Per iniziare, selezionare una piastra a 24 pozzetti contenente inserti con filtri da 0,4 micron. Utilizzando una pipetta, aggiungere 500 microlitri di HBSS sotto e sopra gli inserti del filtro. Quindi chiudere la piastra a più pozzetti e metterla in un'incubatrice per due ore.
Dopo l'incubazione, aspirare con cautela l'HBSS dalla piastra. Preparare una soluzione di collagene priva di cellule in una provetta sterile da 50 millilitri in DMEM su ghiaccio. Aggiungere 250 microlitri di collagene sopra il filtro a membrana e posizionare il coperchio sul piatto.
Lasciare polimerizzare la soluzione a temperatura ambiente. Successivamente, rimuovere la coltura cellulare di fibroblasti L-929 dall'incubatrice. Aggiungere due millilitri di una soluzione di tripsina EDTA preriscaldata al matraccio e metterlo in un'incubatrice per tre-cinque minuti.
Trasferire la sospensione cellulare in una provetta sterile da 15 millilitri e centrifugare a 645 G per cinque minuti. Utilizzando una pompa a vuoto, aspirare il surnatante e risospendere il pellet in un millilitro di DMEM. Aggiungere 20 microlitri di sospensione cellulare in una provetta contenente 20 microlitri di soluzione Trypan Blue.
E usa una camera di conteggio delle cellule per valutare la densità cellulare. Successivamente, rimuovere la coltura cellulare monocitaria U-937 dall'incubatore. Centrifugare la sospensione cellulare e risospendere il pellet in un millilitro di RPMI.
Dopo essersi assicurati che le cellule siano sospese in modo omogeneo, contarle utilizzando una camera di conteggio delle cellule. Successivamente, preparare sospensioni cellulari contenenti rispettivamente 50.000 cellule L-929 e 15.000 cellule U-937 in 50 microlitri di DMEM. Aggiungere ogni sospensione cellulare da 50 microlitri a 450 microlitri di collagene e mescolare accuratamente.
Sovrapporre la lamina propria priva di cellule precodificata con 500 microlitri di soluzione cellulare di collagene. Chiudere la piastra e metterla in un'incubatrice per due ore per consentire alla soluzione di solidificarsi. Successivamente, rimuovere la coltura cellulare Caco-2 dall'incubatrice.
Utilizzando una pompa a vuoto, aspirare il mezzo e risciacquare le celle con 10 millilitri di PBS. Aggiungere cinque millilitri di soluzione PBS tripsina EDTA e metterla in un'incubatrice per cinque-otto minuti. Quindi centrifugare la sospensione cellulare e risospendere il pellet in un millilitro di DMEM.
Dopo il conteggio, preparare una sospensione cellulare contenente 150.000 cellule Caco-2 in 50 microlitri di DMEM. Posizionare la piastra in una cappa a flusso laminare per 10 minuti prima di trasferirla nell'incubatrice. Dopo 30 minuti, aggiungere 500 microlitri di DMEM sopra il modello ricostruito e 500 microlitri sotto il filtro e rimettere la piastra nell'incubatrice.
Il giorno successivo, sostituire con cura il terreno con 500 microlitri di DMEM fresco rispettivamente sopra e sotto il filtro.
