Si ringrazia la Fondazione Umberto Veronesi per una borsa di studio a sostegno del lavoro di ricerca.

1. Preparazione del modello di base della mucosa intestinale ricostruita in 3D
NOTA: L'intera procedura deve essere eseguita in una cappa sterile a flusso laminare. Tutte le fasi della procedura che prevedono l'uso dell'incubatore cellulare implicano l'incubazione delle colture a 37 °C in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di CO2 (salvo diversa indicazione nel protocollo).
<ol><li>Preparazione preliminare delle linee cellulari utilizzate nel sistema modello intestinale<ol><li>Seminare cellule di fibroblasti di topo L929 a una concentrazione di 5 x 105 in 5 mL di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) contenente 2 mM di L-glutammina, 10% di siero fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina-streptomicina (Pen-Strep) in un matraccio F25 e coltivarlo in un'incubatrice 4 giorni prima della costruzione dei modelli intestinali. Dopo 48 ore, rimuovere il terreno utilizzando una pipetta. Quindi aggiungere terreno fresco (5 ml) e incubare ulteriormente le cellule per 48 ore. NOTA: Le celle devono essere confluenti all'80% prima di essere utilizzate.</li>
		<li>Seminare le cellule di Caco-2 (concentrazione di 2 x 106) in 10 mL di terreno DMEM (con il 10% di FBS e l'1% di Pen-Strep) in un matraccio di cellule F75 e coltivarlo in un incubatore 4 giorni prima della costruzione del modello di mucosa intestinale. Dopo 48 ore, cambiare il terreno come descritto al punto 1.1.1 e incubare ulteriormente per 48 ore fino a una confluenza dell'80%. NOTA: Le cellule devono essere in fase di proliferazione attiva: né troppo rade né troppo confluenti. Si consiglia una confluenza del 50-60%. Le cellule non devono essere seminate il giorno prima di realizzare il modello perché questo potrebbe rallentare la capacità proliferativa delle cellule, che poi non attecchirebbero perfettamente nel modello 3D ricostruito.</li>
		<li>Aggiungere le cellule U937 che crescono in sospensione (concentrazione di 1 x 106) a 10 mL di terreno del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (contenente 2 mM di L-glutammina, 1% piruvato di sodio, 10% FBS e 1% Pen-Strep) in un matraccio F75 2 giorni prima della messa a punto del modello e porre in un incubatore per 48 ore.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione degli inserti per piastre di co-coltura Transwell<ol><li>Selezionare una piastra a 24 pozzetti contenente inserti con filtri da 0,4 μm. NOTA: Il filtro da 0,4 μm è una scelta standard negli studi sul trasporto di farmaci. Le dimensioni del filtro da 3 μm e 8 μm non sono raccomandate per prevenire possibili perdite delle cellule incorporate nel collagene.</li>
		<li>Utilizzando una pipetta, idratare i filtri Transwell (d'ora in poi denominati inserti a membrana) con 500 μL di soluzione salina bilanciata (HBSS) di Hanks sotto e sopra l'inserto del filtro.</li>
		<li>Chiudere la piastra a più pozzetti e metterla in un'incubatrice per almeno 2 ore. NOTA: Gli inserti a membrana possono rimanere nell'HBSS per un massimo di 24 ore. Questa operazione può essere eseguita il giorno prima della costruzione del modello. È importante che gli inserti della membrana siano completamente idratati e che il filtro non si asciughi, in quanto ciò potrebbe rendere più difficile la corretta adesione del campione.</li>
		<li>Rimuovere le piastre dall'incubatrice dopo 2 h (o 24 h). Aspirare con cautela l'HBSS da sopra e sotto gli inserti della membrana utilizzando una pipetta e lasciarlo asciugare per 10 minuti.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione della lamina propria di collagene priva di cellule del sistema modello intestinale 3D di base (GIORNO 1)<ol><li>Preparare una soluzione di collagene privo di cellule in una provetta sterile da 50 mL su ghiaccio contenente i seguenti componenti in DMEM: 10% di siero fetale bovino (FBS), 200 mM di L-glutammina, 1% bicarbonato di sodio e 1,35 mg/mL di collagene di coda di ratto di tipo 1. NOTA: Tutti questi componenti devono essere mantenuti in ghiaccio e aggiunti al DMEM con puntali per pipette raffreddati. Il collagene della coda di ratto di tipo 1 deve essere aggiunto per ultimo poiché polimerizza con l'aumentare della temperatura e del pH. La quantità di soluzione di collagene libero da cellule preparata dipenderà dal numero di equivalenti intestinali richiesti.</li>
		<li>Aggiungere 250 μL di soluzione a ciascun inserto per piastre (sopra il filtro a membrana) per il numero di equivalenti intestinali selezionati e posizionare il coperchio sulla piastra a più pozzetti. Lasciare polimerizzare la soluzione di collagene a temperatura ambiente (RT) sotto la cappa a flusso laminare. NOTA: A parte il passaggio ad una fase più solida, la polimerizzazione è evidente anche da un cambiamento di colore dal giallo al rosa. La polimerizzazione è solitamente completa entro 10-15 minuti.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione, conteggio cellulare e aggiunta di cellule di fibroblasti (L929) e monociti (U937) al sistema modello (GIORNO 1)<ol><li>Rimuovere la coltura cellulare L929 (fase 1.1.1) dall'incubatore. Utilizzando una pompa a vuoto, aspirare il terreno, sostituirlo con 5 mL di soluzione salina tampone fosfato sterile (PBS; senza Ca e Mg) e risciacquare le cellule.</li>
		<li>Aspirare il PBS utilizzando una pompa a vuoto. Aggiungere 2 mL di una soluzione di tripsina-EDTA pre-preparata (0,05% di tripsina e 0,02% di EDTA in PBS) e porre in un'incubatrice per 3-5 minuti.</li>
		<li>Utilizzare un microscopio invertito (ad esempio, un Eclipse Ts2, Nikon) per stabilire se le cellule si stanno staccando dalla superficie di adesione. In tal caso, aggiungere immediatamente 2 ml di DMEM (contenente il 10% di FBS) per bloccare la reazione della tripsina e sciacquare le cellule.</li>
		<li>Trasferire la soluzione cellulare in una provetta sterile da 15 mL e centrifugare a 645 x g per 5 min. Utilizzando una pompa a vuoto, aspirare il surnatante. NOTA: È necessario fare attenzione a non disturbare il pellet. L'effetto del DMEM è stato testato sulle cellule L929 e U937 e non ha dimostrato di avere effetti avversi sulla crescita.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di DMEM al pellet e sospendere le cellule. NOTA: Le cellule devono essere sospese in modo omogeneo nella soluzione.</li>
		<li>Rimuovere 20 μL di cellule in DMEM e aggiungere 20 μL di soluzione blu di Trypan. Rimuovere 20 μL della miscela e valutare la densità cellulare al microscopio utilizzando una camera di conteggio delle cellule.</li>
		<li>Rimuovere la coltura cellulare U937 (fase 1.1.3) dall'incubatore. Centrifugare la soluzione cellulare a 645 x g per 5 min. Utilizzando una pompa a vuoto, aspirare il surnatante per evitare di disturbare il pellet.</li>
		<li>Sospendi le cellule in 1 mL di RPMI. Come per le celle L929, assicurarsi che le cellule siano sospese in modo omogeneo nella soluzione.</li>
		<li>Allo stesso modo, stabilire la densità cellulare come riportato al punto 1.4.6.</li>
		<li>Preparare una soluzione di collagene come descritto al punto 1.3.1. NOTA: La quantità di soluzione da preparare deve tenere in considerazione 450 μL per ogni inserto (o modello).</li>
		<li>Preparare una soluzione di DMEM contenente un conteggio di 50.000 cellule L929 e 15.000 cellule U937, rispettivamente, in un volume di 50 μL per ciascun modello intestinale equivalente da costruire. NOTA: il numero di celle è un fattore critico. Troppi di entrambi i tipi di cellule si tradurrebbero in una lamina propria eccessivamente piena di cellule che non sarebbero adeguatamente organizzate. Un numero inferiore di fibroblasti (che generano collagene) si tradurrebbe in una lamina propria meno compatta, mentre un numero troppo basso di monociti ostacolerebbe la risposta immunitaria agli stimoli. A condizione che sia presente il corretto conteggio delle cellule all'interno di ogni aliquota da 50 μL, è possibile preparare un volume totale di 600 μL per i 12 inserti filtranti presenti in ciascuna piastra a 24 pozzetti.</li>
		<li>Aggiungere ciascuna aliquota da 50 μL contenente le cellule a 450 μL di soluzione di collagene al punto 1.4.10. Mescolare accuratamente.</li>
		<li>Sovrapporre la lamina propria di collagene priva di cellule prerivestita con 500 μL di soluzione cellulare contenente collagene per ciascun modello. NOTA: È importante aggiungere rapidamente i volumi a ciascun inserto e, pertanto, è consigliabile limitare il numero di modelli di mucosa intestinale ricostruiti a 12 o meno alla volta.</li>
		<li>Chiudere la piastra e metterla in un'incubatrice per 2 ore per consentire alla soluzione di solidificarsi.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione, conteggio cellulare e aggiunta di cellule epiteliali Caco-2 al modello intestinale (GIORNO 1)<ol><li>Rimuovere la coltura cellulare Caco-2 (passaggio 1.1.2) dall'incubatore. Ripetere le procedure dal punto 1.4.1 utilizzando 10 mL di PBS per il risciacquo preliminare. Quindi aggiungere 5 mL di una soluzione di tripsina-EDTA pre-preparata (0,05% di tripsina e 0,02% di EDTA in PBS privo di Ca e Mg) e porre in un'incubatrice per 5-8 minuti.</li>
		<li>Ripetere i passaggi da 1.4.3 (ma utilizzando 5 mL di DMEM per bloccare la reazione alla tripsina) fino a 1.4.6 per contare le cellule utilizzando la camera di conteggio delle cellule.</li>
		<li>Preparare una soluzione di DMEM per contenere un conteggio di 150.000 cellule Caco-2 in 50 μL. NOTA: Il numero di celle utilizzate è un punto critico. Superare le 150.000 cellule potrebbe portare ad uno strato epiteliale compatto e disorganizzato, mentre con troppo poco (meno di 100.000), le cellule faticano a crescere e non coprono adeguatamente la membrana basale creando uno strato epiteliale intestinale discontinuo. Assicurati che le celle siano effettivamente sospese. La punta di una pipetta da 200 μL può essere utilizzata per garantire una distribuzione omogenea. Dato che è possibile costruire 12 modelli in qualsiasi momento, è possibile preparare una soluzione di celle da 600 μL.</li>
		<li>Dopo le 2 ore richieste nel passaggio 1.4.14, aggiungere 50 μL di cellule Caco-2 sospese in DMEM al centro di ciascuna membrana basale. Chiudere il coperchio della piastra a più pozzetti.</li>
		<li>Incubare sotto la cappa sterile a flusso laminare per 10 min. Quindi trasferire nell'incubatrice per 30 min.</li>
		<li>Preparare una soluzione DMEM contenente il 10% di FBS e l'1% di Pen/Strep. NOTA: Preparare una soluzione sufficiente per utilizzare un volume di 1 mL per modello.</li>
		<li>Aggiungere 500 μL di mezzo sopra il modello ricostruito e 500 μL sotto il filtro. NOTA: È necessario prestare attenzione quando si aggiunge il mezzo sopra il filtro per evitare di staccare o stressare le celle.</li>
		<li>Chiudere il sistema di piastre a più pozzetti e posizionarlo nell'incubatrice.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione/formazione e utilizzo del modello (dal GIORNO 2 al GIORNO 6)<ol><li>GIORNO 2: Rimuovere con cautela la soluzione sia sopra il modello ricostruito che sotto il filtro utilizzando una pipetta. Sostituire con 500 μL di DMEM fresco (10% FBS e 1% Pen/Strep) rispettivamente sopra e sotto il filtro.</li>
		<li>GIORNO 3: Ripetere come sopra nel passaggio 1.6.1.</li>
		<li>GIORNO 4: Ripetere come sopra nel passaggio 1.6.1. NOTA: Questo modello intestinale è un modello cellulare statico; Pertanto, per favorire il rilascio di molecole e la crescita e la stimolazione delle cellule, è molto importante che il mezzo venga cambiato ogni giorno.</li>
		<li>GIORNO 5: A questo punto, il modello è completamente formato/sviluppato. Utilizzare questi modelli per ulteriori studi. NOTA: Il momento migliore per utilizzare il modello è a 5 giorni. Sebbene le cellule possano essere mantenute in un'incubatrice per periodi più lunghi, più tempo passa, maggiore è la probabilità che le cellule epiteliali possano crescere in modo incontrollato, risultando in uno strato disorganizzato e compatto difficile da utilizzare.</li>
		<li>A 5 giorni, incubare i modelli con componenti tossici (glutine o lipopolisaccaride [LPS]) o benefici (polifenoli) di interesse. Aggiungerli alla parte superiore del modello ricostruito sospeso nel supporto DMEM. NOTA: La concentrazione appropriata di ciascun componente di interesse deve essere calcolata e sospesa in un mezzo DMEM. I controlli non trattati contenenti solo terreno DMEM devono essere impostati per il confronto con i modelli sperimentali.</li>
		<li>Incubare i modelli di controllo e sperimentali per 24 ore in un incubatore.</li>
		<li>GIORNO 6: Rimuovere il terreno sopra e sotto il filtro con una pipetta. NOTA: Il terreno può essere conservato per successivi test di tipo ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) per misurare il rilascio di citochine infiammatorie. A tale scopo, il terreno deve essere aggiunto a fiale sterili e conservato a -20 ° C per ulteriori analisi.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Inclusione in paraffina dei modelli di mucosa intestinale ricostruita
NOTA: L'intera procedura deve essere eseguita sotto una cappa chimica. Ogni passaggio e la rispettiva assegnazione del tempo devono essere rigorosamente rispettati. Per questo motivo, è importante che tutti i reagenti siano preparati in anticipo.
<ol><li>Impostare la macchina per paraffina a 58 °C in modo che sia pronta per l'uso.</li>
	<li>Trasferire gli inserti della membrana nei pozzetti puliti utilizzando una pinza in una piastra sterile da 24 pozzetti.</li>
	<li>Aggiungere 500 μL di formalina tamponata al 37% in PBS sopra il filtro e 1 mL sotto il filtro. Chiudere il coperchio e lasciarlo sotto la cappa chimica per 2 ore a RT. NOTA: In alternativa, la formalina tamponata al 4% può essere utilizzata a RT per 1 ora.</li>
	<li>Rimuovere la formalina e aggiungere la soluzione HBSS sia sopra che sotto il filtro. Quindi rimuovere l'HBSS.</li>
	<li>Staccare la lamina propria dall'inserto della membrana. NOTA: Le cellule della mucosa intestinale di solito si staccano molto facilmente dall'inserto di membrana in quanto non sono attaccate a quest'ultimo. Inoltre, i due compartimenti del campione (apicale e basale) rimangono attaccati, mantenendo la struttura 3D. Se, per qualche motivo, non vengono facilmente staccati, sarà importante utilizzare una lama per bisturi sterile monouso per rimuovere la mucosa intestinale dall'inserto della membrana. L'inserto a membrana può essere tagliato, staccandolo così dalla plastica. Fare attenzione a non toccare mai il campione con il bisturi. Il motivo per rimuovere l'inserto di membrana dalle cellule incorporate nel collagene è che questo filtro può staccarsi nelle successive fasi di fissazione o di inclusione della paraffina, rendendo sproporzionati i confronti tra i modelli di mucosa intestinale. Inoltre, gli inserti a membrana all'interno della sezione incorporata hanno una consistenza diversa che può interferire con il sezionamento.</li>
	<li>Posizionare i becher da 100 ml sotto la cappa di aspirazione chimica, ciascuno correttamente etichettato per includere un sistema modello di mucosa intestinale ricostruito in esame. Aggiungere 25 ml di ETOH al 35% in ciascun becher e quindi aggiungere la mucosa intestinale ricostruita. Incubare per 10 min.</li>
	<li>Sostituire l'etanolo al 35% con 25 ml di etanolo al 50% e incubare per 10 min.</li>
	<li>Sostituire l'etanolo al 50% con 25 ml di etanolo al 70% e incubare per 10 minuti.</li>
	<li>Sostituire l'etanolo al 70% con 25 ml di etanolo all'80% e incubare per 10 minuti.</li>
	<li>Sostituire l'etanolo all'80% con 25 ml di etanolo al 95% e incubare per 10 minuti.</li>
	<li>Sostituire l'etanolo al 95% con 25 ml di etanolo al 100% e incubare per 10 minuti.</li>
	<li>Sostituire l'etanolo al 100% con un altro cambio di etanolo al 100% da 25 ml e incubare per 10 minuti.</li>
	<li>Posizionare becher da 100 ml sotto la cappa aspirante, ciascuno correttamente etichettato per includere un modello in esame. Aggiungere 50 ml di xilene o un agente di pulizia istologica per 10-20 minuti. NOTA: Si consiglia l'uso di Histo-Clear (agente di pulizia istologica) in quanto migliora la chiarezza e la vivacità delle colorazioni acidofile. Il tempo di pulizia può variare da un campione di mucosa intestinale ricostruito all'altro e deve essere controllato per la trasparenza dell'aspetto ogni 2-3 minuti.</li>
	<li>Non appena i campioni sono trasparenti, metterli in un portacassette di tessuto metallico che viene poi immerso in paraffina liquida all'interno della macchina riscaldata per 45 minuti.</li>
	<li>Cambiare la paraffina e lasciare i campioni all'interno della macchina riscaldata per altri 45 minuti.</li>
	<li>Rimuovere il supporto per cassetta di carta e metterlo su ghiaccio a raffreddare. Quando i blocchi di campioni raffreddati si staccano dal supporto metallico, questi possono essere ulteriormente raffreddati a temperatura ambiente.</li>
	<li>Conservare i blocchi su RT. NOTA: Se l'obiettivo è quello di preparare immediatamente le sezioni, i blocchi possono essere posizionati a 4 ° C in modo che siano ben raffreddati durante l'uso.</li>
	<li>Tagliare sezioni di 4 μm utilizzando un microtomo.</li>
	<li>Adagiare le sezioni tagliate su vetrini e asciugarle in forno a 37°C per 24 h.</li>
	<li>Le guide sono pronte per l'uso. Conservarli a RT fino a quando non si esegue la colorazione istologica H&E o la colorazione della reazione immuno-istochimica (tipo antigene-anticorpo).<ol><li>Per la colorazione immuno-istochimica, selezionare gli anticorpi di interesse (sia per lo studio delle proteine TJ come l'occludina che per l'attivazione, la migrazione e la differenziazione dei monociti) e rilevare l'espressione (tramite colorazione) utilizzando kit commerciali.</li>
		<li>Allo stesso modo, misurare il muco utilizzando il kit di colorazione Alcian blue e periodic acid-Schiff (PAS).</li>
		<li>Quantificare le proteine TJ colorate di interesse, come l'occlusina, calcolando la percentuale di pixel positivi su micrografie prese dal microscopio.</li>
		<li>Analizzare le immagini delle cellule utilizzando un software di analisi delle immagini (ad esempio, il software ImageJ2 [Wayne Rasband, versione 2.9.0/1.53t]).<ol><li>Per eseguire l'analisi dei pixel, elaborare le immagini digitali a 300 pixel/pollice e convertirle in 8 bit. Quindi, elabora le immagini binarie tramite il plug-in Color Deconvolution per analizzare la colorazione della proteina di interesse, in questo caso, la colorazione rossa permanente dell'occlusina.</li>
			<li>Salvare l'immagine selezionata come file tiff e sottoporla a una procedura di "pulizia" per eliminare gli artefatti con un editor grafico (ad esempio, Adobe PhotoshopCC [versione 20.0.4]).</li>
			<li>Successivamente, misurare tutti i campi di interesse con l'applicazione Analyze Particle of ImageJ2 e riportare i dati come numero di pixel. NOTA: Ogni esperimento deve essere eseguito in triplice copia con tre campi di replica interni analizzati per ogni replica. Per quantificare il muco, lo stesso principio di misurazione dei pixel può essere applicato alle immagini scattate rispettivamente delle mucine neutre colorate di viola-magenta e del muco acido colorato di blu brillante.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

Costruzione di un modello 3D della mucosa intestinale con inclusione di paraffina

<ol>
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Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.

Il sistema modello di mucosa intestinale ricostruito di base qui presentato (Figura 6) combina la complessità fisiologica (colture cellulari 3D più rilevanti dal punto di vista fisiologico contenenti un monostrato di Caco-2 con un supporto della lamina propria ricco di ECM contenente fibroblasti e monociti) con la semplicità sperimentale (utilizzando linee cellulari umane commerciali per produrre un sistema standardizzato e facilmente ripetibile)13. In quanto tale,...

La barriera epiteliale intestinale, un rivestimento interno spesso una cellula contenente diversi tipi di cellule epiteliali, costituisce la prima barriera fisica difensiva o interfaccia tra l'ambiente esterno e quello interno del corpo 1,2. Gli enterociti di tipo colonnare costituiscono il tipo più abbondante di cellule epiteliali. Questi sono responsabili del mantenimento dell'integrità della barriera epiteliale attraverso le interazioni tra diversi componenti della barriera, comprese le giunzioni strette (TJ), svolgendo un ruolo significativo nel rafforzamento della barriera 1,3. La struttura TJ è costituita da proteine della placca intracellulare, come zonula occludens (ZO) e cingulin, che cooperano con proteine transmembrana, tra cui occlusine, claudine e molecole di adesione giunzionale (JAM) che formano una struttura a cerniera che collega strettamente le cellule vicine 3,4. Le proteine transmembrana regolano la diffusione paracellulare passiva di piccoli composti ed escludono le grandi molecole tossiche.
I composti alimentari potenzialmente tossici e i contaminanti alimentari stimolano la produzione di citochine infiammatorie che interrompono la permeabilità epiteliale, attivando le cellule immunitarie e causando infiammazione cronica dei tessuti intestinali 5,6,7. Al contrario, è stato riportato che varie sostanze fitochimiche antiossidanti e antinfiammatorie riducono l'espressione delle citochine infiammatorie e migliorano l'integrità della barriera TJ intestinale attraverso il ripristino dell'espressione e dell'assemblaggio della proteina TJ 4,6,8. Pertanto, la regolazione dell'integrità della barriera epiteliale da parte di composti sia benefici che dannosi ha visto un aumento dell'uso di modelli sia in vivo che in vitro volti a mimare la barriera intestinale per lo screening farmaceutico e gli studi di tossicità. Ciò è particolarmente rilevante dato il crescente interesse per la comprensione della fisiopatologia delle malattie intestinali intestinali (IBD), dell'enterocolite necrotizzante e del cancro, che possono essere simulate nei modelli sperimentali 8,9,10.
C'è stata una richiesta per lo sviluppo di modelli in vitro basati su cellule al fine di raggiungere l'obiettivo delle "3R" nella sperimentazione animale. Questi includono alternative sostitutive all'uso di animali, riduzione del numero di animali utilizzati e perfezionamento nell'adozione di metodi che alleviano il disagio 11,12,13. Inoltre, i meccanismi molecolari, cellulari e fisiologici sottostanti tra modelli umani e murini (i roditori sono le specie più utilizzate) sono distintivi, portando a controversie sull'efficacia dei modelli murini come predittori nelle risposte umane12,13. Numerosi vantaggi dei modelli in vitro di linee cellulari umane includono la sperimentazione con target ristretto, l'osservazione diretta e l'analisi continua13.
I monostrati di tipo a cellula singola in colture bidimensionali (2D) sono serviti come potenti modelli. Tuttavia, questi non possono riprodurre con precisione la complessità fisiologica dei tessuti umani 8,13,14. Di conseguenza, i sistemi di coltura 3D vengono sviluppati con miglioramenti sempre crescenti per ricapitolare la complessità fisiologica dei tessuti intestinali sani e malati come strumenti di valutazione del rischio di nuova generazione13,14. Questi modelli includono scaffold 3D Transwell con diverse linee cellulari, colture di organoidi e dispositivi microfluidici (intestino su chip) che utilizzano sia linee cellulari che organoidi (derivati da tessuti sani e malati)8,13,14.
Il protocollo intestinale equivalente 3D di "tessuto sano" presentato nel presente studio si basava sul raggiungimento di un equilibrio tra complessità fisiologica e semplicità sperimentale13. Il modello è rappresentativo di uno scaffold 3D Transwell, composto da tre linee cellulari (enterociti [la linea di adenocarcinoma del colon Caco-2] con una componente immunitaria di supporto [monociti U937 e fibroblasti L929]), costituenti un sistema standardizzato e facilmente ripetibile applicabile per lo screening preliminare di molecole dietetiche di interesse per l'integrità della barriera epiteliale intestinale e la risposta immunitaria. Il protocollo include l'inclusione della paraffina per la valutazione al microscopio dell'integrità della barriera epiteliale utilizzando equivalenti intestinali fissi. Il vantaggio dell'approccio attuale è che numerose sezioni dei tessuti incorporati possono essere colorate per più parametri da un singolo esperimento.

basic three-dimensional (3d) intestinal model system with an immune component

Si è registrato un aumento dell'utilizzo di modelli intestinali in vivo e in vitro per lo studio della fisiopatologia delle malattie infiammatorie intestinali, per lo screening farmacologico di sostanze potenzialmente benefiche e per studi di tossicità su componenti alimentari potenzialmente dannosi. Di rilievo è l'attuale domanda di sviluppo di modelli in vitro basati su cellule per sostituire i modelli animali. Qui, viene presentato un protocollo per un modello di base equivalente intestinale tridimensionale (3D) di "tessuto sano" utilizzando linee cellulari con il duplice vantaggio di fornire sia semplicità sperimentale (sistema standardizzato e facilmente ripetibile) che complessità fisiologica (enterociti Caco-2 con una componente immunitaria di supporto dei monociti U937 e dei fibroblasti L929). Il protocollo include anche l'inclusione della paraffina per la valutazione al microscopio ottico degli equivalenti intestinali fissi, fornendo così il vantaggio di analizzare più parametri visivi da un singolo esperimento. Le sezioni colorate con ematossilina ed eosina (H&E) che mostrano le cellule colonnari Caco-2 che formano un monostrato stretto e regolare nei trattamenti di controllo sono utilizzate per verificare l'efficacia del modello come sistema sperimentale. Utilizzando il glutine come componente alimentare pro-infiammatorio, i parametri analizzati dalle sezioni includono la riduzione dello spessore del monostrato, nonché l'interruzione e il distacco dalla matrice sottostante (H & E), la diminuzione dell'espressione proteica della giunzione stretta come mostrato dalla colorazione dell'occludina (quantificabile statisticamente) e l'attivazione immunitaria delle cellule U937 in migrazione come evidenziato dalla colorazione del cluster di differenziazione 14 (CD14) e dalla differenziazione correlata a CD11b in macrofagi. Come dimostrato dall'uso del lipopolisaccaride per simulare l'infiammazione intestinale, ulteriori parametri che possono essere misurati sono l'aumento della colorazione del muco e l'espressione di citochine (come midkine) che possono essere estratte dal terreno prima della fissazione. Il modello tridimensionale di base (3D) della mucosa intestinale e le sezioni fisse possono essere consigliati per studi sullo stato infiammatorio e sull'integrità della barriera con la possibilità di analizzare molteplici parametri visivi quantificabili.

The intestinal epithelial barrier, a one-cell-thick internal lining containing different types of epithelial cells, constitutes the first physical defensive barrier or interface between the outside and the internal milieu of the body1,2. Columnar-type enterocytes constitute the most abundant type of epithelial cells. These are&#160;responsible for maintaining epithelial barrier integrity through interactions between several barrier components, including tight junctions (TJs), playing a significant role in barrier tightening1,3. The TJ structure consists of intracellular plaque proteins, such as zonula occludens (ZO) and cingulin, cooperating with transmembrane proteins, including occludins, claudins, and junctional adhesion molecules (JAMs) that form zipper-like structure tightly linking the neighboring cells3,4. The transmembrane proteins regulate the passive paracellular diffusion of small compounds and exclude toxic large molecules.
Potentially toxic food compounds and food contaminants stimulate inflammatory cytokine production that disrupts the epithelial permeability, activating immune cells and causing chronic intestinal tissue inflammation5,6,7. In contrast, various anti-oxidant and anti-inflammatory phytochemicals have been reported to reduce inflammatory cytokine expression and enhance intestinal TJ barrier integrity through the restoration of TJ protein expression and assembly4,6,8. Hence, the regulation of epithelial barrier integrity by both beneficial and harmful compounds has seen an increase in the use of both in vivo and in vitro models aimed at mimicking the intestinal barrier for pharmaceutical screening and toxicity studies. This is particularly relevant given the increasing interest in understanding the pathophysiology of intestinal bowel diseases (IBD), necrotizing enterocolitis, and cancer, which can be simulated in experimental models8,9,10.
There has been a demand for the development of cell-based in vitro models in order to achieve the objective of the &#8220;3Rs&#8221; in animal testing. These include replacement alternatives to the use of animals, reduction in the number of animals used, and refinement in adopting methods that alleviate distress11,12,13. Moreover, the underlying molecular, cellular, and physiological mechanisms between human and murine models (rodents being the most widely used species) are distinctive, leading to controversy regarding the efficacy of the murine models as predictors in human responses12,13. Numerous advantages of in vitro human cell-line models include target-restricted experimentation, direct observation, and continuous analysis13.
Single-cell-type monolayers in two-dimensional (2D) cultures have served as powerful models. However, these cannot precisely reproduce the physiological complexity of human tissues8,13,14. As a result, 3D&#160;culture systems are being developed with ever-increasing improvements to recapitulate the physiological complexity of both healthy and diseased intestinal tissues as next-generation risk assessment toolboxes13,14. These models include 3D Transwell scaffolds with diverse cell lines, organoid cultures, and microfluidic devices (intestine-on-chip) using both cell lines and organoids (derived from both healthy and diseased tissues)8,13,14.&#160;
The 3D &#8220;healthy tissue&#8221; intestinal equivalent protocol presented in the present study was based on striking a balance between physiological complexity and experimental simplicity13. The model is representative of a 3D Transwell scaffold, comprised of three cell lines (enterocytes [the gold-standard colon adenocarcinoma Caco-2 line] with a supporting immune component [U937 monocytes and L929 fibroblasts]), constituting a standardized and easily repeatable system applicable for the preliminary screening of dietary molecules of interest on intestinal epithelial barrier integrity and immune response. The protocol includes paraffin embedding for light microscopic evaluation of epithelial barrier integrity using fixed intestinal equivalents. The advantage of the present approach is that numerous sections of the embedded tissues can be made to stain for multiple parameters from a single experiment.

Autore in primo piano: Indagine sugli effetti dei composti sul tessuto intestinale utilizzando modelli 3D di linee cellulari umane 

Sistema modello intestinale tridimensionale (3D) di base con una componente immunitaria

The scope of the work is to use these in vitro three-dimensional human cell line models to investigate the fact of beneficial as well as helpful compounds on intestinal tissue. The models can be used to further research understanding and also as a basic drug model. Using the plant-derived compounds, spermidine and eugenol, both separately and together in supplement form, we measure beneficial increases in autophagy and decreases in inflammation using these models.Then we will also able to show the potentially harmful effect of gluten extracted from certain wheat varieties on intestinal tissues. We are currently using economically priced, standardized, and easily repeatable in vitro system that better reflect the physiology of the human intestine as an alternative to animal models. Since we also use commercial human cell line rather than plant-derived cells, the responses from the study are more applicable to the general population.The protocol is based entirely on the use of different lines. These renders the model most standardized and reproducible. Furthermore, the simultaneous cultivation of different cell lines, enterocytes, fibroblasts, and immune system cells, allows for cellular responses that are closer to what happens in the patient.

Il primo aspetto importante è quello di determinare l'accettabilità della mucosa intestinale equivalente 3D di base a scopo sperimentale. Questo viene eseguito con il colorante più utilizzato nei laboratori di istologia e istopatologia, ovvero l'ematossilina (colora il materiale nucleare di colore blu-viola intenso) e l'eosina (colora il materiale citoplasmatico di varie tonalità di rosa). La colorazione H&E viene prima eseguita su un controllo non trattato, che viene coltivato nelle stesse condizioni e negli stessi ...

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Qui descriviamo la costruzione di un sistema modello di linea cellulare intestinale tridimensionale (3D) di base e un protocollo di inclusione della paraffina per la valutazione microscopica ottica di equivalenti intestinali fissi. La colorazione di proteine selezionate consente l'analisi di più parametri visivi da un singolo esperimento per un potenziale utilizzo in studi preclinici di screening farmacologico.

There has been an increase in the use of in vivo and in vitro intestinal models to study the pathophysiology of inflammatory intestinal diseases, for the ...

Lo scopo del lavoro è quello di utilizzare questi modelli tridimensionali in vitro di linee cellulari umane per studiare il fatto di composti benefici e utili sul tessuto intestinale. I modelli possono essere utilizzati per approfondire la comprensione della ricerca e anche come modello farmacologico di base. Utilizzando i composti di origine vegetale, spermidina ed eugenolo, sia separatamente che insieme sotto forma di integratore, misuriamo gli aumenti benefici dell'autofagia e la diminuzione dell'infiammazione utilizzando questi modelli.Successivamente saremo anche in grado di dimostrare l'effetto potenzialmente dannoso del glutine estratto da alcune varietà di grano sui tessuti intestinali. Attualmente stiamo utilizzando sistemi in vitro a prezzi economici, standardizzati e facilmente ripetibili che riflettono meglio la fisiologia dell'intestino umano come alternativa ai modelli animali. Poiché utilizziamo anche linee cellulari umane commerciali piuttosto che cellule di origine vegetale, le risposte dello studio sono più applicabili alla popolazione generale.Il protocollo si basa interamente sull'utilizzo di diverse linee. In questo modo il modello è più standardizzato e riproducibile. Inoltre, la coltivazione simultanea di diverse linee cellulari, enterociti, fibroblasti e cellule del sistema immunitario, consente risposte cellulari più vicine a ciò che accade nel paziente.

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Research

JoVE Journal

Biology

Basic Three-Dimensional (3D) Intestinal Model System with an Immune Component

715 Views.  Alma Mater Studiorum-University of Bologna. Lo scopo del lavoro è quello di utilizzare questi modelli tridimensionali in vitro di linee cellulari umane per studiare il fatto di composti benefici e utili sul tessuto intestinale. I modelli possono essere utilizzati per approfondire la comprensione della ricerca e anche come modello farmacologico di base. Utilizzando i composti di origine vegetale, spermidina ed eugenolo, sia separatamente che insieme sotto forma di integratore, misuriamo gli aumenti benefici dell'autofagia e la diminuzi...

Video: Autore in primo piano: Indagine sugli effetti dei composti sul tessuto intestinale utilizzando modelli 3D di linee cellulari umane 

There has been an increase in the use of in vivo and in vitro intestinal models to study the pathophysiology of inflammatory intestinal diseases, for the pharmacological screening of potentially beneficial substances, and for toxicity studies on potentially harmful food components. Of relevance, there is a current demand for the development of cell-based in vitro models to substitute animal models. Here, a protocol for a basic, &#8220;healthy tissue&#8221; three-dimensional (3D) intestinal equivalent model using cell lines is presented with the dual benefit of providing both experimental simplicity (standardized and easily repeatable system) and physiological complexity (Caco-2 enterocytes with a supporting immune component of U937 monocytes and L929 fibroblasts). The protocol also includes paraffin embedding for light microscopic evaluation of fixed intestinal equivalents, thereby providing the advantage of analyzing multiple visual parameters from a single experiment. Hematoxylin and eosin (H&#38;E) stained sections showing the Caco-2 columnar cells forming a tight and regular monolayer in control treatments are used to verify the efficacy of the model as an experimental system. Using gluten as a pro-inflammatory food component, parameters analyzed from sections include reduced monolayer thickness, as well as disruption and detachment from the underlying matrix (H&#38;E), decreased tight junction protein expression as shown from occludin staining (quantifiable statistically), and immune-activation of migrating U937 cells as evidenced from the cluster of differentiation 14 (CD14) staining and CD11b-related differentiation into macrophages. As shown by using lipopolysaccharide to simulate intestinal inflammation, additional parameters that can be measured are increased mucus staining and cytokine expression (such as midkine) that can be extracted from the medium prior to fixation. The basic three-dimensional (3D) intestinal mucosa model and fixed sections can be recommended for inflammatory status and barrier integrity studies with the possibility of analyzing multiple visual quantifiable parameters.

Here we describe constructing a basic three-dimensional (3D) intestinal cell line model system and a paraffin embedding protocol for light microscopic evaluation of fixed intestinal equivalents. Staining of selected proteins permits the analysis of multiple visual parameters from a single experiment for potential use in preclinical drug screening studies.

Ricerca

Biologia

Preparation of a Basic 3D Reconstructed Intestinal Mucosa Model for Microscopic Evaluation of Fixed Intestinal Equivalents

To begin, select a 24-well plate containing inserts with 0.4 micron filters. Using a pipette, add 500 microliters of HBSS below and above the filter inserts. Then close the multi-well plate and place it in an incubator for two hours.After incubation, carefully aspirate the HBSS from the plate. Prepare a cell-free collagen solution in a sterile 50 milliliter tube in DMEM on ice. Add 250 microliters of collagen above the membrane filter and place the lid on the plate.Allow the solution to polymerize at room temperature. Next, remove the L-929 fibroblast cell culture from the incubator. Add two milliliters of a pre-warmed trypsin EDTA solution to the flask and place it in an incubator for three to five minutes.Transfer the cell suspension to a sterile 15 milliliter tube and centrifuge at 645 G for five minutes. Using a vacuum pump, aspirate the supernatant and resuspend the pellet in one milliliter of DMEM. Add 20 microliters of cell suspension into a tube containing 20 microliters of Trypan Blue solution.And use a cell counting chamber to evaluate the cell density. Next, remove the U-937 monocyte cell culture from the incubator. Centrifuge the cell suspension and resuspend the pellet in one milliliter of RPMI.After ensuring cells are homogeneously suspended, count them using a cell counting chamber. Next, prepare cell suspensions containing 50, 000 L-929 and 15, 000 U-937 cells respectively in 50 microliters of DMEM. Add each 50 microliter cell suspension to 450 microliters of collagen and mix thoroughly.Overlay the pre-coded cell-free lamina propria with 500 microliters of the collagen cell solution. Close the plate and place it in an incubator for two hours to allow the solution to set. Next, remove the Caco-2 cell culture from the incubator.Using a vacuum pump, aspirate the medium and rinse the cells with 10 milliliters of PBS. Add five milliliters of PBS trypsin EDTA solution and place it in an incubator for five to eight minutes. Then centrifuge the cell suspension and resuspend the pellet in one milliliter of DMEM.After counting, prepare a cell suspension containing 150, 000 Caco-2 cells in 50 microliters of DMEM. Place the plate in a laminar flow hood for 10 minutes before transferring it to the incubator. After 30 minutes, add 500 microliters of the DMEM above the reconstructed model and 500 microliters below the filter and return the plate to the incubator.The next day, carefully replace the medium with 500 microliters of fresh DMEM above and below the filter respectively.

Preparazione di un modello di base della mucosa intestinale ricostruita in 3D per la valutazione microscopica di equivalenti intestinali fissi

Paraffin Embedding of a Basic 3D Reconstructed Intestinal Mucosa Model for Immune-Histochemical Staining

For paraffin embedding of cells, set the paraffin machine to 58 degrees Celsius. Using pliers, transfer the membrane inserts to clean wells of a sterile 24-well plate. Add 500 microliters of 37%buffered formalin and PBS above the filter, and one milliliter below the filter.Close the lid and leave the plate in a fume hood for two hours. Once the lamina propria is detached from the membrane insert, transfer the intestinal mucosa into a beaker containing 25 milliliters of 35%ethanol, and incubate for 10 minutes. After dehydration in increasing ethanol concentrations, place the samples in 50 milliliters of xylene or a histological clearing agent for 10 to 20 minutes.Once the samples are transparent, place them in a metal tissue cassette holder and submerge them in liquid paraffin inside a heated machine. After 45 minutes, use a microtome to cut four micron sections. Place the cut section on the slides and dry them in an oven at 37 degrees Celsius for 24 hours.An acceptable 3-D intestinal equivalent mucosa model consists of Caco-2 cells formed in a tight and regular monolayer above the extracellular-matrix-rich lamina propria. Unacceptable models include those showing excessive growth, disorganized epithelial layers, malformation or lack of epithelial layer formation. The proinflammatory effect of wheat protein with a high gluten content disrupted the cellular monolayer and reduced the thickness of the epithelial layer compared to the control group.The occludin protein content was significantly higher in the control group than in the group exposed to gluten protein. CD14 and CD11b staining of U937 monocytes showed that wheat protein with a high gluten content activated the monocytes, and induced their migration and differentiation into macrophages. Under the lipopolysaccharide challenge, Caco-2 cells increased mucus production and the release of the inflammatory marker midkine.