Questa ricerca è stata supportata dalla National Natural Science Foundation of China (82122048; 82003773; 82203380) e dalla Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2023A1515011416).

I tessuti sottoposti a biopsia umana sono stati ottenuti dal rispettivo paziente presso l'Ospedale Oncologico Affiliato e l'Istituto dell'Università di Medicina di Guangzhou ed è stato ottenuto il consenso informato dei pazienti. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli su tutti i materiali, i reagenti e gli strumenti utilizzati in questo protocollo.
1. Stabilire organoidi HCC derivati da pazienti da campioni chirurgici
NOTA: L'istituzione degli organoidi HCC comprende varie fasi, vale a dire la dissociazione dei tessuti, la placcatura degli organoidi, la coltura, il passaggio, la crioconservazione e la rianimazione. Il processo di dissociazione tissutale richiede una durata di 2 ore, mentre la semina degli organoidi su una piastra richiede circa 40 minuti. Successivamente, la generazione iniziale di organoidi HCC subisce un periodo di coltura di 10-14 giorni utilizzando terreno di isolamento HCC. Una volta raggiunta una densità soddisfacente, vengono condotti passaggi di organoidi, che richiedono 1 ora. Le colture successive degli organoidi vengono quindi mantenute utilizzando il terreno di espansione HCC per 7-10 giorni, che possono variare a seconda del tasso di crescita e delle condizioni degli organoidi.
<ol><li>Dissociazione tissutale<ol><li>Preparazione di forniture e materiali<ol><li>Prelevare 1-2 cm3 di tessuto HCC da pazienti che non hanno ricevuto alcun precedente trattamento locale o sistemico prima dell'operazione. Dopo la resezione chirurgica, mantenere il tessuto a 4 °C in soluzione di conservazione tissutale (Tabella 1) fino al trattamento. NOTA: Campioni di tessuto fresco di alta qualità sono essenziali per il successo dell'insediamento degli organoidi. È importante processare i campioni tempestivamente, idealmente entro 1-4 ore dalla resezione chirurgica per mantenere la vitalità dei tessuti. Eseguire tutte le procedure successive in ambiente asettico utilizzando materiali e reagenti sterili.</li>
			<li>Preriscaldare le piastre di coltura cellulare a bassissima superficie di attacco (24 pozzetti) per 1 ora in un incubatore a 37 °C. Scongelare l'estratto di membrana basale congelato (BME) per una notte a 4 °C fino a poco prima dell'uso. NOTA: Per garantire lo scongelamento completo del BME, è necessario metterlo sul ghiaccio per almeno 3 ore. La fusione completa del BME è essenziale per il successo della coltura di organoidi nelle fasi successive.</li>
			<li>Prima dell'uso, assicurarsi che la soluzione di digestione (Tabella 1) sia riscaldata a una temperatura di 37 °C. NOTA: Preparare la soluzione di digestione fresca in un ambiente asettico e utilizzarla prontamente.</li>
		</ol></li>
		<li>Flusso di elaborazione organizzativa<ol><li>In una cabina a flusso laminare, tagliare il tessuto tumorale in piccoli pezzi (0,5-1 mm3) utilizzando forbici chirurgiche su una piastra di Petri. Trasferire il tessuto tagliato in una provetta conica da 15 mL e aggiungere 5-10 mL di terreno basale (Tabella 1). NOTA: Il terreno basale (Tabella 1) può essere conservato a 4 °C per un massimo di 1 mese.</li>
			<li>Utilizzare una pipetta barotropica per lavare via quanto più sangue possibile e lasciarla riposare per 1-2 minuti per rimuovere parte del surnatante, comprese eventuali cellule del sangue e coaguli di grasso galleggianti. Ripetere questa procedura due volte.</li>
			<li>Centrifugare la miscela a 300 × g per 5 minuti a temperatura ambiente e rimuovere con cura il surnatante. Aggiungere 5 mL della soluzione di digestione preriscaldata (Tabella 1) al tessuto tagliato.</li>
			<li>Ruotare la provetta a 37 °C per la digestione.</li>
			<li>Dopo 30 minuti di digestione iniziale, cerca piccoli gruppi di cellule al microscopio. Controllare ogni 5-10 minuti per evitare una digestione eccessiva. NOTA: Il tempo necessario per la digestione dei tessuti dipenderà dalle dimensioni e dal tipo di tessuto. La digestione dei tessuti non deve superare i 90 min. Il tessuto iperdigerito apparirà al microscopio come un grande foglio di singole cellule. Il livello appropriato di digestione è indicato dal fatto che la maggior parte di questi sono gruppi di cellule e hanno un aspetto simile all'uva.</li>
			<li>Interrompere la digestione aggiungendo terreno basale freddo (Tabella 1) e filtrare in una nuova provetta da 50 mL con un filtro cellulare da 100 μm. Aggiungere terreno basale freddo a un volume di 50 ml.</li>
			<li>Centrifugare le cellule a 2 × g per 10 minuti a 8 °C. Rimuovere con cautela il surnatante e risospendere il pellet aggiungendo altri 50 mL di terreno basale freddo (Tabella 1). Ripeti questo passaggio due volte. NOTA: La centrifugazione a bassa velocità viene utilizzata per consentire ai piccoli gruppi di cellule di stabilizzarsi, mentre le cellule del sangue e i detriti cellulari sono ancora sospesi nel surnatante; Il processo viene ripetuto più volte per ottenere una massa cellulare tissutale relativamente pura.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Placcatura di organoidi<ol><li>Dopo il secondo lavaggio, rimuovere la maggior parte possibile del surnatante e risospendere il numero desiderato di cellule (1.000-5.000 cellule per pozzetto di una piastra a 24 pozzetti) nel BME appropriato per la placcatura. NOTA: Tenere sempre il BME a 4 °C prima dell'uso.</li>
		<li>Aggiungere BME e sospendere i cluster di piccole cellule in Advanced DMEM/F-12 aggiungendo BME e pipettando delicatamente su e giù fino a quando gli aggregati cellulari non sono completamente sospesi. Controllare la concentrazione del BME tra il 30% e il 50%.</li>
		<li>Seminare goccioline di 50 μL di BME mescolate con cluster di cellule al centro di piastre di coltura a 24 pozzetti. NOTA: Per quanto possibile, non lasciare che le goccioline si diffondano sulla parete laterale della piastra del pozzetto. La parete laterale della piastra a basso adsorbimento non è in uno stato a basso adsorbimento e il contatto tra le goccioline e la parete laterale porterà all'adesione, che non favorisce la successiva incubazione.</li>
		<li>Lasciare solidificare le piastre con le goccioline aggiunte a 37 °C per 20 min. Al termine dell'incubazione, aggiungere 500 μL di terreno preriscaldato (Tabella 1) a ciascun pozzetto e incubare in un incubatore cellulare a 37 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Coltura di organoidi<ol><li>Rinfrescare il terreno di coltura (Tabella 1) una volta ogni 2-3 giorni. All'inizio della coltura, coltivare gli organoidi di HCC in terreno di isolamento HCC (Tabella 1) per 2 settimane.</li>
		<li>Dopo 2 settimane di incubazione con terreno di isolamento HCC, sostituire il terreno con terreno di espansione organoide HCC (Tabella 1) (conservato a 4 °C per un massimo di 2 settimane).</li>
		<li>Rinfrescare il terreno di coltura una volta ogni 3 giorni.</li>
		<li>Dopo 7-10 giorni di coltura con terreno di espansione HCC, quando l'organoide ha raggiunto la densità o le dimensioni appropriate, iniziare interventi sperimentali o passaggio o liofilizzazione degli organoidi secondo necessità.</li>
	</ol></li>
	<li>Passaggio di organoidi<ol><li>Preparazione di forniture e materiali<ol><li>Preriscaldare le piastre di coltura cellulare a bassissima superficie di attacco (24 pozzetti) per 1 ora in un incubatore a 37 °C. Scongelare il BME congelato per una notte a 4 °C fino a poco prima dell'uso.</li>
			<li>Preriscaldare la soluzione di raccolta degli organoidi e il sostituto della tripsina a 37 °C per 30 min.</li>
		</ol></li>
		<li>Processo di passaggio<ol><li>Dopo aver rimosso il terreno di coltura dalla piastra del pozzetto, trasferire la sospensione dell'organoide in una provetta da 15 ml.</li>
			<li>Aggiungere la soluzione di raccolta degli organoidi in base alla quantità di BME (500 μL di soluzione per il prelievo di organoidi per 50 μL di BME) raschiando e pipettando su e giù utilizzando una pistola per pipette da 1.000 μL. NOTA: Evitare la formazione di bolle d'aria durante tutto il processo per evitare la perdita di organoidi, poiché la presenza di bolle d'aria indica una maggiore pressione di pipettaggio.</li>
			<li>Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.</li>
			<li>Aspirare delicatamente il BME con una pipetta da 1.000 μL e osservare che il BME sia completamente disciolto. Osservare ogni 10 minuti fino a quando non si osserva un gruppo di cellule organoidi chiare, quindi centrifugare a 400 × g per 5 minuti a temperatura ambiente e rimuovere quanto più surnatante possibile. NOTA: In questa fase, l'organoide può essere congelato e conservato.</li>
			<li>Per la digestione enzimatica degli organoidi, aggiungere 1-5 mL del sostituto della tripsina (in base al numero di organoidi) e incubare a 37 °C per 2 min. Osservare al microscopio il grado di digestione enzimatica per determinare se gli organoidi si dissociano in piccoli gruppi di 2-10 cellule; In caso contrario, continuare la digestione enzimatica. NOTA: L'eccessiva digestione comporterà la lisi di gruppi di cellule organoidi in singole cellule, diminuendone la vitalità e prolungando il successivo tempo di coltura.</li>
			<li>Aggiungere il volume appropriato di terreno basale freddo (Tabella 1) per arrestare la digestione.</li>
			<li>Centrifugare gli organoidi a 400 × g per 5 minuti a 8 °C; Rimuovere il surnatante il più possibile.</li>
			<li>Risospendere il numero desiderato di organoidi (1.000-5.000 organoidi per pozzetto di una piastra a 24 pozzetti) nella matrice appropriata per la placcatura. Seguire gli stessi passaggi della sezione 1.2. NOTA: La densità di placcatura deve essere ottimizzata in base al tasso di crescita e alle dimensioni degli organoidi.</li>
			<li>Far passare gli organoidi ogni 10 giorni in un rapporto di 1:3 o 1:4 a seconda della densità di crescita degli organoidi.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Crioconservazione e rianimazione di organoidi<ol><li>Crioconservazione di organoidi<ol><li>Preparare le provette di liofilizzazione, ciascuna delle quali confluisce con due pozzetti di una piastra a 24 pozzetti contenente organoidi.</li>
			<li>Seguire i passaggi da 1.4.2.1 a 1.4.2.4 per il passaggio degli organoidi per ottenere organoidi senza BME e risospendere delicatamente gli organoidi aggiungendo 500 μL/pozzetto di soluzione di liofilizzazione degli organoidi a una piastra a 24 pozzetti. NOTA: A seconda dello stato di crescita e delle dimensioni degli organoidi, si consiglia di crioconservare gli organoidi in coltura fino alla terza generazione.</li>
			<li>Trasferire la sospensione in tubi di liofilizzazione e posizionarla in una scatola raffreddata a gradiente a -80 °C. Dopo il raffreddamento a gradiente a -80 °C per almeno 24 ore, trasferire le provette in azoto liquido per la conservazione a lungo termine.</li>
		</ol></li>
		<li>Rianimazione di organoidi<ol><li>Incubare le provette liofilizzate a bagnomaria a 37 °C e interrompere l'incubazione quando rimane solo un piccolo blocco di ghiaccio.</li>
			<li>Centrifugare a 400 × g per 5 minuti a 8 °C per rimuovere completamente il surnatante.</li>
			<li>Seguire le sezioni 1.2 e 1.3 per le operazioni successive.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

Ottimizzazione della formazione di organoidi HCC per l'identificazione di bersagli e lo sviluppo di farmaci

<ol>
	<li>Vogel, A., Meyer, T., Sapisochin, G., Salem, R., Saborowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocellular+carcinoma.">Hepatocellular carcinoma.</a> Lancet. 400 (10360), 1345-1362 (2022).</li><li>Craig, A. J., von Felden, J., Garcia-Lezana, T., Sarcognato, S., Villanueva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+evolution+in+hepatocellular+carcinoma.">Tumour evolution in hepatocellular carcinoma.</a> Nature Reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 17 (3), 139-152 (2020).</li><li>Yang, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+view+of+hepatocellular+carcinoma:+trends,+risk,+prevention+and+management.">A global view of hepatocellular carcinoma: trends, risk, prevention and management.</a> Nature Reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 16 (10), 589-604 (2019).</li><li>Huang, A., Yang, X. R., Chung, W. Y., Dennison, A. R., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+therapy+for+hepatocellular+carcinoma.">Targeted therapy for hepatocellular carcinoma.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 146 (2020).</li><li>Cancer Genome Atlas Research Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+and+Integrative+Genomic+Characterization+of+Hepatocellular+Carcinoma.">Comprehensive and Integrative Genomic Characterization of Hepatocellular Carcinoma.</a> Cell. 169 (7), 1327.e23-1341.e23 (2017).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+primary+liver+cancer-derived+organoid+cultures+for+disease+modeling+and+drug+screening.">Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening.</a> Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).</li><li>Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+patient-derived+cancer+organoids+for+drug-screening+applications.">Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications.</a> Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).</li><li>Peng, W. C., Kraaier, L. J., Kluiver, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+organoids+and+cell+transplantation:+What+the+future+holds.">Hepatocyte organoids and cell transplantation: What the future holds.</a> Experimental &amp; Molecular Medicine. 53 (10), 1512-1528 (2021).</li><li>Nuciforo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+liver+cancers+derived+from+tumor+needle+biopsies.">Organoid models of human liver cancers derived from tumor needle biopsies.</a> Cell Reports. 24 (5), 1363-1376 (2018).</li><li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hepatocyte+differentiation+model+reveals+two+subtypes+of+liver+cancer+with+different+oncofetal+properties+and+therapeutic+targets.">A hepatocyte differentiation model reveals two subtypes of liver cancer with different oncofetal properties and therapeutic targets.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (11), 6103-6113 (2020).</li><li>Kong, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+tumor+lineage+plasticity+in+hepatocellular+carcinoma+using+an+anti-CLDN6+antibody-drug+conjugate.">Targeting tumor lineage plasticity in hepatocellular carcinoma using an anti-CLDN6 antibody-drug conjugate.</a> Science Translational Medicine. 13 (579), eabb6282 (2021).</li><li>Li, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+functional+characterization+of+potential+oncofetal+targets+in+human+hepatocellular+carcinoma.">Identification and functional characterization of potential oncofetal targets in human hepatocellular carcinoma.</a> STAR Protocols. 3 (4), 101921 (2022).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cell-mediated+therapeutic+resistance+in+hepatocellular+carcinoma.">Cancer stem cell-mediated therapeutic resistance in hepatocellular carcinoma.</a> Hepatoma Research. 8, 36 (2022).</li></ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Un notevole vantaggio dei modelli di organoidi derivati da pazienti risiede nella loro capacità di replicare fedelmente le caratteristiche biologiche dei tumori, comprendendo la struttura dei tessuti e il panorama genomico. Questi modelli dimostrano un notevole livello di accuratezza e rispecchiano efficacemente l'eterogeneità e la progressione dei tumori, anche su lunghi periodi di coltivazione 6,8,9. Attraverso l'utilizzo di...

Il carcinoma epatocellulare (HCC), un tumore 1 prevalente e ampiamentediversificato, ha attirato una notevole attenzione all'interno della comunità medica. La presenza di plasticità di lignaggio e di una sostanziale eterogeneità nell'HCC suggerisce che le cellule tumorali originate da vari pazienti e persino lesioni distinte all'interno dello stesso paziente possono manifestare tratti molecolari e fenotipici dissimili, presentando così formidabili ostacoli nell'avanzamento di approcci terapeutici innovativi 2,3,4,5 . Di conseguenza, vi è una necessità imperativa di una migliore comprensione degli attributi biologici e dei meccanismi di resistenza ai farmaci nell'HCC per informare la formulazione di strategie terapeutiche più efficaci.
Negli ultimi decenni, i ricercatori hanno dedicato i loro sforzi allo sviluppo di modelli in vitro allo scopo di studiare l'HCC 3,4. Nonostante alcuni progressi, le limitazioni persistono. Questi modelli comprendono una serie di tecniche, come l'utilizzo di linee cellulari, cellule primarie e xenotrapianti derivati da pazienti (PDX). Le linee cellulari fungono da modelli in vitro per la coltura a lungo termine di cellule tumorali ottenute da pazienti affetti da HCC, offrendo i vantaggi della praticità e della facilità di espansione. I modelli di cellule primarie prevedono l'isolamento diretto e la coltura di cellule tumorali primarie dai tessuti tumorali dei pazienti, fornendo così una rappresentazione delle caratteristiche biologiche che assomigliano molto a quelle dei pazienti stessi. I modelli PDX prevedono il trapianto di tessuti tumorali del paziente nei topi, con l'obiettivo di simulare più fedelmente la crescita e la risposta del tumore. Questi modelli sono stati fondamentali nella ricerca sull'HCC, ma possiedono alcune limitazioni, tra cui l'eterogeneità delle linee cellulari e l'incapacità di replicarsi completamente in condizioni in vivo. Inoltre, la coltivazione prolungata in vitro può comportare il deterioramento delle caratteristiche e delle funzionalità originali delle cellule, ponendo sfide nella rappresentazione accurata delle proprietà biologiche dell'HCC. Inoltre, l'utilizzo dei modelli PDX è dispendioso in termini di tempo e costoso3.
Per affrontare queste limitazioni e replicare in modo più accurato gli attributi fisiologici dell'HCC, l'utilizzo della tecnologia degli organoidi è stata introdotta come una promettente piattaforma di ricerca in grado di superare i vincoli precedenti. Gli organoidi, che sono modelli cellulari tridimensionali coltivati in vitro, hanno la capacità di replicare la struttura e la funzionalità degli organi reali. Tuttavia, nel contesto dell'HCC, esistono alcune sfide nella creazione di modelli di organoidi. Queste sfide includono descrizioni non sufficientemente dettagliate delle procedure di costruzione degli organoidi HCC, la mancanza di protocolli completi per l'intero processo di costruzione degli organoidi HCC e le dimensioni tipicamente ridotte degli organoidi coltivati 6,7,8. Alla luce delle dimensioni tipicamente limitate degli organoidi coltivati, abbiamo cercato di affrontare queste sfide attraverso lo sviluppo di un protocollo completo che comprenda l'intera costruzione degli organoidi HCC6. Questo protocollo comprende la dissociazione tissutale, la placcatura di organoidi, la coltura, il passaging, la crioconservazione e la rianimazione. Ottimizzando le fasi procedurali e perfezionando la composizione del terreno di coltura, abbiamo stabilito con successo modelli di organoidi HCC in grado di crescere e passare a lungo termine 6,8. Nelle sezioni successive, verrà presentato un resoconto completo delle complessità operative e dei fattori pertinenti coinvolti nella costruzione di organoidi HCC.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>[Leu15]-gastrin I human</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G9145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microtubes</td>
			<td>Merck</td>
			<td>AXYMCT150LC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A8301 (TGF&#946; inhibitor)</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement (503), minus vitamin A</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (503), serum-free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP7</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-03P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer size 100 &#956;m</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CLS352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SML1046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Merck</td>
			<td>11088858001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Costar Ultra-Low</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CLS3473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Organoid Harvesting Solution</td>
			<td>R&#38;D SYSTEMS</td>
			<td>3700-100-01</td>
			<td>Organoid harvesting solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Reduced Growth Factor BME, Type 2 PathClear (BME)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>3533-005-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Merck</td>
			<td>D5942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C6164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNaseI</td>
			<td>Merck</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/Ham&#39;s F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12634028</td>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Earle&#8217;s balanced salt solution (EBSS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24010043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, 1 M</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DM6 B Fluorescence Motorized Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement (1003)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A0737-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FGF10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FGF19</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human HGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-39</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-10C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rho kinase inhibitor Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spodin1-conditioned medium</td>
			<td>(Broutier et al.)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Secretion of cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical specimen of tumor removed from HCC patients</td>
			<td>Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF&#945;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12604013</td>
			<td>Trypsin substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt-3a-conditioned medium</td>
			<td>(Broutier et al.)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Secretion of cell lines</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development and optimization of a human hepatocellular carcinoma patient-derived organoid model for potential target identification and drug discovery

Il carcinoma epatocellulare (HCC) è un tumore altamente diffuso e letale in tutto il mondo e la sua scoperta tardiva e la mancanza di agenti terapeutici specifici efficaci richiedono ulteriori ricerche sulla sua patogenesi e sul suo trattamento. Gli organoidi, un nuovo modello che assomiglia molto al tessuto tumorale nativo e può essere coltivato in vitro, hanno suscitato un notevole interesse negli ultimi anni, con numerosi rapporti sullo sviluppo di modelli di organoidi per il cancro al fegato. In questo studio, abbiamo ottimizzato con successo la procedura e stabilito un protocollo di coltura che consente la formazione di organoidi HCC di dimensioni maggiori con condizioni stabili di passaggio e coltura. Abbiamo delineato in modo completo ogni fase della procedura, coprendo l'intero processo di dissociazione del tessuto HCC, placcatura di organoidi, coltura, passaging, crioconservazione e rianimazione, e abbiamo fornito precauzioni dettagliate in questo documento. Questi organoidi presentano una somiglianza genetica con i tessuti HCC originali e possono essere utilizzati per diverse applicazioni, tra cui l'identificazione di potenziali bersagli terapeutici per i tumori e il successivo sviluppo di farmaci.

Hepatocellular carcinoma (HCC), a prevalent and extensively diverse tumor1, has garnered considerable attention within the medical community. The presence of lineage plasticity and substantial heterogeneity in HCC suggests that tumor cells originating from various patients and even distinct lesions within the same patient may manifest dissimilar molecular and phenotypic traits, thereby presenting formidable obstacles in the advancement of innovative therapeutic approaches2,3,4,5. Consequently, there is an imperative need for enhanced comprehension of the biological attributes and mechanisms of drug resistance in HCC to inform the formulation of more efficacious treatment strategies.
In recent decades, researchers have dedicated their efforts to the development of in vitro models for the purpose of studying HCC3,4. Despite some advancements, limitations persist. These models encompass a range of techniques, such as the utilization of cell lines, primary cells, and patient-derived xenografts (PDX). Cell lines serve as in vitro models for long-term culture of tumor cells obtained from HCC patients, offering the benefits of convenience and facile expansion. Primary cell models involve direct isolation and culture of primary tumor cells from patient tumor tissues, thereby providing a representation of biological characteristics that closely resemble those of the patients themselves. PDX models entail the transplantation of patient tumor tissues into mice, with the aim of more faithfully simulating tumor growth and response. These models have been instrumental in HCC research, yet they possess certain limitations, including the heterogeneity of cell lines and the inability to fully replicate in vivo conditions. Furthermore, prolonged in vitro cultivation may result in the deterioration of the cells&#39; original characteristics and functionalities, posing challenges in accurately representing the biological properties of HCC. Additionally, the utilization of PDX models is both time-consuming and costly3.
To address these limitations and more accurately replicate the physiological attributes of HCC, the utilization of organoid technology has been introduced as a promising research platform capable of surpassing previous constraints. Organoids, which are three-dimensional cell models cultured in vitro, have the ability to replicate the structure and functionality of actual organs. However, in the context of HCC, there exist certain challenges in establishing organoid models. These challenges include insufficiently detailed descriptions of HCC organoid construction procedures, a lack of comprehensive protocols for the entire process of HCC organoid construction, and the typically small size of cultured organoids6,7,8. In light of the typically limited dimensions of cultured organoids, we endeavored to tackle these challenges through the development of a comprehensive protocol encompassing the entirety of HCC organoid construction6. This protocol encompasses tissue dissociation, organoid plating, culture, passaging, cryopreservation, and resuscitation. By optimizing the procedural steps and refining the composition of the culture medium, we have successfully established HCC organoid models capable of sustained growth and long-term passaging6,8. In the subsequent sections, a comprehensive account of the operational intricacies and pertinent factors involved in the construction of HCC organoids will be presented.

Autore in primo piano: Indagine sulla patogenesi del cancro al fegato utilizzando organoidi derivati da pazienti 

Sviluppo e ottimizzazione di un modello di organoide derivato da pazienti affetti da carcinoma epatocellulare umano per l'identificazione di potenziali bersagli e la scoperta di farmaci

Our lab aims to investigate the molecular pathogenesis of liver cancer and identify novel therapeutic targets for drug development. We would like to answer how cancer initiates, metastasis, and progress to drug tolerance utilizing novel disease models such as patient derived organoids. The current experimental challenges are in two aspects.First, there is a lack of complete set of protocols for constructing hepatocellular carcinoma organoids for the whole process. Second, the size of cultured HCC organoids is too small for subsequent experimental processing. In this protocol, we provide the details of the optimized organoids culture and subsequent transfer and freezing procedures, as well as the precautions to be taken during all the procedures.We optimized the composition of the organoid medium for organoids with close to the original tissue characteristics. We may monitor the tumor evolution using the patient-derived organoids and try to identify novel molecular and therapeutic targets for HCC treatment.

Dopo aver implementato la procedura di cui sopra, l'emergere di sferoidi organoidi HCC è tipicamente osservabile nell'arco di 3 giorni (Figura 1). La Figura 1A,B mostra l'organoide HCC stabilito, che sviluppa prontamente sferoidi compatti caratterizzati da bordi arrotondati e citosol permeabile il primo giorno di stabilimento. Durante la crescita degli organoidi HCC, l'uso di diverse concentrazioni di BME ha avuto effetti diversi sul tasso di c...

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Forniamo una panoramica completa e un perfezionamento dei protocolli esistenti per la formazione di organoidi del carcinoma epatocellulare (HCC), comprendendo tutte le fasi della coltivazione degli organoidi. Questo sistema funge da modello prezioso per l'identificazione di potenziali bersagli terapeutici e la valutazione dell'efficacia dei farmaci candidati.

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a highly prevalent and lethal tumor worldwide and its late discovery and lack of effective specific therapeutic agents ...

Il nostro laboratorio ha lo scopo di studiare la patogenesi molecolare del cancro del fegato e identificare nuovi bersagli terapeutici per lo sviluppo di farmaci. Vorremmo rispondere a come il cancro inizia, metastasi e progredisce verso la tolleranza ai farmaci utilizzando nuovi modelli di malattia come gli organoidi derivati dal paziente. Le attuali sfide sperimentali riguardano due aspetti.In primo luogo, manca un set completo di protocolli per la costruzione di organoidi di carcinoma epatocellulare per l'intero processo. In secondo luogo, la dimensione degli organoidi HCC coltivati è troppo piccola per la successiva elaborazione sperimentale. In questo protocollo, forniamo i dettagli della coltura degli organoidi ottimizzati e delle successive procedure di trasferimento e congelamento, nonché le precauzioni da prendere durante tutte le procedure.Abbiamo ottimizzato la composizione del terreno organoide per organoidi con caratteristiche tissutali vicine a quelle originali. Possiamo monitorare l'evoluzione del tumore utilizzando gli organoidi derivati dal paziente e cercare di identificare nuovi bersagli molecolari e terapeutici per il trattamento dell'HCC.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Development and Optimization of A Human Hepatocellular Carcinoma Patient-Derived Organoid Model for Potential Target Identification and Drug Discovery

982 Views.  Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University. Il nostro laboratorio ha lo scopo di studiare la patogenesi molecolare del cancro del fegato e identificare nuovi bersagli terapeutici per lo sviluppo di farmaci. Vorremmo rispondere a come il cancro inizia, metastasi e progredisce verso la tolleranza ai farmaci utilizzando nuovi modelli di malattia come gli organoidi derivati dal paziente. Le attuali sfide sperimentali riguardano due aspetti.In primo luogo, manca un set completo di protocolli per la costruzione di organoidi di carcino...

Video: Autore in primo piano: Indagine sulla patogenesi del cancro al fegato utilizzando organoidi derivati da pazienti 

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a highly prevalent and lethal tumor worldwide and its late discovery and lack of effective specific therapeutic agents necessitate further research into its pathogenesis and treatment. Organoids, a novel model that closely resembles native tumor tissue and can be cultured in vitro, have garnered significant interest in recent years, with numerous reports on the development of organoid models for liver cancer. In this study, we have successfully optimized the procedure and established a culture protocol that enables the formation of larger-sized HCC organoids with stable passaging and culture conditions. We have comprehensively outlined each step of the procedure, covering the entire process of HCC tissue dissociation, organoid plating, culture, passaging, cryopreservation, and resuscitation, and provided detailed precautions in this paper. These organoids exhibit genetic similarity to the original HCC tissues and can be utilized for diverse applications, including the identification of potential therapeutic targets for tumors and subsequent drug development.

We provide a comprehensive overview and refinement of existing protocols for hepatocellular carcinoma (HCC) organoid formation, encompassing all stages of organoid cultivation. This system serves as a valuable model for the identification of potential therapeutic targets and the assessment of drug candidate effectiveness.

Ricerca

Ricerca sul cancro

Hepatocellular Carcinoma Tissue Dissociation for Organoid Culture

To begin the tissue dissociation, collect one to two cubic centimeters of hepatocellular carcinoma or HTC tissue from untreated patients. Then place the tissue in the tissue preservation solution and maintain it at four degrees Celsius until processing. Now, preheat the ultra-low attachment surface cell culture plates for one hour in an incubator set at 37 degrees Celsius.Thaw the basement membrane extract overnight at four degrees Celsius. Using surgical scissors, cut the tumor tissue into small pieces on a Petri dish inside a laminar flow hood. Transfer these pieces into a 15-milliliter conical tube and add five to 10 milliliters of basal medium.With a barotropic pipette, wash away as much blood as possible. Allow the mixture to settle for one to two minutes before removing some of the supernatant, including any blood cells and floating fat clots. Next, centrifuge the mixture at 300 G for five minutes at room temperature.Then carefully extract the supernatant and add five milliliters of pre-warmed digestion solution to the trimmed tissue. Place the tube at 37 degrees Celsius in a rotor for optimum digestion. After 30 minutes of initial digestion, use a microscope to look for small cell clusters.To stop the digestion, add five milliliters of cold basal medium to the tube. Then use a 100-micrometer cell filter to sieve into a new 50-milliliter tube. Fill up the tube with cold basal medium to reach a total volume of 50 milliliters.Next, centrifuge the cells at two G for 10 minutes at eight degrees Celsius. Once complete, carefully remove the supernatant liquid. Re-suspend the pellet in 50 milliliters of cold basal medium to obtain the cell pellet for organoid plating.

Dissociazione tissutale del carcinoma epatocellulare per coltura di organoidi

Hepatocellular Carcinoma Organoid Culture and Digestion to Study Liver Cancer Pathogenesis

To perform organoid plating, first, remove the supernatant from the centrifuge and washed hepatocellular carcinoma cells. Re-suspend the cells in the 50 microliters of basement membrane extract, or BME, per well, for plating. Next, suspend the cells in advanced DMEM/F12.Then gently pipette the cell aggregates until an even suspension is seen. Add BME to the suspension, ensuring that the BME concentration is between 30 and 50%Now seed 50 microliters of BME droplets with cell clusters in the center of a 24 well plate. Allow the droplets to solidify at 37 degrees Celsius for 20 minutes.Add 500 microliters of prewarmed medium to each well and incubate in a cell incubator at 37 degrees Celsius. Refresh the culture medium every two to three days. After two weeks, replace the isolation medium with the organoid expansion medium.After seven to 10 days of culturing, once the organoids have reached the appropriate density, process the cultures as needed. To passage the organoids, first preheat ultra low attachment surface cell culture plates in an incubator. Next, thaw the frozen BME overnight at four degrees Celsius until right before usage.Prewarm the organoid harvest solution and trypsin substitute at 37 degrees Celsius for 30 minutes. Following the preparation stage, remove the culture medium from the organoid culture plate. Then transfer the organoid suspension into a 15 milliliter tube.Now add organoid harvesting solution in proportion to the amount of BME. To mix the suspension, use a 1000 microliter pipette gun to scrape and pipette up and down. After incubating the tube at room temperature for 30 minutes, use a one milliliter pipette to carefully aspirate the BME.Ensure that the BME is fully dissolved. Monitor the extract every 10 minutes until a clear organoid cell cluster is visible. Then centrifuge at room temperature at 400 g for five minutes.Remove as much of the supernatant as feasible. To start enzymatic digestion of the hepatocellular carcinoma organoids, add one to five milliliters of the prewarmed trypsin substitute to the cultured organoid pellet. Incubate the suspension at 37 degrees Celsius for two minutes.Use a microscope to verify if organoids dissociate into small clusters of two to 10 cells. To stop the digestion, add an appropriate volume of cold basal medium. Then centrifuge the organoids at 400 g for five minutes at eight degrees Celsius.Carefully remove as much supernatant as possible. Re-suspend the desired number of organoids in the proper matrix for plating. Every 10 days passage the organoids, depending on the density of organoid growth.HCC organoids spheroids were observed within three days of culture. Compact spheroids with rounded edges and permeable cytosol were seen on the initial day of establishment. Organoids were similarly sized and had the largest diameter when cultured in 30 to 50%BME.The BME was most fragmented at 10%resulting in the smallest organoids. The BME was most intact at 100%but resulted in organoids with intermediate diameter. The proliferating HCC organoid attained a size exceeding 500 micrometers in each culture after three generations.Substantially sized HCC organoids of higher than 1000 micrometers were obtained within a 20 day culture period.