Per iniziare, semina le cellule HEK293T in una fabbrica di cellule a 10 strati contenente terreni DMEM ad alto contenuto di glucosio con il 10% di FBS. Metti le cellule in un incubatore a 37 gradi Celsius sotto l'integrazione di anidride carbonica al 5% durante la notte. Successivamente, aliquotare 350 millilitri di Opti-MEM in un flacone sterile da 500 millilitri.
Aggiungere il DNA plasmatico per la trasfezione nel flacone e agitare per mescolare bene. Ora aggiungi 15 millilitri di soluzione di PEI nel flacone. Agitare energicamente il composto per 30 secondi per garantire una miscelazione uniforme.
Dopo aver incubato la miscela a temperatura ambiente per 15 minuti, trasferirla in una bottiglia da un litro. Quindi aggiungere 700 millilitri di DMEM a basso contenuto di glucosio. Rimuovere la Cell Factory a 10 strati dall'incubatore e aspirare il terreno in un contenitore per rifiuti.
Pipettare con cura la miscela di DNA trasfettato nella Cell Factory. Quindi rimetti la Cell Factory nell'incubatore per 72-96 ore. Dopo tre o quattro giorni, filtrare il surnatante chiarificato attraverso un'unità filtrante da 0,45 micrometri.
Aggiungere 500 millilitri di DPBS nella Cell Factory per risciacquarla. Centrifugare a 4.000 g per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Con un sistema a vuoto e una pipetta di aspirazione, rimuovere ed eliminare il surnatante.
Aggiungere 20 millilitri di tampone di lisi AAV al pellet e mescolare per risospendere il pellet nel tampone. Conservare a meno 80 gradi Celsius fino alla purificazione. Ora aggiungi la soluzione di cloruro di sodio PEG al 40% alla soluzione AAV, portando la concentrazione finale fino all'8% di PEG.
Posizionare la miscela su un rotatore orbitale a bassa velocità per una notte a quattro gradi Celsius. Centrifugazione della soluzione a 4.000 g per 30 minuti a quattro gradi Celsius per far precipitare il virus. Pipettare il surnatante.
Quindi ho avuto da cinque a 10 millilitri di AAV HEPES Resuspension Buffer sul pellet. Trasferire la sospensione in un tubo conico da 50 millilitri per continuare la purificazione a valle. Quindi, fissare un ago punted calibro 16 montato su una siringa da 10 millilitri e sovrapporre i gradienti di iodixanolo preparati in una provetta per ultracentrifuga in polipropilene con sommità rotonda.
Con un ago calibro 22, aggiungere con attenzione fino a 17 millilitri di soluzione AAV sopra il gradiente. Rabboccare il tubo con il tampone per dialisi AAV. Sigillare i tubi con una sigillatrice elettrica.
Centrifugare le provette a 350.000 g per due ore in un rotore di titanio a quattro gradi Celsius. Quindi trasferirli in un rack per provette per ultracentrifuga. Ora usa un nuovo ago calibro 18 per trasferire il virus AAV in una cassetta di dialisi.
Rimuovere l'aria dalla cassetta dopo aver iniettato il virus al suo interno. Posizionare una barra di agitazione nel becher contenente il tampone per dialisi AAV e trasferirla su una piastra di agitazione. Quindi posizionare la cassetta per dialisi nel tampone con una boa galleggiante.
Utilizzare una siringa da 10 millilitri per trasferire il virus dalla cassetta a un'unità di filtro centrifuga. Centrifugare a 4.000 g per 15-30 minuti a quattro gradi Celsius. Raccogliere l'AAV concentrato dall'unità filtrante.
Quindi sciacquare il filtro con 300 microlitri di tampone per dialisi AAV. Infine, trasferire la soluzione di risciacquo nell'AAV concentrato. È stato riscontrato che il virus AVV isolato ha una purezza superiore al 90%, il che lo rende adatto all'uso in vivo.