מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82122048; 82003773; 82203380) וקרן המחקר הבסיסית והיישומית גואנגדונג (2023A1515011416).

רקמות ביופסיה אנושית התקבלו מהמטופל בהתאמה בבית החולים לסרטן המסונף ובמכון של האוניברסיטה הרפואית גואנגז'ו, והתקבלה הסכמה מדעת מהמטופלים. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על כל החומרים, הריאגנטים והמכשירים המשמשים בפרוטוקול זה.
1. קביעת אורגנואידים HCC שמקורם במטופל מדגימות כירורגיות
הערה: הקמת אורגנואידים HCC מקיפה שלבים שונים, כלומר דיסוציאציה של רקמות, ציפוי אורגנואידים, תרבית, מעבר, שימור בהקפאה והחייאה. תהליך הדיסוציאציה של רקמות דורש משך של שעתיים, בעוד שזריעת אורגנואידים על צלחת אורכת כ-40 דקות. לאחר מכן, הדור הראשוני של אורגנואידים HCC עובר תקופת תרבית של 10-14 ימים באמצעות מדיום בידוד HCC. ברגע שמושגת צפיפות משביעת רצון, מתבצעים מעברי אורגנואידים, הדורשים שעה אחת. תרביות עוקבות של האורגנואידים נשמרות לאחר מכן באמצעות מדיום הרחבת HCC למשך 7-10 ימים, אשר עשויים להשתנות בהתאם לקצב הצמיחה ומצב האורגנואידים.
<ol><li>דיסוציאציה של רקמות<ol><li>הכנת אספקה וחומרים<ol><li>לאסוף 1-2 ס"מ3 מרקמת HCC מחולים שלא קיבלו טיפול מקומי או סיסטמי קודם לפני הניתוח. לאחר כריתה כירורגית, יש לשמור את הרקמה בטמפרטורה של 4°C בתמיסת שימור רקמות (טבלה 1) עד לעיבוד. הערה: דגימות רקמה טריות באיכות גבוהה חיוניות להקמה מוצלחת של אורגנואידים. חשוב לעבד דגימות באופן מיידי, רצוי תוך 1-4 שעות לאחר כריתה כירורגית כדי לשמור על כדאיות הרקמות. בצע את כל ההליכים הבאים בסביבה אספטית באמצעות חומרים סטריליים וריאגנטים.</li>
			<li>חממו מראש לוחות תרבית תאי שטח חיבור נמוכים במיוחד (24 בארות) למשך שעה אחת באינקובטור ב -37 מעלות צלזיוס. הפשירו את תמצית קרום המרתף הקפואה (BME) למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C צלזיוס עד ממש לפני השימוש. הערה: כדי להבטיח הפשרה מלאה של BME, יש להניח אותו על קרח למשך 3 שעות לפחות. התכה מלאה של BME חיונית לתרבית אורגנואידים מוצלחת בשלבים הבאים.</li>
			<li>לפני השימוש, ודא שתמיסת העיכול (טבלה 1) מחוממת לטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. הערה: הכינו את תמיסת העיכול טרייה בסביבה אספטית והשתמשו בה מיד.</li>
		</ol></li>
		<li>זרימת עיבוד ארגונית<ol><li>בארון זרימה למינרית, חותכים את רקמת הגידול לחתיכות קטנות (0.5-1 מ"מ3) באמצעות מספריים כירורגיים על צלחת פטרי. העבר את הרקמה החתוכה לצינור חרוטי של 15 מ"ל והוסף 5-10 מ"ל של מדיום בסיסי (טבלה 1). הערה: ניתן לאחסן את המדיום הבסיסי (טבלה 1) ב-4°C למשך עד חודש אחד.</li>
			<li>השתמשו בפיפט ברוטרופי כדי לשטוף כמה שיותר דם ותנו לו לעמוד 1-2 דקות כדי להסיר חלק מהסופרנטנט, כולל תאי דם וקרישי שומן צפים. חזור על הליך זה פעמיים.</li>
			<li>צנטריפוגות את התערובת ב 300 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, ובזהירות להסיר את supernatant. הוסף 5 מ"ל של תמיסת העיכול המחוממת מראש (טבלה 1) לרקמה החתוכה.</li>
			<li>סובב את הצינור ב 37 ° C לעיכול.</li>
			<li>לאחר 30 דקות של עיכול ראשוני, לחפש אשכולות קטנים של תאים מתחת למיקרוסקופ. בדוק כל 5-10 דקות כדי למנוע עיכול יתר. הערה: הזמן הדרוש לעיכול רקמות יהיה תלוי בגודל ובסוג הרקמה. עיכול רקמות לא יעלה על 90 דקות. רקמה מעוכלת יתר תופיע מתחת למיקרוסקופ כיריעה גדולה של תאים בודדים. רמת העיכול המתאימה מסומנת על ידי העובדה כי רוב אלה הם אשכולות תאים ויש להם מראה דמוי ענבים.</li>
			<li>עצור את העיכול על-ידי הוספת מדיום בסיסי קר (טבלה 1) וסנן לתוך צינור חדש של 50 מ"ל עם מסנן תאים של 100 מיקרומטר. מוסיפים מדיום בסיסי קר לנפח של 50 מ"ל.</li>
			<li>צנטריפוגה את התאים ב 2 × גרם במשך 10 דקות ב 8 ° C. הסר בזהירות את הסופרנאטנט והשהה מחדש את הגלולה על-ידי הוספת 50 מ"ל נוספים של מדיום בסיסי קר (טבלה 1). חזור על שלב זה פעמיים. הערה: צנטריפוגה במהירות נמוכה משמשת כדי לאפשר לצברי תאים קטנים להתיישב, בעוד תאי דם ופסולת תאים עדיין מרחפים בסופרנטנט; התהליך חוזר על עצמו מספר פעמים כדי להשיג מסת תאי רקמה טהורה יחסית.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>ציפוי אורגנואיד<ol><li>לאחר השטיפה השנייה, מוציאים כמה שיותר מהסופרנאטנט ומשהים מחדש את מספר התאים הרצוי (1,000-5,000 תאים לבאר של צלחת בת 24 בארות) ב-BME המתאים לציפוי. הערה: יש לשמור תמיד את ה-BME על 4°C לפני השימוש.</li>
		<li>הוסף BME והשהה אשכולות תאים קטנים ב- DMEM/F-12 מתקדם על-ידי הוספת BME ופיפטציה עדינה למעלה ולמטה עד לצברי התאים מושהים לחלוטין. לשלוט על ריכוז BME בין 30% ל 50%.</li>
		<li>זרע 50 μL טיפות BME מעורבב עם אשכולות תאים במרכז לוחות תרבית 24 בארות. הערה: ככל האפשר, אל תתנו לטיפות להתפשט לדופן הדופן של צלחת הבאר. דופן לוחית הספיחה הנמוכה אינה במצב ספיחה נמוכה, ומגע בין הטיפות לדופן יוביל להידבקות, שאינה תורמת לדגירת ההמשך לאחר מכן.</li>
		<li>אפשר ללוחות עם הטיפות הנוספות להתמצק ב-37°C למשך 20 דקות. בסוף הדגירה מוסיפים 500 מיקרוליטר של מדיום שחומם מראש (טבלה 1) לכל באר ודגרים באינקובטור תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol></li>
	<li>תרבית אורגנואידים<ol><li>רעננו את מדיום התרבות (טבלה 1) אחת ליומיים-שלושה. בתחילת התרבית, תרבית את אורגנואידי HCC בתווך בידוד HCC (טבלה 1) במשך שבועיים.</li>
		<li>לאחר שבועיים של דגירה עם מדיום בידוד HCC, החלף את המדיום בתווך הרחבת אורגנואיד HCC (טבלה 1) (מאוחסן ב -4 ° C למשך עד שבועיים).</li>
		<li>רעננו את מדיום התרבות אחת ל-3 ימים.</li>
		<li>לאחר 7-10 ימים של תרבית עם מדיום התפשטות HCC כאשר האורגנואיד הגיע לצפיפות או לגודל המתאימים, התחל התערבויות ניסיוניות או מעבר או ליופיליזציה של האורגנואידים לפי הצורך.</li>
	</ol></li>
	<li>מעבר אורגנואיד<ol><li>הכנת אספקה וחומרים<ol><li>חממו מראש לוחות תרבית תאי שטח חיבור נמוכים במיוחד (24 בארות) למשך שעה אחת באינקובטור ב -37 מעלות צלזיוס. הפשירו BME קפוא למשך הלילה ב-4°C צלזיוס עד ממש לפני השימוש.</li>
			<li>יש לחמם מראש את תמיסת קציר האורגנואידים ולהחליף טריפסין בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות.</li>
		</ol></li>
		<li>תהליך מעבר<ol><li>לאחר הסרת מדיום התרבית מצלחת הבאר, מעבירים את מתלה האורגנואיד לצינור 15 מ"ל.</li>
			<li>הוסף תמיסת קציר אורגנואידים בהתאם לכמות BME (500 μL של תמיסת קציר אורגנואידים לכל 50 μL של BME) על ידי גירוד ו pipeting למעלה ולמטה באמצעות אקדח פיפטה 1,000 μL. הערה: הימנע מבועות אוויר לאורך כל התהליך כדי למנוע אובדן אורגנואידים מכיוון שנוכחות של בועות אוויר מצביעה על לחץ פיפטינג גבוה יותר.</li>
			<li>יש לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
			<li>שאפו בעדינות את ה-BME עם פיפטה של 1,000 μL ושימו לב שה-BME מומס לחלוטין. התבוננו כל 10 דקות עד שנצפה צביר תאי אורגנואיד ברור, ואז צנטריפוגה ב 400 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר והוציאו כמה שיותר מהסופרנאטנט. הערה: בשלב זה ניתן להקפיא ולשמר את האורגנואיד.</li>
			<li>לעיכול אנזימטי של אורגנואידים, יש להוסיף 1-5 מ"ל של תחליף טריפסין (בהתאם למספר האורגנואידים) ולדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 2 דקות. התבונן תחת המיקרוסקופ את מידת העיכול האנזימטי כדי לקבוע אם האורגנואידים מתפרקים לאשכולות קטנים של 2-10 תאים; אם לא, להמשיך את העיכול האנזימטי. הערה: עיכול יתר יגרום לליזה של צבירי תאים אורגנואידים לתאים בודדים, מה שיפחית את יכולת הקיום שלהם ויאריך את זמן התרבית שלאחר מכן.</li>
			<li>הוסף את הנפח המתאים של מדיום בסיסי קר (טבלה 1) כדי לעצור את העיכול.</li>
			<li>צנטריפוגה אורגנואידים ב 400 × גרם במשך 5 דקות ב 8 °C (8 °F); הסר את הסופרנאטנט ככל האפשר.</li>
			<li>השהה מחדש את מספר האורגנואידים הרצוי (1,000-5,000 אורגנואידים לבאר של צלחת בת 24 בארות) במטריצה המתאימה לציפוי. בצע את אותם השלבים כמו בסעיף 1.2. הערה: צפיפות הציפוי צריכה להיות אופטימלית בהתאם לקצב הגידול והגודל של האורגנואידים.</li>
			<li>עברו את האורגנואידים כל 10 ימים ביחס של 1:3 או 1:4 בהתאם לצפיפות גדילת האורגנואידים.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>שימור והחייאה בהקפאה אורגנואידית<ol><li>שימור בהקפאה של אורגנואידים<ol><li>הכינו צינורות ליופיליזציה, כל צינור נפגש עם שתי בארות של צלחת 24 בארות המכילה אורגנואידים.</li>
			<li>בצע את השלבים 1.4.2.1 עד 1.4.2.4 עבור מעבר אורגנואידים לקבלת אורגנואידים ללא BME, והשהה מחדש בעדינות את האורגנואידים על ידי הוספת 500 μL / well של תמיסת ליופיליזציה אורגנואידית לצלחת של 24 בארות. הערה: בהתאם למצב הגידול והגודל של האורגנואידים, מומלץ לשמר בהקפאה את האורגנואידים בתרבית עד הדור השלישי.</li>
			<li>מעבירים את המתלה לצינורות ליופיליזציה ומניחים אותו בקופסה מקוררת הדרגתית בטמפרטורה של -80°C. לאחר קירור הדרגתי בטמפרטורה של -80°C למשך 24 שעות לפחות, העבירו את הצינורות לחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.</li>
		</ol></li>
		<li>החייאה של אורגנואידים<ol><li>יש לדגור על צינורות ליופיליים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס ולהפסיק את הדגירה כאשר נותר רק גוש קרח קטן.</li>
			<li>צנטריפוגה ב 400 × גרם במשך 5 דקות ב 8 ° C כדי להסיר את supernatant לחלוטין.</li>
			<li>בצע את סעיפים 1.2 ו- 1.3 עבור הפעולות הבאות.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

אופטימיזציה של היווצרות אורגנואיד HCC לזיהוי מטרות ופיתוח תרופות

<ol>
	<li>Vogel, A., Meyer, T., Sapisochin, G., Salem, R., Saborowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocellular+carcinoma.">Hepatocellular carcinoma.</a> Lancet. 400 (10360), 1345-1362 (2022).</li><li>Craig, A. J., von Felden, J., Garcia-Lezana, T., Sarcognato, S., Villanueva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+evolution+in+hepatocellular+carcinoma.">Tumour evolution in hepatocellular carcinoma.</a> Nature Reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 17 (3), 139-152 (2020).</li><li>Yang, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+view+of+hepatocellular+carcinoma:+trends,+risk,+prevention+and+management.">A global view of hepatocellular carcinoma: trends, risk, prevention and management.</a> Nature Reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 16 (10), 589-604 (2019).</li><li>Huang, A., Yang, X. R., Chung, W. Y., Dennison, A. R., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+therapy+for+hepatocellular+carcinoma.">Targeted therapy for hepatocellular carcinoma.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 146 (2020).</li><li>Cancer Genome Atlas Research Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+and+Integrative+Genomic+Characterization+of+Hepatocellular+Carcinoma.">Comprehensive and Integrative Genomic Characterization of Hepatocellular Carcinoma.</a> Cell. 169 (7), 1327.e23-1341.e23 (2017).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+primary+liver+cancer-derived+organoid+cultures+for+disease+modeling+and+drug+screening.">Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening.</a> Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).</li><li>Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+patient-derived+cancer+organoids+for+drug-screening+applications.">Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications.</a> Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).</li><li>Peng, W. C., Kraaier, L. J., Kluiver, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+organoids+and+cell+transplantation:+What+the+future+holds.">Hepatocyte organoids and cell transplantation: What the future holds.</a> Experimental &amp; Molecular Medicine. 53 (10), 1512-1528 (2021).</li><li>Nuciforo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+liver+cancers+derived+from+tumor+needle+biopsies.">Organoid models of human liver cancers derived from tumor needle biopsies.</a> Cell Reports. 24 (5), 1363-1376 (2018).</li><li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hepatocyte+differentiation+model+reveals+two+subtypes+of+liver+cancer+with+different+oncofetal+properties+and+therapeutic+targets.">A hepatocyte differentiation model reveals two subtypes of liver cancer with different oncofetal properties and therapeutic targets.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (11), 6103-6113 (2020).</li><li>Kong, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+tumor+lineage+plasticity+in+hepatocellular+carcinoma+using+an+anti-CLDN6+antibody-drug+conjugate.">Targeting tumor lineage plasticity in hepatocellular carcinoma using an anti-CLDN6 antibody-drug conjugate.</a> Science Translational Medicine. 13 (579), eabb6282 (2021).</li><li>Li, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+functional+characterization+of+potential+oncofetal+targets+in+human+hepatocellular+carcinoma.">Identification and functional characterization of potential oncofetal targets in human hepatocellular carcinoma.</a> STAR Protocols. 3 (4), 101921 (2022).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cell-mediated+therapeutic+resistance+in+hepatocellular+carcinoma.">Cancer stem cell-mediated therapeutic resistance in hepatocellular carcinoma.</a> Hepatoma Research. 8, 36 (2022).</li></ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

אחד היתרונות הבולטים של מודלים אורגנואידים שמקורם במטופל טמון ביכולתם לשכפל נאמנה את המאפיינים הביולוגיים של גידולים, המקיפים את מבנה הרקמה ואת הנוף הגנומי. מודלים אלה מפגינים רמת דיוק יוצאת דופן ומשקפים ביעילות את ההטרוגניות וההתקדמות של גידולים, אפילו לאורך תקופות ממושכות של גידול<sup c...

קרצינומה הפטוצלולרית (HCC), גידול נפוץ ומגוון1, זכה לתשומת לב רבה בקהילה הרפואית. נוכחותה של פלסטיות שושלת והטרוגניות משמעותית ב-HCC מצביעה על כך שתאי גידול שמקורם בחולים שונים ואף בנגעים מובחנים בתוך אותו מטופל עשויים להפגין תכונות מולקולריות ופנוטיפיות שונות, ובכך להציב מכשולים עצומים בקידום גישות טיפוליות חדשניות 2,3,4,5 . כתוצאה מכך, יש צורך הכרחי בהבנה משופרת של התכונות והמנגנונים הביולוגיים של עמידות לתרופות ב- HCC כדי ליידע את הניסוח של אסטרטגיות טיפול יעילות יותר.
בעשורים האחרונים, חוקרים הקדישו את מאמציהם לפיתוח מודלים חוץ גופיים לצורך חקר HCC 3,4. למרות התקדמות מסוימת, המגבלות נמשכות. מודלים אלה מקיפים מגוון טכניקות, כגון ניצול קווי תאים, תאים ראשוניים וקסנוגרפטים שמקורם במטופל (PDX). קווי תאים משמשים כמודלים במבחנה לתרבית ארוכת טווח של תאי גידול המתקבלים מחולי HCC, ומציעים את היתרונות של נוחות והרחבה קלה. מודלים של תאים ראשוניים כוללים בידוד ישיר ותרבית של תאי גידול ראשוניים מרקמות הגידול של המטופל, ובכך מספקים ייצוג של מאפיינים ביולוגיים הדומים מאוד לאלה של החולים עצמם. מודלים של PDX כוללים השתלה של רקמות גידול של חולים בעכברים, במטרה לדמות בצורה נאמנה יותר את צמיחת הגידול ואת תגובתו. מודלים אלה סייעו במחקר HCC, אך יש להם מגבלות מסוימות, כולל ההטרוגניות של קווי תאים וחוסר היכולת לשכפל באופן מלא בתנאי vivo. יתר על כן, גידול מבחנה ממושך עלול לגרום להידרדרות המאפיינים והתפקודים המקוריים של התאים, מה שמציב אתגרים בייצוג מדויק של התכונות הביולוגיות של HCC. בנוסף, השימוש בדגמי PDX גוזל זמן ויקר3.
כדי להתמודד עם מגבלות אלה ולשכפל בצורה מדויקת יותר את התכונות הפיזיולוגיות של HCC, השימוש בטכנולוגיית אורגנואידים הוצג כפלטפורמת מחקר מבטיחה המסוגלת להתעלות על אילוצים קודמים. לאורגנואידים, שהם מודלים תלת-ממדיים של תאים בתרבית חוץ גופית, יש את היכולת לשכפל את המבנה והפונקציונליות של איברים בפועל. עם זאת, בהקשר של HCC, קיימים אתגרים מסוימים בהקמת מודלים אורגנואידים. אתגרים אלה כוללים תיאורים לא מפורטים מספיק של הליכי בניית אורגנואידים של HCC, היעדר פרוטוקולים מקיפים לכל התהליך של בניית אורגנואידים של HCC, והגודל הקטן בדרך כלל של אורגנואידים בתרבית 6,7,8. לאור הממדים המוגבלים בדרך כלל של אורגנואידים מתורבתים, השתדלנו להתמודד עם אתגרים אלה באמצעות פיתוח פרוטוקול מקיף המקיף את כל מבנה האורגנואידים של HCC6. פרוטוקול זה כולל דיסוציאציה של רקמות, ציפוי אורגנואידים, תרבית, מעבר, שימור בהקפאה והחייאה. על ידי אופטימיזציה של הצעדים הפרוצדורליים ושכלול הרכב מדיום התרבות, ביססנו בהצלחה מודלים אורגנואידים של HCC המסוגלים לצמיחה מתמשכת ומעבר ארוך טווח 6,8. בפרקים הבאים יוצג תיאור מקיף של המורכבויות התפעוליות והגורמים הרלוונטיים המעורבים בבניית אורגנואידים של HCC.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>[Leu15]-gastrin I human</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G9145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microtubes</td>
			<td>Merck</td>
			<td>AXYMCT150LC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A8301 (TGF&#946; inhibitor)</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement (503), minus vitamin A</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (503), serum-free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP7</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-03P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer size 100 &#956;m</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CLS352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SML1046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Merck</td>
			<td>11088858001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Costar Ultra-Low</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CLS3473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Organoid Harvesting Solution</td>
			<td>R&#38;D SYSTEMS</td>
			<td>3700-100-01</td>
			<td>Organoid harvesting solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Reduced Growth Factor BME, Type 2 PathClear (BME)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>3533-005-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Merck</td>
			<td>D5942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C6164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNaseI</td>
			<td>Merck</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/Ham&#39;s F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12634028</td>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Earle&#8217;s balanced salt solution (EBSS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24010043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, 1 M</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DM6 B Fluorescence Motorized Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement (1003)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A0737-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FGF10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FGF19</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human HGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-39</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-10C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rho kinase inhibitor Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spodin1-conditioned medium</td>
			<td>(Broutier et al.)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Secretion of cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical specimen of tumor removed from HCC patients</td>
			<td>Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF&#945;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12604013</td>
			<td>Trypsin substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt-3a-conditioned medium</td>
			<td>(Broutier et al.)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Secretion of cell lines</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development and optimization of a human hepatocellular carcinoma patient-derived organoid model for potential target identification and drug discovery

קרצינומה הפטוצלולרית (HCC) היא גידול נפוץ וקטלני ביותר ברחבי העולם וגילויו המאוחר והיעדר חומרים טיפוליים ספציפיים יעילים מחייבים מחקר נוסף על הפתוגנזה והטיפול בו. אורגנואידים, מודל חדשני הדומה מאוד לרקמת גידול מקומית וניתן לתרבית במבחנה, זכה להתעניינות רבה בשנים האחרונות, עם דיווחים רבים על פיתוח מודלים אורגנואידים לסרטן הכבד. במחקר זה, ביצענו אופטימיזציה מוצלחת של ההליך וביססנו פרוטוקול תרבית המאפשר היווצרות אורגנואידים HCC גדולים יותר עם תנאי מעבר ותרבית יציבים. תיארנו באופן מקיף כל שלב בהליך, המכסה את כל התהליך של דיסוציאציה של רקמות HCC, ציפוי אורגנואידים, תרבית, מעבר, שימור בהקפאה והחייאה, וסיפקנו אמצעי זהירות מפורטים במאמר זה. אורגנואידים אלה מפגינים דמיון גנטי לרקמות HCC המקוריות וניתן להשתמש בהם ליישומים מגוונים, כולל זיהוי מטרות טיפוליות פוטנציאליות לגידולים ופיתוח תרופות לאחר מכן.

Hepatocellular carcinoma (HCC), a prevalent and extensively diverse tumor1, has garnered considerable attention within the medical community. The presence of lineage plasticity and substantial heterogeneity in HCC suggests that tumor cells originating from various patients and even distinct lesions within the same patient may manifest dissimilar molecular and phenotypic traits, thereby presenting formidable obstacles in the advancement of innovative therapeutic approaches2,3,4,5. Consequently, there is an imperative need for enhanced comprehension of the biological attributes and mechanisms of drug resistance in HCC to inform the formulation of more efficacious treatment strategies.
In recent decades, researchers have dedicated their efforts to the development of in vitro models for the purpose of studying HCC3,4. Despite some advancements, limitations persist. These models encompass a range of techniques, such as the utilization of cell lines, primary cells, and patient-derived xenografts (PDX). Cell lines serve as in vitro models for long-term culture of tumor cells obtained from HCC patients, offering the benefits of convenience and facile expansion. Primary cell models involve direct isolation and culture of primary tumor cells from patient tumor tissues, thereby providing a representation of biological characteristics that closely resemble those of the patients themselves. PDX models entail the transplantation of patient tumor tissues into mice, with the aim of more faithfully simulating tumor growth and response. These models have been instrumental in HCC research, yet they possess certain limitations, including the heterogeneity of cell lines and the inability to fully replicate in vivo conditions. Furthermore, prolonged in vitro cultivation may result in the deterioration of the cells&#39; original characteristics and functionalities, posing challenges in accurately representing the biological properties of HCC. Additionally, the utilization of PDX models is both time-consuming and costly3.
To address these limitations and more accurately replicate the physiological attributes of HCC, the utilization of organoid technology has been introduced as a promising research platform capable of surpassing previous constraints. Organoids, which are three-dimensional cell models cultured in vitro, have the ability to replicate the structure and functionality of actual organs. However, in the context of HCC, there exist certain challenges in establishing organoid models. These challenges include insufficiently detailed descriptions of HCC organoid construction procedures, a lack of comprehensive protocols for the entire process of HCC organoid construction, and the typically small size of cultured organoids6,7,8. In light of the typically limited dimensions of cultured organoids, we endeavored to tackle these challenges through the development of a comprehensive protocol encompassing the entirety of HCC organoid construction6. This protocol encompasses tissue dissociation, organoid plating, culture, passaging, cryopreservation, and resuscitation. By optimizing the procedural steps and refining the composition of the culture medium, we have successfully established HCC organoid models capable of sustained growth and long-term passaging6,8. In the subsequent sections, a comprehensive account of the operational intricacies and pertinent factors involved in the construction of HCC organoids will be presented.

מחבר זרקור: חקירת פתוגנזה של סרטן הכבד באמצעות אורגנואידים שמקורם בחולה 

פיתוח ואופטימיזציה של מודל אורגנואיד הנגזר מחולה קרצינומה הפטוצלולרית אנושית לזיהוי מטרות פוטנציאליות וגילוי תרופות

Our lab aims to investigate the molecular pathogenesis of liver cancer and identify novel therapeutic targets for drug development. We would like to answer how cancer initiates, metastasis, and progress to drug tolerance utilizing novel disease models such as patient derived organoids. The current experimental challenges are in two aspects.First, there is a lack of complete set of protocols for constructing hepatocellular carcinoma organoids for the whole process. Second, the size of cultured HCC organoids is too small for subsequent experimental processing. In this protocol, we provide the details of the optimized organoids culture and subsequent transfer and freezing procedures, as well as the precautions to be taken during all the procedures.We optimized the composition of the organoid medium for organoids with close to the original tissue characteristics. We may monitor the tumor evolution using the patient-derived organoids and try to identify novel molecular and therapeutic targets for HCC treatment.

עם יישום ההליך הנ"ל, ניתן בדרך כלל להבחין בהופעתם של ספרואידים אורגנואידים HCC בטווח של 3 ימים (איור 1). איור 1A,B מראה את אורגנואיד HCC מבוסס, אשר מפתח מיד ספרואידים קומפקטיים המאופיינים בקצוות מעוגלים וציטוזול חדיר ביום הראשון להקמתו. במהלך הצמיחה של או...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating Liver Cancer Pathogenesis Using Patient-Derived Organoids at JoVE.com

אנו מספקים סקירה מקיפה וחידוד של פרוטוקולים קיימים ליצירת אורגנואידים של קרצינומה הפטוצלולרית (HCC), המקיפים את כל שלבי גידול האורגנואידים. מערכת זו משמשת מודל רב ערך לזיהוי מטרות טיפוליות פוטנציאליות ולהערכת יעילות התרופה המועמדת לתרופה.

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a highly prevalent and lethal tumor worldwide and its late discovery and lack of effective specific therapeutic agents ...

המעבדה שלנו שואפת לחקור את הפתוגנזה המולקולרית של סרטן הכבד ולזהות מטרות טיפוליות חדשות לפיתוח תרופות. ברצוננו לענות על האופן שבו סרטן יוזם, שולח גרורות ומתקדם לסבילות לתרופות תוך שימוש במודלים חדשים של מחלות כגון אורגנואידים שמקורם בחולים. אתגרי הניסוי הנוכחיים הם בשני היבטים.ראשית, חסרה מערכת שלמה של פרוטוקולים לבניית אורגנואידים של קרצינומה הפטוצלולרית לכל התהליך. שנית, גודלם של אורגנואידי HCC בתרבית קטן מדי לעיבוד ניסיוני לאחר מכן. בפרוטוקול זה, אנו מספקים את הפרטים של תרבית האורגנואידים הממוטבת ונהלי ההעברה וההקפאה הבאים, כמו גם את אמצעי הזהירות שיש לנקוט במהלך כל ההליכים.ביצענו אופטימיזציה של הרכב המדיום האורגנואידי עבור אורגנואידים עם קרוב למאפייני הרקמה המקוריים. אנו עשויים לעקוב אחר התפתחות הגידול באמצעות אורגנואידים שמקורם במטופל ולנסות לזהות מטרות מולקולריות וטיפוליות חדשות לטיפול ב- HCC.

development-optimization-human-hepatocellular-carcinoma-patient

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Development and Optimization of A Human Hepatocellular Carcinoma Patient-Derived Organoid Model for Potential Target Identification and Drug Discovery

985 Views.  Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University. המעבדה שלנו שואפת לחקור את הפתוגנזה המולקולרית של סרטן הכבד ולזהות מטרות טיפוליות חדשות לפיתוח תרופות. ברצוננו לענות על האופן שבו סרטן יוזם, שולח גרורות ומתקדם לסבילות לתרופות תוך שימוש במודלים חדשים של מחלות כגון אורגנואידים שמקורם בחולים. אתגרי הניסוי הנוכחיים הם בשני ?...

Video: מחבר זרקור: חקירת פתוגנזה של סרטן הכבד באמצעות אורגנואידים שמקורם בחולה 

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a highly prevalent and lethal tumor worldwide and its late discovery and lack of effective specific therapeutic agents necessitate further research into its pathogenesis and treatment. Organoids, a novel model that closely resembles native tumor tissue and can be cultured in vitro, have garnered significant interest in recent years, with numerous reports on the development of organoid models for liver cancer. In this study, we have successfully optimized the procedure and established a culture protocol that enables the formation of larger-sized HCC organoids with stable passaging and culture conditions. We have comprehensively outlined each step of the procedure, covering the entire process of HCC tissue dissociation, organoid plating, culture, passaging, cryopreservation, and resuscitation, and provided detailed precautions in this paper. These organoids exhibit genetic similarity to the original HCC tissues and can be utilized for diverse applications, including the identification of potential therapeutic targets for tumors and subsequent drug development.

We provide a comprehensive overview and refinement of existing protocols for hepatocellular carcinoma (HCC) organoid formation, encompassing all stages of organoid cultivation. This system serves as a valuable model for the identification of potential therapeutic targets and the assessment of drug candidate effectiveness.

Hepatocellular Carcinoma Tissue Dissociation for Organoid Culture

To begin the tissue dissociation, collect one to two cubic centimeters of hepatocellular carcinoma or HTC tissue from untreated patients. Then place the tissue in the tissue preservation solution and maintain it at four degrees Celsius until processing. Now, preheat the ultra-low attachment surface cell culture plates for one hour in an incubator set at 37 degrees Celsius.Thaw the basement membrane extract overnight at four degrees Celsius. Using surgical scissors, cut the tumor tissue into small pieces on a Petri dish inside a laminar flow hood. Transfer these pieces into a 15-milliliter conical tube and add five to 10 milliliters of basal medium.With a barotropic pipette, wash away as much blood as possible. Allow the mixture to settle for one to two minutes before removing some of the supernatant, including any blood cells and floating fat clots. Next, centrifuge the mixture at 300 G for five minutes at room temperature.Then carefully extract the supernatant and add five milliliters of pre-warmed digestion solution to the trimmed tissue. Place the tube at 37 degrees Celsius in a rotor for optimum digestion. After 30 minutes of initial digestion, use a microscope to look for small cell clusters.To stop the digestion, add five milliliters of cold basal medium to the tube. Then use a 100-micrometer cell filter to sieve into a new 50-milliliter tube. Fill up the tube with cold basal medium to reach a total volume of 50 milliliters.Next, centrifuge the cells at two G for 10 minutes at eight degrees Celsius. Once complete, carefully remove the supernatant liquid. Re-suspend the pellet in 50 milliliters of cold basal medium to obtain the cell pellet for organoid plating.

קרצינומה הפטוצלולרית דיסוציאציה של רקמת לתרבית אורגנואידים

Hepatocellular Carcinoma Organoid Culture and Digestion to Study Liver Cancer Pathogenesis

To perform organoid plating, first, remove the supernatant from the centrifuge and washed hepatocellular carcinoma cells. Re-suspend the cells in the 50 microliters of basement membrane extract, or BME, per well, for plating. Next, suspend the cells in advanced DMEM/F12.Then gently pipette the cell aggregates until an even suspension is seen. Add BME to the suspension, ensuring that the BME concentration is between 30 and 50%Now seed 50 microliters of BME droplets with cell clusters in the center of a 24 well plate. Allow the droplets to solidify at 37 degrees Celsius for 20 minutes.Add 500 microliters of prewarmed medium to each well and incubate in a cell incubator at 37 degrees Celsius. Refresh the culture medium every two to three days. After two weeks, replace the isolation medium with the organoid expansion medium.After seven to 10 days of culturing, once the organoids have reached the appropriate density, process the cultures as needed. To passage the organoids, first preheat ultra low attachment surface cell culture plates in an incubator. Next, thaw the frozen BME overnight at four degrees Celsius until right before usage.Prewarm the organoid harvest solution and trypsin substitute at 37 degrees Celsius for 30 minutes. Following the preparation stage, remove the culture medium from the organoid culture plate. Then transfer the organoid suspension into a 15 milliliter tube.Now add organoid harvesting solution in proportion to the amount of BME. To mix the suspension, use a 1000 microliter pipette gun to scrape and pipette up and down. After incubating the tube at room temperature for 30 minutes, use a one milliliter pipette to carefully aspirate the BME.Ensure that the BME is fully dissolved. Monitor the extract every 10 minutes until a clear organoid cell cluster is visible. Then centrifuge at room temperature at 400 g for five minutes.Remove as much of the supernatant as feasible. To start enzymatic digestion of the hepatocellular carcinoma organoids, add one to five milliliters of the prewarmed trypsin substitute to the cultured organoid pellet. Incubate the suspension at 37 degrees Celsius for two minutes.Use a microscope to verify if organoids dissociate into small clusters of two to 10 cells. To stop the digestion, add an appropriate volume of cold basal medium. Then centrifuge the organoids at 400 g for five minutes at eight degrees Celsius.Carefully remove as much supernatant as possible. Re-suspend the desired number of organoids in the proper matrix for plating. Every 10 days passage the organoids, depending on the density of organoid growth.HCC organoids spheroids were observed within three days of culture. Compact spheroids with rounded edges and permeable cytosol were seen on the initial day of establishment. Organoids were similarly sized and had the largest diameter when cultured in 30 to 50%BME.The BME was most fragmented at 10%resulting in the smallest organoids. The BME was most intact at 100%but resulted in organoids with intermediate diameter. The proliferating HCC organoid attained a size exceeding 500 micrometers in each culture after three generations.Substantially sized HCC organoids of higher than 1000 micrometers were obtained within a 20 day culture period.