Per iniziare, avviare il software del sistema di analisi delle cellule vive. Premere il simbolo più nell'angolo in alto a sinistra dello schermo per avviare l'aggiunta del recipiente. Scegliere Scansione pianificata, quindi selezionare Nuovo per eseguire il programma di scansione.
Selezionare Standard. Quindi impostare le impostazioni di scansione come opzioni cella per cella su Nessuno e i canali immagine su Fase, Verde e Rosso, con i rispettivi tempi di acquisizione. Imposta l'obiettivo su 20x.
Dall'elenco, scegliere la piastra e selezionare la posizione del recipiente per posizionare la piastra sul vassoio del sistema di imaging. Selezionare i pozzetti contenenti i campioni e decidere il numero di immagini da acquisire per pozzetto. Queste informazioni generano automaticamente una durata stimata della scansione per la lastra.
Fare clic su Crea mappa piastra per immettere le informazioni per ciascun pozzetto, ad esempio il tipo di cella e il composto. Quindi assegna un nome allo studio. Nella schermata successiva, selezionare Basic Analyzer come tipo di analisi e scegliere Analysis Definition dall'elenco a discesa, che mostra le definizioni di analisi utilizzate in precedenza.
Lasciare il demixing spettrale sia per il verde che per il rosso a 0.0. Pianificare la scansione in modo che venga eseguita ogni 15-20 minuti per otto ore. Trascinare la barra bianca e grigia nella parte superiore dello schermo per impostare l'ora di inizio della scansione.
Nella schermata successiva, rivedere le impostazioni di scansione e premere Aggiungi alla pianificazione per avviare la scansione. Dopo la scansione, nella scheda Vista, aprire il recipiente per l'analisi. Premere Avvia analisi a sinistra dello schermo e selezionare Crea nuova definizione di analisi.
Scegliete Analizzatore di base (Basic Analyzer) e utilizzate i canali immagine Fase, Verde, Rosso e Sovrapposizione (Overlap). Selezionare da sei a otto immagini di esempio rappresentative per l'addestramento. Per configurare la definizione dell'analisi, impostare gli oggetti verdi sui neutrofili che formano trappole extracellulari per neutrofili o NET e gli oggetti rossi sui nuclei di tutti i neutrofili.
Premere Anteprima corrente o Anteprima tutto e regolare ciascun parametro per ottimizzare i risultati. Scegliere i tempi di scansione e i pozzetti per l'analisi. Specificare quindi un'etichetta per la definizione dell'analisi.
Rivedi il riepilogo e avvia l'analisi. Dopo l'analisi, fare doppio clic sul nome della definizione di analisi per aprire lo studio analizzato. Apri Livelli a sinistra dello schermo e controlla se ogni cella è contrassegnata correttamente.
Fai clic su "Metriche grafico" a sinistra dello schermo, quindi seleziona il conteggio per immagine per il conteggio verde. Scegliere i punti temporali e i pozzetti da esportare. Per selezionare il raggruppamento, selezionare Repliche mappa piastra per verificare che tutti i pozzetti siano specificati correttamente durante la scansione e fare clic su Esporta dati.
Allo stesso modo, esporta i dati per il conteggio del rosso e il conteggio delle sovrapposizioni. Usando l'equazione data, calcola la percentuale di NET che formano celle per ogni condizione e punto temporale. L'andamento temporale della formazione di NET viene visualizzato tracciando la percentuale di neutrofili che formano NET in ogni punto temporale.
L'aggiunta di un inibitore AKT ha bloccato la formazione di NET nei neutrofili stimolati con PMA o ionoforo di calcio. La dimostrazione delle potenziali molecole che mirano alla formazione di NET può essere testata in modo ad alto rendimento utilizzando questa metodologia.
