Riconosciamo il contributo dei volontari degli operatori sanitari. Questo progetto è stato sostenuto dal Dipartimento di Eccellenza 2023/2027, MUR, Italia. AR e DZ sono stati sostenuti da PRIN2022 (finanziamenti dell'UE; NextGenerationEU)

Il presente protocollo è stato approvato e segue le linee guida del Comitato Etico dell'Università di Verona (protocollo di approvazione numero 1538). Il consenso scritto informato è stato ottenuto dai soggetti umani che hanno partecipato allo studio. I campioni di sangue intero sono stati raccolti da volontari operatori sanitari (HCW) che erano in procinto di ricevere vaccini anti-SARS-CoV-2. Questi campioni sono stati raccolti in provette di plastica contenenti anticoagulanti per il successivo isolamento del siero15.
Tutti i seguenti processi devono essere eseguiti in una cappa biologica di Classe 2, lavorando in condizioni sterili. La manipolazione dei virus deve essere eseguita con cura e tutti i prodotti di scarto devono essere neutralizzati in una soluzione di candeggina diluita. Una panoramica del protocollo è mostrata nella Figura 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65658/65658fig01v2.jpg"> Figura 1: Rappresentazione grafica di un saggio di neutralizzazione. (A) produzione di PV, (B) titolazione di PV e (C) test di neutralizzazione. Tutte le procedure vengono eseguite in una cappa biologica di classe 2 in condizioni sterili. La fase di titolazione (B) deve essere eseguita per standardizzare i livelli di infettività dei PV prima dell'uso nel saggio di neutralizzazione (C). Questa figura è stata creata con BioRender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65658/65658fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
1. Test di produzione e infettività di SARS-CoV-2 PVs
<ol><li>Seminare 5 x 10cellule da 5 HEK293T in Dulbecco's Modified Eagle Medium completo (DMEM, ad alto contenuto di glucosio, 10% siero fetale bovino (FBS), 1% L-glutammina, 1% penicillina/streptomicina) in una piastra a 6 pozzetti (6WP) per raggiungere una densità cellulare adeguata compatibile con il reagente di trasfezione utilizzato. Nel caso di esecuzione della trasfezione con polietilenimmina (PEI) (preparare il reagente seguendo le istruzioni del produttore), assicurarsi che le cellule raggiungano il 40-60% di densità il giorno della trasfezione (passaggio 1.3). Conservare le cellule in un incubatore umidificato a 37 °C e al 5% di CO2 .</li>
	<li>Prima della trasfezione, sostituire il terreno cellulare esaurito con terreno fresco senza antibiotici (DMEM, alto contenuto di glucosio, 10% FBS, 1% L-glutammina) per ottenere una maggiore efficienza di trasfezione. NOTA: Il giorno dopo la semina, HEK293T cellule sono pronte per essere trasfettate.</li>
	<li>Trasfettare le cellule HEK293T aderenti con un reagente di trasfezione adatto secondo le istruzioni del produttore. Se si utilizza il PEI, preparare due miscele e seguire i passaggi seguenti.<ol><li>Per preparare la miscela A, aggiungere 500 ng di plasmide16 per impacchettare pCMV-dR8.91, 750 ng di plasmide reporterpCSFLW 16 e 450 ng di plasmide esprimente SARS-CoV-2 Spike in 100 μL di terreno sierico ridotto.</li>
		<li>Per preparare la miscela B, aggiungere 17,5 μL di PEI (concentrazione: 1 mg/mL) a 100 μL di terreno sierico ridotto.</li>
		<li>Lasciare incubare entrambe le miscele a temperatura ambiente (RT) per 5 minuti. Successivamente, mescolare il contenuto di entrambe le provette aggiungendo la miscela PEI B alla miscela di DNA A.</li>
		<li>Incubare la provetta per 20-30 minuti a RT. Agitare delicatamente la provetta ogni 3-4 minuti per migliorare la miscelazione. Infine, aggiungere il composto alle celle HEK293T.</li>
	</ol></li>
	<li>16-20 ore dopo la trasfezione, sostituire il terreno di coltura con DMEM fresco e completo. Incubare a 37 °C e 5% di CO2 per consentire la produzione di PV da parte di cellule trasfettate.</li>
	<li>72 ore dopo la trasfezione, raccogliere il surnatante contenente PV. Quindi centrifugare a 1600 x g per 7 minuti a temperatura ambiente per rimuovere i detriti cellulari e le cellule morte e filtrarlo attraverso un filtro in acetato di cellulosa da 0,45 μm.</li>
	<li>FASE OPZIONALE: Per aumentare la resa finale del titolo PV, eseguire trasfezioni multiple, raggruppare i terreni cellulari contenenti PV e concentrarli utilizzando tubi di concentrazione.</li>
	<li>Procedere direttamente con le fasi successive ("titolazione PV", sezione 2) o aliquotare il mezzo contenente PV in provette adatte per conservarlo a -80 °C fino all'uso. Preparare un'aliquota aggiuntiva (400-500 μL) da utilizzare per la titolazione. NOTA: La realizzazione di aliquote multiple garantirà la riproducibilità tra gli esperimenti evitando eccessivi cicli di disgelo-congelamento.</li>
</ol>2. Titolazione PVs
<ol><li>Utilizzare il terreno fresco contenente PV per le fasi successive o scongelare l'aliquota di prova (fase 1.7) per eseguire la titolazione del nuovo stock virale. Il congelamento di aliquote dello stesso stock fotovoltaico garantirà la riproducibilità.</li>
	<li>Aggiungere 50 μL di DMEM completo (o terreno completo compatibile con la linea cellulare target in uso) in tutti i pozzetti di una piastra a 96 pozzetti (96 WP) necessari per testare in duplicato lo stock PV, lasciando vuota la riga "A". Aggiungere 100 μL di PV alla riga "A". In base al numero di preparati da testare, lasciare una colonna senza il virus come controllo "solo cellulare" (Figura 2).</li>
	<li>Pipettare 50 μL dalla fila A alla fila B e ripetere questo processo fino alla fila G per ottenere diluizioni seriali della scorta iniziale. Eliminare il volume in eccesso dall'ultima riga.</li>
	<li>Staccare le cellule utilizzando tripsina/etilendiamminotetraacetico acido 1x (EDTA) nella soluzione salina tampone fosfato di Dulbecco 1x (DPBS 1x), dopo aver rimosso il terreno esausto e lavato le celle con DPBS 1x due volte. Preparare le cellule a una densità di 4 x 105 cellule/mL. NOTA: In questo protocollo, l'infezione da PVs è stata testata sulla linea cellulare suscettibile HEK293T/ACE2; tali cellule sono state derivate da HEK293T, trasdotte utilizzando un vettore lentivirale per esprimere il recettore ACE2.</li>
	<li>Aggiungere 50 μL di sospensione cellulare in ciascun pozzetto per garantire un numero di cellule di 2 x 104 cellule per pozzetto.</li>
	<li>Incubare a 37 °C e 5% di CO2 per 48 ore.</li>
	<li>Dopo l'incubazione, eseguire il test della luciferasi per ottenere la lettura secondo le istruzioni del produttore. Aggiungere 100 μL del reagente luciferasi ai pozzetti e incubare al buio a RT per 2 minuti. Spostare il contenuto di ciascun pozzetto su una piastra nera da 96 pozzetti (compatibile con il lettore di piastre disponibile) e leggere le piastre in un lettore di piastre da 96 pozzetti. NOTA: Il luminometro utilizzato per la lettura della luciferasi produrrà un foglio di calcolo con i dati grezzi e non elaborati che verranno utilizzati per l'analisi a valle (in questo caso, un file Excel). L'infettività del virus sarà espressa come unità di luminescenza relativa (RLU) (descritte nel paragrafo 4.1).</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65658/65658fig02.jpg"> Figura 2: Layout rappresentativo di una piastra a 96 pozzetti per la titolazione di PV. Un volume fisso di surnatante contenente PV viene aggiunto alla riga A, colonne 1-11, e diluito in serie. L'ultima colonna viene lasciata come controllo "solo cella". Questa figura è stata creata con BioRender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65658/65658fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
3. Saggio di neutralizzazione
<ol><li>Scongelare i sieri dei pazienti sul ghiaccio. Inattivare i campioni di siero incubandoli a 56 °C per 30 min.</li>
	<li>In una piastra da 96 pozzetti, aggiungere 50 μL di DMEM fresco e completo (o terreno completo compatibile con la linea cellulare bersaglio utilizzata) in ciascuno dei seguenti pozzetti: dalla riga B (colonne 1-10) alla riga H (colonne 1-10). Inserire 95 μL di DMEM fresco e completo nella riga A (colonne 1-10). Aggiungere rispettivamente 50 μL e 100 μL di DMEM completo nei pozzetti delle colonne 11 e 12. Si tratta rispettivamente dei controlli infetti (controllo del virus, o VC) e non infetti (solo cellule, o CC), (Figura 3).</li>
	<li>Aggiungere 5 μL di campioni di siero/plasma inattivati dal calore nella riga A (colonne 1-10). Ogni campione sarà in duplice copia. Con una pipetta multicanale, miscelare i campioni nella prima fila e spostare 50 μL di terreno contenente siero dalla fila A alla fila B. Ripetere questo processo fino all'ultima riga (Figura 3). Scartare i restanti 50 μL.</li>
	<li>Scongelare il numero necessario di aliquote di PV e diluire a ≥ 104 RLU/mL. Aggiungere 50 μL di terreno diluito contenente PV a ciascun pozzetto (dalla colonna 1 alla colonna 11) utilizzando una pipetta multicanale per ottenere una diluizione 1:1 del siero/plasma inattivato termicamente al virus. Incubare a 37 °C e al 5% di CO2 per 1 ora per consentire agli anticorpi nei campioni di siero di legarsi alla proteina spike del SARS-CoV-2 sui PV.</li>
	<li>Preparare almeno 5 mL di sospensione di cellule sensibili (HEK293T/ACE2) ad una densità cellulare di 4 x 105 cellule/mL. Aggiungere 50 μL di sospensione cellulare a ciascun pozzetto e incubare a 37 °C e 5% di CO2 per 48 ore.</li>
	<li>Dopo l'incubazione, eseguire la lettura del saggio della luciferasi secondo le istruzioni del produttore, come descritto al punto 2.7. NOTA: Il luminometro utilizzato per la lettura della luciferasi produrrà un foglio di calcolo (in questo caso, .xlsx) con i dati grezzi e non elaborati che verranno utilizzati per l'analisi a valle (il file del saggio della luciferasi).</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65658/65658fig03.jpg"> Figura 3: Rappresentazione della piastra basata sulla diluizione del siero. Il rosso brillante corrisponde a una maggiore quantità di siero e il blu brillante (colonna 11) corrisponde al controllo delle cellule infette (VC, controllo del virus). La corsia azzurra (colonna 12) corrisponde alle cellule non infette (CC, controllo cellulare). Questa figura è stata creata con BioRender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65658/65658fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
4. Analisi della titolazione
<ol><li>Nel file del saggio della luciferasi, assegnare i nomi/titoli ai campioni corrispondenti.</li>
	<li>Moltiplicare la misura RLU per i fattori di diluizione (dall'alto verso il basso della griglia: 20x, 40x, 80x, 160x, 320x, 640x, 1,280x, 2,560x) per ottenere RLU/mL. Se si utilizzano fattori di diluizione diversi, modificare di conseguenza i fattori di moltiplicazione.</li>
	<li>Calcolare l'RLU/mL medio per ogni preparazione PV.</li>
</ol>5. Analisi del saggio di neutralizzazione dei PV
<ol><li>Nel file del foglio di calcolo del saggio della luciferasi (in questo caso, .xlsx), assegnare i titoli corrispondenti ai campioni testati. Inserire il fattore di diluizione del campione (40s, 80x, 160x, 320x, 640x, 1,280x, 2,560x, 5,120x). Calcolare il Log10 dei fattori di diluizione.</li>
	<li>Calcolare l'RLU media del controllo non infetto e infetto (Figura 3, colonne 11 e 12, rispettivamente). Questi valori saranno utili per la normalizzazione nel passaggio 5.5.</li>
	<li>Aprire un nuovo documento per l'analisi dei dati. Selezionare Analisi X/Y, immettere X come Numeri e Y come Immettere 2 valori di replica in sottocolonne affiancate.</li>
	<li>Immettere i valori Log10 (diluizione) come numeri X. Immettere l'RLU duplicato dei campioni.</li>
	<li>Vai a Analizza > Normalizza > Contrassegna tutti i campioni sullo stesso foglio. Immettere i valori medi VC e CC rispettivamente in Come viene definito lo 0%?, e Come viene definito il 100%?. Fare clic su OK.</li>
	<li>Nel foglio dati normalizzato, vai a Analizza analisi XY > > Analisi non lineari (adattamento curva). Contrassegnare tutti i campioni e fare clic su OK. Per Dose-risposta - Inibizione, selezionare log (inibitore) vs risposta normalizzata - pendenza variabile.</li>
	<li>In Vincola, modificare HillSlope in Deve essere minore di 0.</li>
	<li>In Output, seleziona Crea tabella di riepilogo e grafico. Fare clic su OK per ottenere le analisi finali. Un foglio di lavoro con un modello per l'analisi è fornito nel file supplementare 1.</li>
</ol>

Valutazione della neutralizzazione sierica contro SARS-CoV-2 con virus pseudotipizzati

<ol>
	<li>Ozaki, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+technology+transfer+of+a+GCLP-compliant+HIV-1+neutralizing+antibody+assay+for+human+clinical+trials.">International technology transfer of a GCLP-compliant HIV-1 neutralizing antibody assay for human clinical trials.</a> Plos One. 7 (1), e30963 (2012).</li><li>Pouget, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+liposomes+to+study+the+effect+of+Mycobacterium+tuberculosis+lipids+on+HIV-1+cis-+and+trans-infections.">Generation of liposomes to study the effect of Mycobacterium tuberculosis lipids on HIV-1 cis- and trans-infections.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1945 (2021).</li><li>McKay, L. G. 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Available from: <a target="_blank" href="https://covid19.who.int">https://covid19.who.int</a> (2022)</li><li>Zhou, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pneumonia+outbreak+associated+with+a+new+coronavirus+of+probable+bat+origin.">A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin.</a> Nature. 579 (7798), 270-273 (2020).</li><li>Chen, X., Huang, H., Ju, J., Sun, R., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+vaccination+on+the+COVID-19+pandemic+in+U.S.+states.">Impact of vaccination on the COVID-19 pandemic in U.S. states.</a> Scientific Reports. 12 (1), 1554 (2022).</li><li>Stefani, C., Fantoni, T., Bissoli, M., Thomas, J., Ruggiero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+and+SARS-CoV-2+Co-Infection:+From+Population+Study+Evidence+to+In+Vitro+Studies.">HIV and SARS-CoV-2 Co-Infection: From Population Study Evidence to In Vitro Studies.</a> Life. 12 (12), 2089 (2022).</li><li>Watson, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+impact+of+the+first+year+of+COVID-19+vaccination:+a+mathematical+modelling+study.">Global impact of the first year of COVID-19 vaccination: a mathematical modelling study.</a> The Lancet Infectious Diseases. 22 (9), 1293-1302 (2022).</li><li>Cantoni, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+antibody+neutralisation+activity+against+SARS-CoV-2+variants+and+seasonal+human+coronaviruses+NL63,+HKU1,+and+229E+induced+by+three+different+COVID-19+vaccine+olatforms.">Analysis of antibody neutralisation activity against SARS-CoV-2 variants and seasonal human coronaviruses NL63, HKU1, and 229E induced by three different COVID-19 vaccine olatforms.</a> Vaccines. 11 (1), 58 (2023).</li><li>Siracusano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+decay+of+antibody+response+and+VOC+sensitivity+in+na&#239;ve+and+previously+infected+subjects+at+15+weeks+following+vaccination+with+BNT162b2.">Different decay of antibody response and VOC sensitivity in na&#239;ve and previously infected subjects at 15 weeks following vaccination with BNT162b2.</a> Journal of Translational Medicine. 20 (1), 22 (2022).</li><li>Ruggiero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+vaccination+elicits+unconventional+IgM+specific+responses+in+na&#239;ve+and+previously+COVID-19-infected+individuals.">SARS-CoV-2 vaccination elicits unconventional IgM specific responses in na&#239;ve and previously COVID-19-infected individuals.</a> eBioMedicine. 77, (2022).</li><li>Piubelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subjects+who+developed+SARS-CoV-2+specific+IgM+after+vaccination+show+a+longer+humoral+immunity+and+a+lower+frequency+of+infection.">Subjects who developed SARS-CoV-2 specific IgM after vaccination show a longer humoral immunity and a lower frequency of infection.</a> eBioMedicine. 89, 104471 (2023).</li><li>Zhang, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectivity+of+pseudotyped+SARS-CoV-2+variants+of+concern+in+different+human+cell+types+and+inhibitory+effects+of+recombinant+spike+protein+and+entry-related+cellular+factors.">Infectivity of pseudotyped SARS-CoV-2 variants of concern in different human cell types and inhibitory effects of recombinant spike protein and entry-related cellular factors.</a> Journal of Medical Virology. 95 (1), e28437 (2023).</li><li>da Costa, K. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+A+(N1-N9)+and+Influenza+B+(B/Victoria+and+B/Yamagata)+neuraminidase+pseudotypes+as+tools+for+pandemic+preparedness+and+improved+influenza+vaccine+design.">Influenza A (N1-N9) and Influenza B (B/Victoria and B/Yamagata) neuraminidase pseudotypes as tools for pandemic preparedness and improved influenza vaccine design.</a> Vaccines. 10 (9), 1520 (2022).</li><li>Condor Capcha, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+SARS-CoV-2+spike+pseudotyped+virus+for+viral+entry+and+neutralization+assays:+a+1-week+protocol.">Generation of SARS-CoV-2 spike pseudotyped virus for viral entry and neutralization assays: a 1-week protocol.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 7, 618651 (2021).</li><li>Diomede, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxycycline+inhibition+of+a+pseudotyped+virus+transduction+does+not+translate+to+inhibition+of+SARS-CoV-2+infectivity.">Doxycycline inhibition of a pseudotyped virus transduction does not translate to inhibition of SARS-CoV-2 infectivity.</a> Viruses. 13 (9), 1745 (2021).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.

Sebbene l'utilizzo di un virus wildtype simuli l'infezione effettiva, i PV lentivirali sono un'opzione più sicura per studiare i meccanismi associati all'ingresso e all'infezione virale senza i severi requisiti di sicurezza necessari per lavorare con i virus patogeni 4,20,21. I PV sono composti da un nucleo virale difettoso di replicazione circondato dalla glicoproteina dell'involucro superficiale di un virus patogeno che è l'...

I virus pseudotipizzati (PV) sono strumenti molecolari utilizzati in microbiologia per studiare le interazioni ospite-virus e patogeno-patogeno 1,2,3,4. I PV sono costituiti da una parte interna, il nucleo virale che protegge il genoma virale, e da una parte esterna, le glicoproteine dell'involucro sulla superficie del virus che definisce il tropismo5. Uno pseudovirus è incompetente nella replicazione della cellula bersaglio perché non contiene tutte le informazioni genetiche per generare nuove particelle virali. Questa combinazione di caratteristiche peculiari rende i PV un'alternativa sicura a un virus wildtype. I virus wildtype, d'altra parte, sono altamente patogeni e non possono essere utilizzati nei laboratori BSL 2 per l'analisi6.
L'infettività delle PV può essere monitorata da un gene reporter, di solito codificante per una proteina fluorescente (GFP, RFP, YFP) o un enzima che produce prodotti chemiluminescenti (luciferasi). Questo è contenuto in uno dei plasmidi utilizzati per la produzione di PV e incorporato nel genoma dello pseudovirus7.
Attualmente esistono diversi tipi di nuclei fotovoltaici, comprese le particelle derivate da lentivirali basate sul genoma dell'HIV-1. Il grande vantaggio dei PV basati sull'HIV-1 rispetto ad altre piattaforme è il loro intrinseco processo di integrazione nel genoma della cellula bersaglio8. Sebbene l'HIV-1 sia un virus altamente contagioso e sia l'agente eziologico dell'AIDS, questi vettori lentivirali sono sicuri da usare grazie alle ampie fasi di ottimizzazione nel corso degli anni. Condizioni ottimali di sicurezza sono state raggiunte con l'introduzione di vettori lentivirali di seconda generazione, in cui i geni virali sono stati impoveriti senza influenzare le capacità di trasduzione9. La 3ae la 4a generazione hanno contribuito ad aumentare la sicurezza della manipolazione dei vettori lentivirali con l'ulteriore suddivisione del genoma virale in plasmidi separati10,11. Le ultime generazioni di PV sono generalmente impiegate per produrre vettori lentivirali per la terapia genica.
I PV possono essere utilizzati per studiare le interazioni tra virus e cellule ospiti, sia durante la fase di produzione che durante la fase di infezione. I PV sono particolarmente impiegati nei saggi di neutralizzazione degli pseudovirus (PVNA). I PVNA sono ampiamente validati per valutare il potenziale di neutralizzazione del siero o del plasma prendendo di mira la glicoproteina virale sull'involucro12,13 del PV. L'attività di neutralizzazione, espressa come concentrazione inibitoria 50 (IC50), è definita come la diluizione del siero/plasma che blocca il 50% dell'ingresso delle particelle virali14. In questo protocollo, abbiamo descritto la messa a punto di un PVNA per testare l'attività anticorpale contro la Sindrome Respiratoria Acuta Grave - Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) in sieri raccolti prima e dopo aver ricevuto una dose di vaccino di richiamo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m filter</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>83 1826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>83 3920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>8,33,924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10403892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black Opaque 96-well Microplate</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>60005270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium&#160;</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>D6546 - 500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (PBS 1x)</td>
			<td>AUROGENE</td>
			<td>AU-L0615-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum</td>
			<td>AUROGENE</td>
			<td>AU-S1810-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism version 7</td>
			<td>graphpad dotmatics</td>
			<td>NA</td>
			<td>In the manuscript, we replace the commercial name with &#39;data analysis program&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T/ACE2 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>HEK293T has been transduced to overexpress ACE2 with a lentiviral vector.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine&#160;</td>
			<td>AUROGENE</td>
			<td>AU-X0550-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer - Victor3</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>HH35000500</td>
			<td>In the manuscript, we replace the commercial name with&#160; &#39;luminometer&#39;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11058021</td>
			<td>In the manuscript, we replace the commercial name with &#39;reduced serum medium&#39;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p8.91 packaging plasmid</td>
			<td>Di Genova et al., 2021</td>
			<td></td>
			<td>A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCSFLW reporter plasmid</td>
			<td>Di Genova et al., 2021</td>
			<td></td>
			<td>A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>AUROGENE</td>
			<td>AU-L0022-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine, branched (PEI) (25 kDa)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>408727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RRL.sin.cPPT.SFFV/Ace2.IRES-puro.WPRE (MT126)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>145839</td>
			<td>This plasmid was used to generate HEK293Tcells/ACE2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 Spike expressing plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>pGBW-m4137382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>steadylite plus Reporter Gene Assay System</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6066759</td>
			<td>In the manuscript, we replaced the commercial name with &#39;luciferase reading reagent&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA 1x</td>
			<td>AUROGENE</td>
			<td>AU-L0949-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pseudotyped viruses as a molecular tool to monitor humoral immune responses against sars-cov-2 via neutralization assay

I virus pseudotipizzati (PV) sono strumenti molecolari che possono essere utilizzati per studiare le interazioni ospite-virus e per testare la capacità neutralizzante di campioni di siero, oltre al loro uso più noto nella terapia genica per la veicolazione di un gene di interesse. I PV sono difettosi di replicazione perché il genoma virale è diviso in diversi plasmidi che non sono incorporati nei PV. Questo sistema sicuro e versatile consente l'uso di PV in laboratori di livello di biosicurezza 2. Qui, presentiamo una metodologia generale per produrre PV lentivirali basata su tre plasmidi come menzionato qui: (1) il plasmide della spina dorsale che trasporta il gene reporter necessario per monitorare l'infezione; (2) il plasmide impacchettatore che trasporta i geni per tutte le proteine strutturali necessarie per generare le PVs; (3) il plasmide di espressione della glicoproteina superficiale dell'involucro che determina il trofismo del virus e media l'ingresso virale nella cellula ospite. In questo lavoro, SARS-CoV-2 Spike è la glicoproteina dell'involucro utilizzata per la produzione di lentivirus pseudotipizzati SARS-CoV-2 non replicati.
In breve, le cellule di impacchettamento (HEK293T) sono state co-trasfettate con i tre diversi plasmidi utilizzando metodi standard. Dopo 48 ore, il surnatante contenente i PV è stato raccolto, filtrato e conservato a -80 °C. L'infettività dei PV di SARS-CoV-2 è stata testata studiando l'espressione del gene reporter (luciferasi) in una linea cellulare bersaglio 48 ore dopo l'infezione. Maggiore è il valore delle unità di luminescenza relativa (RLU), maggiore è il tasso di infezione/trasduzione. Inoltre, i PV infettivi sono stati aggiunti ai campioni di siero diluiti in serie per studiare il processo di neutralizzazione dell'ingresso degli pseudovirus nelle cellule bersaglio, misurato come riduzione dell'intensità dell'RLU: valori più bassi corrispondenti a un'elevata attività neutralizzante.

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools used in microbiology to study host-virus and pathogen-pathogen interactions1,2,3,4. PVs consist of an inner part, the viral core that protects the viral genome, and an outer part, the envelope glycoproteins on the surface of the virus that defines the tropism5. A pseudovirus is replication-incompetent in the target cell because it does not contain all the genetic information to generate new viral particles. This combination of peculiar features makes PVs a safe alternative to a wildtype virus. Wildtype viruses, on the other hand, are highly pathogenic and cannot be used in BSL 2 laboratories for analysis6.
The infectivity of PVs can be monitored by a reporter gene, usually coding for a fluorescent protein (GFP, RFP, YFP) or an enzyme that produces chemiluminescent products (luciferase). This is contained in one of the plasmids used for PV production and incorporated in the genome of the pseudovirus7.
Several types of PV cores currently exist, including lentiviral-derived particles based on the HIV-1 genome. The great advantage of HIV-1-based PVs over other platforms is their intrinsic integration process in the target cell genome8. Although HIV-1 is a highly contagious virus and is the causative agent of AIDS, these lentiviral vectors are safe to use because of the extensive optimization steps over the years. Optimal safety conditions were achieved with the introduction of 2nd-generation lentiviral vectors, in which viral genes were depleted without influencing transduction capabilities9. The 3rd and 4th generations contributed to the increased safety of lentiviral vector handling with the further splitting of the viral genome into separate plasmids10, 11. The latest generations of PVs are generally employed to produce lentiviral vectors for gene therapy.
PVs can be used to study interactions between viruses and host cells, during both the production and the infection phases. PVs are especially employed in pseudovirus neutralization assays (PVNA). PVNAs are widely validated to assess the neutralization potential of serum or plasma by targeting the viral glycoprotein on the PV&#39;s envelope12,13. Neutralization activity, expressed as the inhibitory concentration 50 (IC50), is defined as the dilution of serum/plasma that blocks 50% of viral particle entry14. In this protocol, we described the set-up of a PVNA to test the antibody activity against Severe Acute Respiratory Syndrome - Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) in sera collected before and after receiving a booster vaccine dose.

Autore in primo piano: Studio delle interazioni ospite-virus con virus pseudotipizzati 

Virus pseudotipizzati come strumento molecolare per monitorare le risposte immunitarie umorali contro SARS-CoV-2 tramite test di neutralizzazione

Pseudotyped viruses are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test neutralizing activity of serum samples. In the work we present today, a general methodology to produce pseudotyped viruses, based on free plasmid, will be presented. For neutralization assays, Y-type viruses are generally used, but they are highly pathogenic and cannot be handled in a BSL-2 laboratories, rendering this system purely applicable on large scale.The technology of pseudo viruses can be a safer alternative compared to live virus to allow the study of pathogen to host interaction and to test neutralizing activity of antibodies. Future experiments will investigate the role of specific antibodies in the maintenance of immunity after vaccination using the technology of pseudo viruses.

Questo protocollo descrive la produzione di PV di SARS-CoV-2 e un'applicazione a valle di questi PV per analizzare l'attività di neutralizzazione del siero/plasma di soggetti sottoposti a vaccinazione anti-COVID-1917. Inoltre, questo protocollo può essere applicato per produrre pseudotipi di ciascuna variante di SARS-CoV-2 che desta preoccupazione (VOC) per testare l'evoluzione della risposta neutralizzante. Nonostante questo protocollo faciliti lo studio della risposta immunitaria umorale dopo ...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Host-Virus Interactions with Pseudotyped Viruses at JoVE.com

I virus pseudotipizzati (PV) sono virioni difettosi di replicazione che vengono utilizzati per studiare le interazioni ospite-virus in condizioni più sicure rispetto alla manipolazione di virus autentici. Di seguito è presentato un protocollo dettagliato che mostra come i PV SARS-CoV-2 possono essere utilizzati per testare la capacità neutralizzante del siero dei pazienti dopo la vaccinazione COVID-19.

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in ...

I virus pseudotipizzati sono strumenti molecolari che possono essere utilizzati per studiare le interazioni ospite-virus e per testare l'attività neutralizzante dei campioni di siero. Nel lavoro che presentiamo oggi, verrà presentata una metodologia generale per produrre virus pseudotipizzati, basata su plasmidi liberi. Per i saggi di neutralizzazione, vengono generalmente utilizzati virus di tipo Y, ma sono altamente patogeni e non possono essere maneggiati in un laboratorio BSL-2, rendendo questo sistema puramente applicabile su larga scala.La tecnologia degli pseudo virus può essere un'alternativa più sicura rispetto al virus vivo per consentire lo studio dell'interazione tra patogeno e ospite e per testare l'attività neutralizzante degli anticorpi. Esperimenti futuri studieranno il ruolo di anticorpi specifici nel mantenimento dell'immunità dopo la vaccinazione utilizzando la tecnologia degli pseudo virus.

pseudotyped-viruses-as-molecular-tool-to-monitor-humoral-immune

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay

1.3K Views.  University of Verona. I virus pseudotipizzati sono strumenti molecolari che possono essere utilizzati per studiare le interazioni ospite-virus e per testare l'attività neutralizzante dei campioni di siero. Nel lavoro che presentiamo oggi, verrà presentata una metodologia generale per produrre virus pseudotipizzati, basata su plasmidi liberi. Per i saggi di neutralizzazione, vengono generalmente utilizzati virus di tipo Y, ma sono altamente patogeni e non possono essere maneggiati in un laboratorio BSL-2, rendend...

Video: Autore in primo piano: Studio delle interazioni ospite-virus con virus pseudotipizzati 

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in addition to their better-known use in gene therapy for the delivery of a gene of interest. PVs are replication defective because the viral genome is divided into different plasmids that are not incorporated into the PVs. This safe and versatile system allows the use of PVs in biosafety level 2 laboratories. Here, we present a general methodology to produce lentiviral PVs based on three plasmids as mentioned here: (1) the backbone plasmid carrying the reporter gene needed to monitor the infection; (2) the packaging plasmid carrying the genes for all the structural proteins needed to generate the PVs; (3) the envelope surface glycoprotein expression plasmid that determines virus tropism and mediates viral entry into the host cell. In this work, SARS-CoV-2 Spike is the envelope glycoprotein used for the production of non-replicative SARS-CoV-2 pseudotyped lentiviruses.
Briefly, packaging cells (HEK293T) were co-transfected with the three different plasmids using standard methods. After 48 h, the supernatant containing the PVs was harvested, filtered, and stored at -80 &#176;C. The infectivity of SARS-CoV-2 PVs was tested by studying the expression of the reporter gene (luciferase) in a target cell line 48 h after infection. The higher the value for relative luminescence units (RLUs), the higher the infection/transduction rate. Furthermore, the infectious PVs were added to the serially diluted serum samples to study the neutralization process of pseudoviruses' entry into target cells, measured as the reduction in RLU intensity: lower values corresponding to high neutralizing activity.

Pseudotyped viruses (PVs) are replication-defective virions that are used to study host-virus interactions under safer conditions than handling authentic viruses. Presented here is a detailed protocol that shows how SARS-CoV-2 PVs can be used to test the neutralizing ability of patients' serum after COVID-19 vaccination.

Ricerca

Immunologia e infezioni

SARS-CoV-2 Pseudotype Virus Production and Serum Neutralization Assay

To begin, in a six-well plate, seed one milliliter of human embryonic kidney 293T cells. Add two milliliters of complete DMEM. The next day, replace the medium with fresh antibiotic-free medium to prepare the cells for transfection.To transfect the adherent cells, first, prepare mix A by adding plasmid DNA to 100 microliters of Opti-MEM. Next, add 17.5 microliters of polyethylenimine to 100 microliters of Opti-MEM. Mix the contents of the mix A and B, then incubate.During incubation, gently flick the tube every three to four minutes to enhance mixing. Add the whole volume of the mixture to the plate with the HEK 293T cells. After 16 to 20 hours of transfection, replace the culture medium with fresh complete DMEM.Incubate the plate at 37 degrees Celsius under 5%carbon dioxide to produce the pseudotype viruses. After 72 hours of transfection, harvest the supernatant into a collection tube. Centrifuge the supernatant at 1, 600 G for seven minutes at room temperature.Then filter the supernatant through a 0.45 micrometer cellulose acetate filter. Distribute 50 microliters of complete DMEM in the wells of a 96-well plate. Leave row A empty.Add 100 microliters of the pseudovirus stock to the wells in row A.Next, pipette 50 microliters of the solution from row A to B.Repeat this process up to row G to obtain serial dilutions. Remove the exhausted medium from a plate with cultured susceptible HEK 293T ACE2 cells, and wash the cells with four milliliters of DPBS. Then detach the cells with one milliliter of trypsin EDTA in DPBS saline.Now add 50 microliters of the susceptible cell suspension into each well containing the pseudotype viruses. Incubate the plate at 37 degrees Celsius under 5%carbon dioxide for 48 hours. Add 100 microliters of the luciferase reagent to each well.After incubation, transfer the contents of each well into a black 96-well plate. Then read the plate in a plate reader. In a 96-well plate, add 50 microliters of fresh complete DMEM to columns one to 10 from rows B to H.Add 95 microliters of fresh complete DMEM to the corresponding wells of row A.Now add 50 microliters of complete DMEM to the wells in column 11 and 100 microliters of DMEM to column 12.Pipette five microliters of heat-inactivated serum samples to row A.With a multi-channel pipette, mix the samples in the first row and transfer 50 microliters of medium-containing serum from row A to B up to row H.Distribute 50 microliters of dilute pseudovirus containing medium to each well from columns one to 11. Incubate the plate at 37 degrees Celsius under 5%carbon dioxide for one hour. Prepare a suspension of susceptible HEK293T ACE2 cells in five milliliters.Add 50 microliters of the cell suspension to each well, then incubate before performing the luciferase assay. Lower serum dilution resulted in decreased viral entry into the cells. This is confirmed by the increased percentage of neutralization.