Per l'inclusione di paraffina delle cellule, impostare la macchina per paraffina a 58 gradi Celsius. Utilizzando una pinza, trasferire gli inserti della membrana nei pozzetti puliti di una piastra sterile a 24 pozzetti. Aggiungere 500 microlitri di formalina tamponata al 37% e PBS sopra il filtro e un millilitro sotto il filtro.
Chiudere il coperchio e lasciare la piastra in una cappa aspirante per due ore. Una volta staccata la lamina propria dall'inserto membrana, trasferire la mucosa intestinale in un becher contenente 25 millilitri di etanolo al 35% e incubare per 10 minuti. Dopo la disidratazione in concentrazioni crescenti di etanolo, porre i campioni in 50 millilitri di xilene o in un agente di pulizia istologica per 10-20 minuti.
Una volta che i campioni sono trasparenti, metterli in un supporto per cassette di tessuto metallico e immergerli in paraffina liquida all'interno di una macchina riscaldata. Dopo 45 minuti, utilizzare un microtomo per tagliare sezioni di quattro micron. Posizionare la sezione tagliata sui vetrini e asciugarli in forno a 37 gradi Celsius per 24 ore.
Un modello accettabile di mucosa intestinale equivalente in 3D è costituito da cellule Caco-2 formate in un monostrato stretto e regolare sopra la lamina propria ricca di matrice extracellulare. I modelli inaccettabili includono quelli che mostrano una crescita eccessiva, strati epiteliali disorganizzati, malformazioni o mancanza di formazione di strati epiteliali. L'effetto proinfiammatorio delle proteine del grano con un alto contenuto di glutine ha interrotto il monostrato cellulare e ridotto lo spessore dello strato epiteliale rispetto al gruppo di controllo.
Il contenuto proteico di occludina era significativamente più alto nel gruppo di controllo rispetto al gruppo esposto alla proteina del glutine. La colorazione CD14 e CD11b dei monociti U937 ha mostrato che le proteine del grano con un alto contenuto di glutine attivano i monociti e inducono la loro migrazione e differenziazione in macrofagi. Nell'ambito della sfida lipopolisaccaridica, le cellule Caco-2 hanno aumentato la produzione di muco e il rilascio del marcatore infiammatorio midkine.
