gonade e mesonefro sono facilmente distinguibili. Orientare il polmone in modo che i due lobi distesi. <ol><li> Anche se il diametro delle gocce può variare leggermente, in modo che le gonadi non sono floating e sono tenuti in posizione da tensione superficiale. Assicurarsi che le goccioline non si tocchino tra loro o il lato del coperchio. Senza la tensione superficiale, gli organi cresceranno sul coperchio durante la cultura e appiattire distorcendo organo morfologia. </li></ol></li><li> Posizionare accuratamente il coperchio piatto di coltura contenente goccioline verticalmente sulla superficie dell&#39;acqua nel grande (100 mm) piatto umidificatore. Assicurarsi che non ci siano bolle intrappolate sotto il fondo del coperchio e che sia ben distesi sulla superficie dell&#39;acqua. Non invertire il coperchio e fare attenzione a non lasciare che l&#39;acqua tocca la parte superiore del coperchio dove si trovano le goccioline. </li><li> Per creare una piccola camera umidificata, coprire immediatamente con il coperchio del piatto dell&#39;umidificatore più grande per racchiudere le culture gonade. Agire il più rapidamente possibile per minimizzare l&#39;evaporazione dei media. Assicurarsi che il piatto più piccola ha spazio tra essa e il coperchio del piatto più grande per muoversi liberamente; in caso contrario, condensa può fare un sigillo e bricambio d&#39;aria serratura al tessuto. </li><li> Una volta due piccoli coperchi sono poste nella camera, inserire immediatamente la camera nell&#39;incubatrice. Incubare le culture delle gocce per 48 ore in un umidificata incubatore CO 2 a 37 ° C. </li></ol> 4. Polymerase Chain Reaction per la determinazione del sesso degli embrioni <ol><li> Aggiungere le code embrionali di fondo di un tubo da microcentrifuga da 1,5 ml. </li><li> Aggiungere a ciascuna provetta 200 ml di NaOH 50 mM. </li><li> Posizionare a 95 ° C per 15 minuti o fino a quando il tessuto è completamente sciolto. </li><li> Aggiungere 50 ml di 1 M Tris-HCl e vortice leggermente e brevemente. </li><li> In una provetta da 1,5 ml microcentrifuga, fare un nuovo master mix PCR moltiplicando ogni volume per il numero totale di campioni: 0.5 ml 25 micron soluzione Primer, 2,5 microlitri 10X Taq Buffer, 0,5 microlitri dNTP 10 mm (nucleotidi), 19.3 ml nuclease- acqua gratuita, 0,2 microlitri DNA polimerasi Taq. Mescolare bene. </li><li> Aggiungere 23ml di PCR master mix PCR tubi contenenti 3 ml lisato di code digerito. </li><li> Tubi Flick mescolarli, quindi eseguire una breve centrifuga per portare i campioni al fondo della provetta. </li><li> Eseguire il programma XY (Short) PCR (Tabella 1). </li><li> Caricare i campioni (con 5x colorante) e scala in un gel di agarosio 2,5% in tampone TAE 1X. </li><li> Eseguire l&#39;elettroforesi su gel di agarosio fino bande XX e XY possono essere risolti. </li><li> Immagine il gel con l&#39;immagine cattura la luce UV e. </li><li> Analizzare il vs bande specifiche del cromosoma Y X-specifico cromosoma (cromosoma X = 331 paia di basi [bp] e XY = 302 bp) 13; XY campioni (maschi) avranno due bande di 331 e di 302 bp, mentre i campioni XX (femmina) apparirà come una singola banda 331 bp. </li></ol> 5. Tutta immunofluorescenza Monte Organo Giorno 1: <ol><li> Rimuovere le gonadi della cultura con una pipetta 1000 ml con una punta di cut-off. Se lo si desidera, possono esserecollocato in un piatto di PBS per lavare media e di reagenti. Mettere in PBS in una provetta da 0,5 ml microcentrifuga. Il tubo di dimensioni inferiori conserverà reagenti e rendere più facile per tenere traccia dei campioni nel tubo. <ol><li> Essere sicuri di mantenere il controllo e campioni trattati, così come campioni XX e XY, in tubi separati e rimuoverli dalla cultura con gruppi separati di pipette per evitare la contaminazione potenziale farmaco. </li></ol></li><li> Lavare le gonadi due volte con PBS. Da questo punto in poi, questo protocollo può utilizzare 1X PBS privo di calcio e magnesio. Lavarli, consentono gonadi a depositarsi sul fondo della provetta (per gravità) e quindi rimuovere il liquido sopra. Fare attenzione a non perdere gonadi pipettando troppo vicino a loro. </li><li> Rimuovere il più possibile PBS dal tubo. Aggiungere 250 ml di 4% paraformaldeide in PBS contenente 0,1% Triton X-100, e lasciate incubare O / N a 4 ° C su un agitatore meccanico. In alternativa, questa fissazione può essere fatto per 2 ore a 4 ° C su un agitatore meccanico. ATTENZIONE! Paraforformaldeide è una sostanza tossica, in modo da seguire il protocollo di sicurezza durante la manipolazione. </li></ol> 2 ° giorno: <ol start="4"><li> Sciacquare le gonadi due volte in 250 microlitri PBTx a temperatura ambiente. </li><li> Lavare le gonadi 3 volte con 250 microlitri PBTx per 10 minuti ciascuno a temperatura ambiente su una sedia a dondolo. </li><li> Bloccare le gonadi almeno 1 ora a 250 microlitri soluzione bloccante a temperatura ambiente su una sedia a dondolo. </li><li> Macchiare le gonadi O / N a 4 ° C su una sedia a dondolo in 250 microlitri anticorpo primario diluito in Blocking Solution. </li></ol> 3 ° giorno: <ol start="8"><li> Sciacquare le gonadi due volte in 250 ml Soluzione di Lavaggio. </li><li> Lavare le gonadi 3 volte con 250 microlitri soluzione di lavaggio per 10 minuti ciascuno a RT su una sedia a dondolo. </li><li> Bloccare le gonadi 1 ora a 250 microlitri soluzione bloccante a temperatura ambiente su una sedia a dondolo. </li><li> Coprire il provetta con un foglio di alluminio per proteggere anticorpi secondari fluorescenti dalla luce. </li><li> Incubare le gonadi 2-4 ore a temperatura ambiente su arocker in 250 microlitri anticorpo secondario diluito in Blocking Solution contenente Hoechst 33342. In alternativa, eseguire anticorpo secondario e Hoechst 33342 incubazione O / N a 4 ° C sull&#39;attuatore. </li><li> Sciacquare le gonadi due volte in 250 microlitri PBTx. </li><li> Lavare le gonadi 3 volte in 250 microlitri PBTx per 10 minuti ciascuno a temperatura ambiente su una sedia a dondolo. </li><li> Usando un puntale di cut-off, il trasferimento gonadi su un vetrino con liquido minimo. Rimuovere il liquido in eccesso con la pipetta, ma fare in modo che il tessuto non si asciughi. </li><li> Orientare le gonadi in modo desiderato con una pinza, e aggiungere rapidamente una goccia di supporti di montaggio per montare le gonadi sulla diapositiva. Assicurarsi che le mani di montaggio dei media tutti i campioni completamente; è fondamentale per evitare di lasciare i campioni asciugarsi. </li><li> Utilizzare i coprioggetti (numero 1,5 stile) di dimensioni adeguate per coprire delicatamente i campioni. Lasciate che il montaggio dei media diffusione di contattare l&#39;intera superficie del vetrino. Se necessario, premere molto leggermente sugli angoli del coprioggetto in modo chenon ci sono grosse bolle d&#39;aria. </li><li> Sigillare i vetrini con smalto trasparente intorno ai bordi per ridurre l&#39;evaporazione del mezzo di montaggio. Conservare diapositive montate al buio a 4 ° C. </li></ol>

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Cell. 18, 175-189 (2010).</li><li>Brennan, J., Capel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+tissue,+two+fates:+Molecular+genetic+events+that+underlie+testis+versus+ovary+development.">One tissue, two fates: Molecular genetic events that underlie testis versus ovary development.</a> Nat. Rev. Genet. 5, 509-521 (2004).</li><li>Martineau, J., Nordqvist, K., Tilmann, C., Lovell-Badge, R., Capel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male-specific+cell+migration+into+the+developing+gonad.">Male-specific cell migration into the developing gonad.</a> Curr. Biol. 7, 958-968 (1997).</li><li>Yokonishi, T., Sato, T., Katagiri, K., Ogawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+spermatogenesis+using+an+organ+culture+technique.">In vitro spermatogenesis using an organ culture technique.</a> Methods Mol. Biol. 927, 479-488 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+production+of+functional+sperm+in+cultured+neonatal+mouse+testes.">In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes.</a> Nature. 471, 504-507 (2011).</li><li>Gohbara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+murine+spermatogenesis+in+an+organ+culture+system.">In vitro murine spermatogenesis in an organ culture system.</a> Biol. Reprod. 83, 261-267 (2010).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Questo studio dimostra un intero metodo gocciolina organo ex vivo che ha molte potenziali applicazioni per lo studio dello sviluppo del feto. Questa tecnica può essere utilizzata per più organi, e permette al ricercatore di affrontare questioni biologiche che sono difficili da valutare in vivo utilizzando approcci a causa dell&#39;inaccessibilità di embrioni e potenziale letalità embrionale. Questo metodo di coltura ha ulteriori vantaggi rispetto ad altri approcci in vitro come linee cellu...

La rigenerazione di organi in vivo nell&#39;uomo è molto limitata; di conseguenza, l&#39;ingegneria dei tessuti, lo sviluppo di tessuti e organi da cellule individuali donati da un host, sta diventando una terapia potenziale interessante per la sostituzione degli organi. Tuttavia, per questa strategia terapeutica per avere successo, i fattori e le interazioni cellulari coinvolti nella morfogenesi dell&#39;organo devono essere accuratamente studiati e ben compresi. A causa della incapacità di studiare lo sviluppo di organi specifici con approcci tradizionali, i ricercatori si sono rivolti a embrione intero alternativa o intere culture d&#39;organo. Kalaskar et al. 1 hanno dimostrato che ex vivo cultura tutto l&#39;embriogenesi produce risultati comparabili (nel 58% degli embrioni coltivati) per lo sviluppo nell&#39;utero, suggerendo che ex vivo metodi di coltura sono un&#39;alternativa fattibile per gli studi dell&#39;organogenesi. Un sistema di coltura organo individualizzato, come questo ex vivo droplet sistema di coltura, consente intera analisi organo indipendente dagli effetti sistemici, pur consentendo manipolazione di un percorso di segnalazione specifica o interazioni cellulari tramite aggiunta di reagenti farmacologici o anticorpi. Tradizionalmente, lo studio di sviluppo degli organi fetali è stata limitata alle tecnologie transgeniche e di topi knockout, in aggiunta ai reagenti farmacologici consegnati materna. Tuttavia, ci sono questioni tecniche che coinvolgono queste tecniche e trattamenti in vivo; la maggior parte delle preoccupazioni ruotano attorno gli effetti di influenzare vari organi contemporaneamente che spesso si traduce in letalità embrionale. Un ulteriore problema degli studi di manipolare sviluppo fetale farmacologicamente è l&#39;effetto materno di farmaci in sviluppo embrionale in utero (ad esempio, il metabolismo materno della droga prima che raggiunga l&#39;embrione) e se tali reagenti possono passare attraverso la barriera placentare. La tecnica di tutta la cultura organo descrittaqui è stato adattato da un primo protocollo descritto da Maatouk et al. 2, in cui interi gonadi fetali sono incubati in ex vivo culture gocciolina verticali. Un vantaggio significativo di coltura gonadi fetali è che gli inibitori piccole molecole possono facilmente accedere tutto l&#39;organo per semplice diffusione. . DeFalco et al hanno dimostrato che utilizzando questo metodo ex vivo gocciolina cultura in combinazione con inibitori di piccole molecole può essere usato per studiare processi e interazioni che avvengono durante lo sviluppo delle gonadi 3 segnalazione; questi processi sarebbe difficile per esaminare in vivo a causa di problemi tecnici (ad esempio, il passaggio dei farmaci attraverso la placenta o letalità di incidere più organi che utilizzano approcci genetici e farmacologici). La cultura gocciolina non è solo un miglioramento in alcuni aspetti oltre in utero sperimentazione, ma anche che è un miglioramento rispetto in vitro ed ex visistemi vo pure. L&#39;uso di linee cellulari per studiare morfogenesi è estremamente difficile perché mancano i tipi cellulari diversi, mancano matrice extracellulare (ECM) componenti critici che permettano la formazione di architettura organo, e può esibire effetti in cascate di segnalazione. Anche se l&#39;ingegneria dei tessuti ha introdotto notevoli miglioramenti nella creazione di ponteggi che simulano ECM, la mancanza di conoscenza per quanto riguarda i segnali che sono richieste da ogni tipo di cellula durante l&#39;organogenesi rende difficile costruire un sistema di organi in vitro. Altri sistemi ex vivo sono stati precedentemente stabiliti per studiare organogenesi, o più specificamente morfogenesi, e hanno avuto molto successo per l&#39;imaging dal vivo di organi fetali in agar 4, transwells 5, filtri 6 e altre matrici ponteggio 7,8. Il vantaggio del sistema di coltura goccia è che permette lo studio della morfogenesi, fornendo la capacità di utilizzare meno reattivi, che sono oFten costoso, ma dando anche la tensione superficiale organo, che è importante per la crescita e di segnalazione capacità 9. Nel topo, del testicolo morfogenesi iniziale si svolge tra embrionale (E) mette in scena E11.5 e E13.5; queste fasi comprendono la finestra temporale ottimale per l&#39;esame i fattori che influenzano la differenziazione sesso-specifici. Tra i processi critici che si verificano durante la formazione del testicolo sono la generazione dell&#39;architettura cavo testicolo e la formazione di una rete vascolare specifico testicolo. Utilizzando questo ex vivo tutto l&#39;organo sistema di coltura gocciolina, si è in grado di alterare vascolarizzazione maschio-specifica e inibire testicolo morfogenesi attraverso l&#39;uso di un inibitore piccola molecola che blocca l&#39;attività dei recettori per il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF); VEGF-mediata rimodellamento vascolare è fondamentale per lo sviluppo del testicolo 10-12. Questa tecnica può essere applicata con successo ad altri organi e può bersagliare tempo specificofinestre di sviluppo. Whole-mount di imaging organo permette la visualizzazione di strutture vitali così come i cambiamenti strutturali e cellulari conseguenti alla somministrazione di vari inibitori. È importante sottolineare che questo sistema è vantaggioso in quanto il ricercatore può ignorare i potenziali effetti confondenti di somministrazione del farmaco materna o interruzione sistemico durante vivo strategie genetiche in mirate. Quindi, tutto questo organo ex vivo sistema di coltura delle gocce può migliorare significativamente la capacità di comprendere le interazioni e le segnalazioni che si verificano in particolare all&#39;interno di particolari organi durante lo sviluppo fetale.

<table><tbody><tr><td>Superfrost Plus Microscope Slides</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Cover Glasses: Squares (22 mm x 22 mm, No. 1.5)</td><td>Fisherbrand</td><td>12-541B</td><td></td></tr><tr><td>Sally Hansen Xtreme Wear Nail Polish, Invisible</td><td>Sally Hansen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8-Strip 0.2 ml PCR Tubes &amp;amp; Detached Flat Caps</td><td>GeneMate</td><td>T3218-1</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman L P1,000L, P200L, P20L, P10L, P2L</td><td>Gilson</td><td>FA10006M, FA10005M, FA10003M, FA10002M, FA10001M</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>FST</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Fine Scissors</td><td>FST</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Posi-Click 1.7 ml microcentrifuge tubes</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>Posi-Click 0.6 ml microcentrifuge tubes</td><td>Denville</td><td>C2176</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;mu;l SHARP Precision Barrier Tips</td><td>Denville</td><td>P1096FR</td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;mu;l SHARP Precision Barrier Tips</td><td>Denville</td><td>P1121</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;mu;l SHARP Precision Barrier Tips</td><td>Denville</td><td>P1122</td><td></td></tr><tr><td>1,000 &amp;mu;l SHARP Precision Barrier Tips</td><td>Denville</td><td>P1126</td><td></td></tr><tr><td>1 ml syringe with 27 gauge needles</td><td>BD PrecisionGlide</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>10 ml syringe</td><td>BD</td><td>305559</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;mu;M PES syringe filter</td><td>VWR</td><td>28145-501</td><td></td></tr><tr><td>Grade 3 Qualitative Filter Paper Standard Grade, circle, 185 mm</td><td>Whatman</td><td>1003-185</td><td></td></tr><tr><td>Primaria 35 mm Easy Grip Style Cell Culture Dish</td><td>Falcon/Corning</td><td>353801</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dishes, Sterile (100 mm x 15 mm)</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick Galaxy 14 S CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Incubator</td><td>Eppendorf</td><td>CO14S-120-0000</td><td></td></tr><tr><td>Biosafety Cabinet</td><td>Nuare</td><td>NU-425-400</td><td></td></tr><tr><td>Mini-centrifuge&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-090-100</td><td></td></tr><tr><td>BioExpress GyroMixer Variable XL</td><td>GeneMate</td><td>R-3200-1XL</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler Pro Thermal Cycler with control panel</td><td>Eppendorf</td><td>950040015</td><td></td></tr><tr><td>SMZ445 stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ445</td><td></td></tr><tr><td>MultiImage Light Cabinet with AlphaEase Software</td><td>Alpha Innotech Corporation</td><td>Discontinued</td><td></td></tr><tr><td>Absolute 200 proof Ethanol</td><td>Fisher</td><td>BP2818-500</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate (Dibasic MW 142) Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>S374-1</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate (Monobasic MW 136) KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride (NaCl)</td><td>Fisher</td><td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma</td><td>M2393-100g</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride (CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma</td><td>C5670-100g</td><td></td></tr><tr><td>Ambion Nuclease-Free Water</td><td>Life Technologies</td><td>AM9938&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>XY PCR Primer&amp;nbsp;</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Glacial Acetic Acid</td><td>Fisher</td><td>A38-500</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA)</td><td>Fisher</td><td>BP2482-1</td><td></td></tr><tr><td>1% Ethidium bromide solution</td><td>Fisher</td><td>BP1302-10</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>GeneMate</td><td>E-3120-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>367176-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Set, 100 mM Solutions</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0182</td><td></td></tr><tr><td>DNA Choice Taq polymerase with 10x Buffer</td><td>Denville</td><td>CB-4050-3</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Fisher</td><td>O4042-500</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>FluorMount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen Chloride (HCl)</td><td>Fisher</td><td>A144212</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA), powder, Fraction V, Heat shock isolation</td><td>Bioexpress</td><td>0332-100g</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (DMEM)&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS), triple 100 nm filtered</td><td>Fisher</td><td>03-600-511</td><td>Heat-inactivate before using</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Use at 1:100</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO), Hybri-max, sterile-filtered</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>VEGFR Tyrosine Kinase Inhibitor II - CAS 269390-69-4 - Calbiochem</td><td>EMD Millipore</td><td>676481</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit Anti-Sox9 Antibody</td><td>Millipore</td><td>AB5535</td><td>Use at dilution: 1:4,000</td></tr><tr><td>Rat Anti-Mouse PECAM1 (CD31) Antibody</td><td>BD Pharmingen</td><td>553370</td><td>Use at dilution: 1:250</td></tr><tr><td>Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>9661S</td><td>Use at dilution: 1:250</td></tr><tr><td>Rat E-cadherin / CDH1 Antibody (ECCD-2)</td><td>Life Technologies</td><td>13-1900</td><td>Use at dilution: 1:500</td></tr><tr><td>Hoechst 3342, trihydrochloride, trihydrate</td><td>Invitrogen (Molecular Probes)</td><td>H1399</td><td>Use at 2 ug/ml</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>712-165-153</td><td>Use at dilution: 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>712-605-153</td><td>Use at dilution: 1:500</td></tr><tr><td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate</td><td>Life Technologies</td><td>A31572</td><td>Use at dilution: 1:500</td></tr><tr><td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>Life Technologies</td><td>A21206</td><td>Use at dilution: 1:500</td></tr><tr><td>Donkey anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>Life Technologies</td><td>A21208</td><td>Use at dilution: 1:500</td></tr><tr><td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate</td><td>Life Technologies</td><td>A31573</td><td>Use at dilution: 1:500</td></tr></tbody></table>

using ex vivo upright droplet cultures of whole fetal organs to study developmental processes during mouse organogenesis

Indagare organogenesis in utero è un processo tecnicamente impegnativo in mammiferi placentati a causa dell&#39;inaccessibilità di reagenti di embrioni che si sviluppano all&#39;interno dell&#39;utero. Un metodo di coltura delle gocce di nuova concezione ex vivo verticale fornisce una valida alternativa a studi effettuati in utero. L&#39;ex vivo cultura gocciolina offre la possibilità di esaminare e manipolare interazioni cellulari e vie di segnalazione diverse attraverso l&#39;uso di vari composti di blocco e attivazione; Inoltre, gli effetti di vari reagenti farmacologiche sullo sviluppo di organi specifici possono essere studiati senza effetti collaterali indesiderati di somministrazione di farmaci sistemici in utero. Rispetto ad altri sistemi in vitro, la cultura gocciolina consente non solo la capacità di studiare le interazioni tridimensionale morfogenesi e cellula-cellula, che non può essere riprodotto in linee cellulari di mammifero, ma richiede anche molto meno reagents di altri ex vivo e in vitro. protocolli Questo documento dimostra mouse corretta fetale dissezione organo e verticali tecniche di coltura gocciolina, seguito da tutta immunofluorescenza organo per dimostrare l&#39;efficacia del metodo. La gocciolina metodo di coltura ex vivo permette la formazione di architettura organo paragonabile a quello osservato in vivo e può essere utilizzato per studiare processi altrimenti difficili da studio causa letalità embrionale in modelli in vivo. Come sistema domanda di modello, un inibitore piccola molecola sarà utilizzato per sondare il ruolo della vascolarizzazione nella morfogenesi testicolare. Questo droplet metodo di coltura ex vivo è espandibile fino a altri organi fetali, come polmone e potenzialmente altri, anche se ogni organo deve essere ampiamente studiata per determinare eventuali modifiche organo-specifiche al protocollo. Questo sistema di coltura di organi fornisce la flessibilità nella sperimentazione con organi fetali, e risultati richiederlod utilizzando questa tecnica aiuterà i ricercatori Acquisire conoscenze in sviluppo del feto.

L&#39;ex vivo cultura gocciolina permette di manipolare interi organi, come la gonade, per studiare le interazioni e le dinamiche cellulari. La Figura 1 mostra in modo graduale come preparare una cultura E11.5 gonadica goccia. I primi passi nel protocollo coltura comprendono la rimozione iniziale del utero-embrione contenente dal mouse madre (Figura 1A e 1B). Dopo la rimozione dell&#39;utero dalla madre, la parete uterina viene tagliato e gli embrioni vengono liberati dal sacco...

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Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

The&#160;ex vivo&#160;upright droplet culture is an alternative to current&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo&#160;experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.

Utilizzando<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Upright Droplet Culture di interi organi fetali per studiare i processi evolutivi durante mouse Organogenesi

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

12.4K Views.  Cincinnati Children's Hospital Medical Center. The ex vivo upright droplet culture is an alternative to current in vitro and in vivo experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.

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Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an integral part of the male reproductive tract, is responsible for sperm storage, maturation, and transport. The adult epididymis is a highly coiled tube that develops from a simple and straight embryonic precursor known as Wolffian duct (WD). Proper coiling of the epididymis is essential for male fertility, as sperm in the testis are unable to fertilize an oocyte. However, the mechanism responsible for epididymal development and coiling remains unclear, partially due to the lack of whole organ culture and imaging methods. In this study, we describe an in vitro culture system and whole mount immunofluorescence protocol to better visualize the process of WD coiling and development, which may also be applied to study other tubular organs.

We present a method for isolation and culture of the mouse Wolffian duct (WD). We also demonstrate a detailed procedure for whole mount immunostaining of cultured/freshly isolated WDs with fluorescently tagged antibodies. Together, these techniques enable the study of WD development, coiling, and differentiation.

Organo cultura e monte intero immunofluorescenza colorazione di mouse di Wolff Condotti

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Three-Dimensional Imaging of Organoids to Study Primary Ciliogenesis During ex vivo Organogenesis

Organoids are stem cell-derived three-dimensional structures that reproduce ex vivo the complex architecture and physiology of organs. Thus, organoids represent useful models to study the mechanisms that control stem cell self-renewal and differentiation in mammals, including primary ciliogenesis and ciliary signaling. Primary ciliogenesis is the dynamic process of assembling the primary cilium, a key cell signaling center that controls stem cell self-renewal and/or differentiation in various tissues. Here we present a comprehensive protocol for the immunofluorescence staining of cell lineage and primary cilia markers, in whole-mount mouse mammary organoids, for light sheet microscopy. We describe the microscopy imaging method and an image processing technique for the quantitative analysis of primary cilium assembly and length in organoids. This protocol enables a precise analysis of primary cilia in complex three-dimensional structures at the single cell level. This method is applicable for immunofluorescence staining and imaging of primary cilia and ciliary signaling in mammary organoids derived from normal and genetically modified stem cells, from healthy and pathological tissues, to study the biology of the primary cilium in health and disease.

Three-Dimensional Imaging of Organoids to Study Primary Ciliogenesis During ex vivo Organogenesis

Stem cell-derived organoids facilitate the analysis of molecular and cellular processes that regulate stem cell self-renewal and differentiation during organogenesis in mammalian tissues. Here we present a protocol for the analysis of the biology of the primary cilium in mouse mammary organoids.

Organoids are stem cell-derived three-dimensional structures that reproduce ex vivo the complex architecture and physiology of organs. Thus, organoids ...

Genetica

Mouse Fetal Liver Culture System to Dissect Target Gene Functions at the Early and Late Stages of Terminal Erythropoiesis

Erythropoiesis involves a dynamic process that begins with committed erythroid burst forming units (BFU-Es) followed by rapidly dividing erythroid colony forming units (CFU-Es). After CFU-Es, cells are morphologically recognizable and generally termed terminal erythroblasts. One of the challenges for the study of terminal erythropoiesis is the lack of experimental approaches to dissect gene functions in a chronological manner. In this protocol, we describe a unique strategy to determine gene functions in the early and late stages of terminal erythropoiesis. In this system, mouse fetal liver TER119 (mature erythroid cell marker) negative erythroblasts were purified and transduced with exogenous expression of cDNAs or small hairpin RNAs (shRNAs) for the genes of interest. The cells were subsequently cultured in medium containing growth factors other than erythropoietin (Epo) to maintain their progenitor stage for 12 hr while allowing the exogenous cDNAs or shRNAs to express. The cells were changed to Epo medium after 12 hr to induce cell differentiation and proliferation while the exogenous genetic materials were already expressed. This protocol facilitates analysis of gene functions in the early stage of terminal erythropoiesis. To study late stage terminal erythropoiesis, cells were immediately cultured in Epo medium after transduction. In this way, the cells were already differentiated to the late stage of terminal erythropoiesis when the transduced genetic materials were expressed. We recommend a general application of this strategy that would help understand detailed gene functions in different stages of terminal erythropoiesis.

We present an in vitro mouse fetal liver erythroblast culture system that dissects the early and late stages of terminal erythropoiesis. This system facilitates functional analysis of specific genes in different developmental stages.

Mouse fetale Fegato Cultura di sistema per sezionare Funzioni gene bersaglio nelle fasi precoci e tardivi del Terminal eritropoiesi

Erythropoiesis involves a dynamic process that begins with committed erythroid burst forming units (BFU-Es) followed by rapidly dividing erythroid colony ...

Immunologia e infezioni

Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to digest solid food. This process is termed suckling-to-weaning transition and results in the replacement of neonatal epithelium with adult epithelium which goes hand in hand with metabolic and morphological adjustments. These complex developmental changes are the result of a genetic program that is intrinsic to the intestinal epithelial cells but can, to some extent, be modulated by extrinsic factors. Prolonged culture of mouse primary intestinal epithelial cells from late fetal period, recapitulates suckling-to-weaning transition in vitro. Here, we describe a detailed protocol for mouse fetal intestinal organoid culture best suited to model this process in vitro. We describe several useful assays designed to monitor the change of intestinal functions associated with suckling-to-weaning transition over time. Additionally, we include an example of an extrinsic factor that is capable to affect suckling-to-weaning transition in vivo, as a representation of modulating the timing of suckling-to-weaning transition in vitro. This in vitro approach can be used to study molecular mechanisms of the suckling-to-weaning transition as well as modulators of this process. Importantly, with respect to animal ethics in research, replacing in vivo models by this in vitro model contributes to refinement of animal experiments and possibly to a reduction in the use of animals to study gut maturation processes.

This protocol describes how to mimic suckling-to-weaning transition in vitro using mouse late fetal intestinal organoids cultured for 30 days.

Recapitulare la transizione Suckling-to-Weaning In Vitro utilizzando organoidi intestinali fetali

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to ...

Optimization of Renal Organoid and Organotypic Culture for Vascularization, Extended Development, and Improved Microscopy Imaging

Embryonic kidney organotypic cultures, and especially pluripotent stem cell-derived kidney organoids, are excellent tools for following developmental processes and modelling kidney disease. However, the models are limited by a lack of vascularization and functionality. To address this, an improved protocol for the method of xenografting cells and tissues to the chorioallantoic membrane (CAM) of an avian embryo to gain vascularization and restoration of blood flow was developed. The grafts are overlaid with custom-made minireservoirs that fix the samples to the CAM and supply them with culture medium that protects the grafts from drying. The improved culture method allows xenografts to grow for up to 9 days. The manuscript also describes how to provide optimal conditions for long-term confocal imaging of renal organoids and organotypic cultures using the previously published Fixed Z-Direction (FiZD) method. This method gently compresses an embryonic organ or organoid between a glass coverslip and membrane in a large amount of medium and provides excellent conditions for imaging for up to 12 days. Together, these methods allow vascularization and blood flow to renal organoids and organotypic kidney cultures with improved confocal imaging. The methods described here are highly beneficial for studying fundamental and applied functions of kidneys ex vivo. Both methods are applicable to various types of tissues and organoids.

This work describes two methods for studying organ development, an improved xenotransplantation setup on chorioallantoic membrane (CAM) from avian embryos that allows for vascularization of cultured embryonic organs and organoids and a novel fixed z-direction organ culture method with modified experimental conditions that allows for high-resolution time-lapse confocal imaging.

Ottimizzazione della cultura organoide e organipica renale per la vascolarizzazione, lo sviluppo esteso e l'imaging di microscopia migliorato

Embryonic kidney organotypic cultures, and especially pluripotent stem cell-derived kidney organoids, are excellent tools for following developmental ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

Culture placentare e deciduale organo umano allo Studio infezioni all&#39;interfaccia materno-fetale

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis

Postimplantation mammalian embryo culture methods have been generally inefficient and limited to brief periods after dissection out of the uterus. Platforms have been recently developed for highly robust and prolonged ex utero culture of mouse embryos from egg-cylinder stages until advanced organogenesis. These platforms enable appropriate and faithful development of pregastrulating embryos (E5.5) until the hind limb formation stage (E11). Late gastrulating embryos (E7.5) are grown in rotating bottles in these settings, while extended culture from pregastrulation stages (E5.5 or E6.5) requires a combination of static and rotating bottle cultures. In addition, sensitive regulation of O2 and CO2 concentration, gas pressure, glucose levels, and the use of a specific ex utero culture medium are critical for proper embryo development. Here, a detailed step-by-step protocol for extended ex utero mouse embryo culture is provided. The ability to grow normal mouse embryos ex utero from gastrulation to organogenesis represents a valuable tool for characterizing the effect of different experimental perturbations during embryonic development.

Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis

An enhanced platform for whole-embryo culture allows continuous and robust ex utero development of postimplantation mouse embryos for up to six days, from pregastrulation stages until advanced organogenesis. In this protocol, we detail the standard procedure for successful embryo culture using static plates and rotating bottle systems.

Ex Utero Coltura di embrioni di topo dalla pregastrulazione all'organogenesi avanzata

Postimplantation mammalian embryo culture methods have been generally inefficient and limited to brief periods after dissection out of the uterus. ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

Un sistema per<em&gt; Ex vivo</emColtura&gt; del pancreas embrionale

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Biologia

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate tangentially from their place of origin in the ventral telencephalon (including from the medial and caudal ganglionic eminences (MGE, CGE)) to the dorsal cortical plate in response to a variety of intrinsic and extrinsic cues. Different methodologies have been developed over the years to genetically manipulate specific pathways and investigate how they regulate the dynamic cytoskeletal changes required for proper IN migration. In utero electroporation has been extensively used to study the effect of gene repression or overexpression in specific IN subtypes while assessing the impact on morphology and final position. However, while this approach is readily used to modify radially migrating pyramidal cells, it is more technically challenging when targeting INs. In utero electroporation generates a low yield given the decreased survival rates of pups when electroporation is conducted before e14.5, as is customary when studying MGE-derived INs. In an alternative approach, MGE explants provide easy access to the MGE and facilitate the imaging of genetically modified INs. However, in these explants, INs migrate into an artificial matrix, devoid of endogenous guidance cues and thalamic inputs. This prompted us to optimize a method where INs can migrate in a more naturalistic environment, while circumventing the technical challenges of in utero approaches. In this paper, we describe the combination of ex utero electroporation of embryonic mouse brains followed by organotypic slice cultures to readily track, image and reconstruct genetically modified INs migrating along their natural paths in response to endogenous cues. This approach allows for both the quantification of the dynamic aspects of IN migration with time-lapse confocal imaging, as well as the detailed analysis of various morphological parameters using neuronal reconstructions on fixed immunolabeled tissue.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Here, we provide a low-cost and reliable method to generate electroporated brain organotypic slice cultures from mouse embryos suitable for confocal microscopy and live-imaging techniques.

Ex Utero Elettroporazione e colture Organotypic fetta di cervelli embrionali del Mouse per vivere-Imaging di migrazione interneuroni GABAergici

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate ...

Neuroscienze

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

Embrionali di topo di sviluppo in un embrione di tutta la cultura di sistema privo di siero

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

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Recapitulare la transizione Suckling-to-Weaning In Vitro utilizzando organoidi intestinali fetali

Ottimizzazione della cultura organoide e organipica renale per la vascolarizzazione, lo sviluppo esteso e l'imaging di microscopia migliorato

Culture placentare e deciduale organo umano allo Studio infezioni all'interfaccia materno-fetale

Ex Utero Coltura di embrioni di topo dalla pregastrulazione all'organogenesi avanzata

Un sistema per

Ex Utero Elettroporazione e colture Organotypic fetta di cervelli embrionali del Mouse per vivere-Imaging di migrazione interneuroni GABAergici

Embrionali di topo di sviluppo in un embrione di tutta la cultura di sistema privo di siero