Hepatocellular Carcinoma Tissue Dissociation for Organoid Culture

Per iniziare la dissociazione tissutale, raccogliere uno o due centimetri cubi di carcinoma epatocellulare o tessuto HTC da pazienti non trattati. Quindi posizionare il tessuto nella soluzione di conservazione dei tessuti e mantenerlo a quattro gradi Celsius fino alla lavorazione. A questo punto, preriscaldare le piastre di coltura cellulare a bassissima superficie di attacco per un'ora in un'incubatrice impostata a 37 gradi Celsius.

Scongelare l'estratto di membrana basale durante la notte a quattro gradi Celsius. Usando le forbici chirurgiche, tagliare il tessuto tumorale in piccoli pezzi su una capsula di Petri all'interno di una cappa a flusso laminare. Trasferisci questi pezzi in una provetta conica da 15 millilitri e aggiungi da cinque a 10 millilitri di terreno basale.

Con una pipetta barotropica, lavare via quanto più sangue possibile. Lasciare riposare la miscela per uno o due minuti prima di rimuovere parte del surnatante, comprese le cellule del sangue e i coaguli di grasso galleggianti. Successivamente, centrifugare la miscela a 300 g per cinque minuti a temperatura ambiente.

Quindi estrarre con cura il surnatante e aggiungere cinque millilitri di soluzione digestiva preriscaldata al tessuto tagliato. Posizionare la provetta a 37 gradi Celsius in un rotore per una digestione ottimale. Dopo 30 minuti di digestione iniziale, utilizzare un microscopio per cercare piccoli gruppi di cellule.

Per fermare la digestione, aggiungere cinque millilitri di terreno basale freddo alla provetta. Quindi utilizzare un filtro cellulare da 100 micrometri per setacciare un nuovo tubo da 50 millilitri. Riempire la provetta con terreno basale freddo fino a raggiungere un volume totale di 50 millilitri.

Quindi, centrifugare le cellule a due G per 10 minuti a otto gradi Celsius. Una volta completato, rimuovere con cautela il liquido surnatante. Risospendere il pellet in 50 millilitri di terreno basale freddo per ottenere il pellet cellulare per la placcatura degli organoidi.