Per iniziare, immergere una fiala di HUVEC crioconservati in un bagno d'acqua a 37 gradi per due minuti. Quindi sciacquare la fiala con etanolo al 70% per evitare contaminazioni. Pipettare cinque millilitri di ECGM preriscaldato in una provetta conica da 15 millilitri.
Con una micropipetta, trasferire con cura le cellule scongelate dalla fiala alla provetta conica. Quindi aggiungere un millilitro di terreno fresco preriscaldato al crioviale per sciacquare l'interno e trasferire le cellule rimanenti nel tubo conico. Dopo aver scartato il surnatante, risospendere le cellule in 10 millilitri di terreno fresco.
Quindi trasferire le cellule in un pallone T75. Incubare il pallone in un incubatore ad anidride carbonica umidificato a 37 gradi Celsius. Sciacquare le cellule HUVEC confluenti al 90% in un matraccio T75 con 10 millilitri di DPBS.
Quindi aggiungere un millilitro di 0,25% TE al pallone. Dopo l'incubazione, picchiettare delicatamente i lati del pallone e aggiungere cinque millilitri di soluzione neutralizzante della tripsina. Quindi trasferire le cellule in una provetta conica da 15 millilitri.
Raccogliere le cellule rimanenti con cinque millilitri di ECGM fresco e trasferirle nel tubo conico. Centrifugare ora la provetta conica a 250 x g per tre minuti per raccogliere il pellet della cella. Dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet cellulare in un millilitro di ECGM fresco e contare le cellule.
Dopo aver centrifugato nuovamente, scartare il surnatante e risospendere le cellule in 90 microlitri di ECGM fresco. Quindi, aspirare brevemente a vuoto i canali dei recipienti stampati su una lastra per liberare il lume. Con una micropipetta, caricare delicatamente il canale con 15 microlitri di sospensione cellulare HUVIC.
Posizionare la piastra in piano all'interno di un'incubatrice per due ore. Successivamente, capovolgere la piastra a 180 gradi, mantenendola in posizione piana per le successive due ore. Dopo quattro ore, lavare il canale con DPBS per rimuovere le cellule non aderenti e morte.
Quindi pipettare due millilitri di ECGM fresco in ciascun pozzetto. Posiziona la coltura dinamica su un bilanciere con un angolo di inclinazione di 10 gradi e cinque giri/min. Le cellule HUVEC si sono rapidamente attaccate e proliferate per coprire la superficie luminale dei canali vascolari del VOP.
La maturazione dell'endotelio è stata verificata mediante immunocolorazione per CD31 5 giorni dopo la semina cellulare, che ha dimostrato la localizzazione di CD31 nelle giunzioni strette.
