Per iniziare, in una piastra a sei pozzetti, seminare un millilitro di cellule 293T renali embrionali umane. Aggiungere due millilitri di DMEM completo. Il giorno successivo, sostituire il terreno con terreno fresco privo di antibiotici per preparare le cellule alla trasfezione.
Per trasfettare le cellule aderenti, per prima cosa, preparare la miscela A aggiungendo DNA plasmidico a 100 microlitri di Opti-MEM. Successivamente, aggiungere 17,5 microlitri di polietilenimmina a 100 microlitri di Opti-MEM. Mescolare il contenuto della miscela A e B, quindi incubare.
Durante l'incubazione, muovere delicatamente il tubo ogni tre o quattro minuti per migliorare la miscelazione. Aggiungere l'intero volume della miscela nel piatto con le celle HEK 293T. Dopo 16-20 ore di trasfezione, sostituire il terreno di coltura con DMEM fresco e completo.
Incubare la piastra a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica per produrre i virus pseudotipi. Dopo 72 ore di trasfezione, raccogliere il surnatante in una provetta di raccolta. Centrifugare il surnatante a 1.600 g per sette minuti a temperatura ambiente.
Quindi filtrare il surnatante attraverso un filtro in acetato di cellulosa da 0,45 micrometri. Distribuire 50 microlitri di DMEM completo nei pozzetti di una piastra da 96 pozzetti. Lasciare vuota la riga A.
Aggiungere 100 microlitri del brodo di pseudovirus nei pozzetti della fila A.Successivamente, pipettare 50 microlitri della soluzione dalla fila A alla B.Ripetere questo processo fino alla riga G per ottenere diluizioni seriali. Rimuovere il terreno esausto da una piastra con cellule HEK 293T ACE2 sensibili alla coltura e lavare le cellule con quattro millilitri di DPBS. Quindi staccare le cellule con un millilitro di tripsina EDTA in soluzione salina DPBS.
Ora aggiungi 50 microlitri della sospensione cellulare suscettibile in ogni pozzetto contenente i virus pseudotipici. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica per 48 ore. Aggiungere 100 microlitri del reagente luciferasi in ogni pozzetto.
Dopo l'incubazione, trasferire il contenuto di ciascun pozzetto in una piastra nera da 96 pozzetti. Quindi leggere la targa in un lettore di targhe. In una piastra a 96 pozzetti, aggiungere 50 microlitri di DMEM completo fresco alle colonne da uno a 10 dalle righe B a H.Aggiungere 95 microlitri di DMEM completo fresco ai pozzetti corrispondenti della riga A.Aggiungere ora 50 microlitri di DMEM completo ai pozzetti della colonna 11 e 100 microlitri di DMEM alla colonna 12.
Pipettare cinque microlitri di campioni di siero inattivato a caldo nella fila A.Con una pipetta multicanale, miscelare i campioni nella prima fila e trasferire 50 microlitri di siero contenente terreno dalla fila A alla B fino alla fila H.Distribuire 50 microlitri di terreno contenente pseudovirus diluito in ciascun pozzetto dalla colonna 1 alla 11. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica per un'ora. Preparare una sospensione di cellule ACE2 sensibili HEK293T in cinque millilitri.
Aggiungere 50 microlitri di sospensione cellulare a ciascun pozzetto, quindi incubare prima di eseguire il test della luciferasi. Una minore diluizione del siero ha provocato una diminuzione dell'ingresso virale nelle cellule. Ciò è confermato dall'aumento della percentuale di neutralizzazione.
