FACS Enrichment of Zebrafish Gut Cell Suspension for scRNAseq

Per eseguire l'ordinamento cellulare attivato dalla fluorescenza, o FACS, sulle cellule intestinali isolate dalle larve di zebrafish, utilizzare il campione di larve intere wild-type per impostare le porte della popolazione cellulare selezionata registrando 3.000 cellule sul citometro a flusso. Utilizzare un ugello da 100 micron e impostare Precisione ordinamento su Purezza a 4 vie. Mettere la provetta di raccolta contenente 200 microlitri di PBS con il 5% di siero fetale di vitello nel fax.

Caricare la sospensione cellulare preparata dall'intestino isolato e, dopo aver escluso i doppietti nelle cellule morte, ordinare le singole cellule vive o DAPI-negative nella provetta di raccolta. Tenere la provetta di raccolta su ghiaccio dopo la cernita delle cellule, utilizzando un controllo di vitalità con trypan blue. Contare il numero di cellule nella sospensione con un emocitometro.

Le cellule sono ora pronte per essere processate per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula. Utilizzare circa 20.000 cellule per campione.