Per eseguire la placcatura degli organoidi, rimuovere prima il surnatante dalla centrifuga e lavare le cellule di carcinoma epatocellulare. Risospendere le cellule nei 50 microlitri di estratto di membrana basale, o BME, per pozzetto, per la placcatura. Quindi, sospendere le celle in DMEM/F12 avanzato.
Quindi pipettare delicatamente gli aggregati cellulari fino a quando non si vede una sospensione uniforme. Aggiungere BME alla sospensione, assicurandosi che la concentrazione di BME sia compresa tra il 30 e il 50%Ora semina 50 microlitri di goccioline di BME con cluster di cellule al centro di una piastra a 24 pozzetti. Lasciare solidificare le goccioline a 37 gradi Celsius per 20 minuti.
Aggiungere 500 microlitri di terreno preriscaldato a ciascun pozzetto e incubare in un incubatore cellulare a 37 gradi Celsius. Rinfrescare il terreno di coltura ogni due o tre giorni. Dopo due settimane, sostituire il terreno di isolamento con il terreno di espansione degli organoidi.
Dopo 7-10 giorni di coltivazione, una volta che gli organoidi hanno raggiunto la densità appropriata, elaborare le colture secondo necessità. Per far passare gli organoidi, preriscaldare prima le piastre di coltura cellulare con superficie a bassissimo attacco in un incubatore. Quindi, scongelare il BME congelato durante la notte a quattro gradi Celsius fino a poco prima dell'uso.
Preriscaldare la soluzione di raccolta degli organoidi e il sostituto della tripsina a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Dopo la fase di preparazione, rimuovere il terreno di coltura dalla piastra di coltura dell'organoide. Quindi trasferire la sospensione organoide in una provetta da 15 millilitri.
Ora aggiungi la soluzione di raccolta degli organoidi in proporzione alla quantità di BME. Per miscelare la sospensione, utilizzare una pistola per pipette da 1000 microlitri per raschiare e pipettare su e giù. Dopo aver incubato la provetta a temperatura ambiente per 30 minuti, utilizzare una pipetta da un millilitro per aspirare con cura il BME.
Assicurarsi che il BME sia completamente dissolto. Monitorare l'estratto ogni 10 minuti fino a quando non è visibile un chiaro cluster di cellule organoidi. Quindi centrifugare a temperatura ambiente a 400 g per cinque minuti.
Rimuovere il più possibile il surnatante. Per avviare la digestione enzimatica degli organoidi del carcinoma epatocellulare, aggiungere da uno a cinque millilitri del sostituto della tripsina preriscaldato al pellet dell'organoide coltivato. Incubare la sospensione a 37 gradi Celsius per due minuti.
Usa un microscopio per verificare se gli organoidi si dissociano in piccoli gruppi da due a 10 cellule. Per arrestare la digestione, aggiungere un volume appropriato di terreno basale freddo. Quindi centrifugare gli organoidi a 400 g per cinque minuti a otto gradi Celsius.
Rimuovere con cautela quanto più surnatante possibile. Risospendere il numero desiderato di organoidi nella matrice appropriata per la placcatura. Ogni 10 giorni passano gli organoidi, a seconda della densità di crescita degli organoidi.
Gli sferoidi degli organoidi HCC sono stati osservati entro tre giorni dalla coltura. Sferoidi compatti con bordi arrotondati e citosol permeabile sono stati osservati il primo giorno di insediamento. Gli organoidi erano di dimensioni simili e avevano il diametro maggiore quando venivano coltivati in BME dal 30 al 50%.
Il BME è stato più frammentato al 10%, risultando negli organoidi più piccoli. Il BME era più intatto al 100%, ma ha portato a organoidi con diametro intermedio. L'organoide HCC proliferante ha raggiunto una dimensione superiore a 500 micrometri in ogni coltura dopo tre generazioni.
Organoidi HCC di dimensioni sostanziali superiori a 1000 micrometri sono stati ottenuti entro un periodo di coltura di 20 giorni.
