Per iniziare, seminare 20 milioni di cellule di midollo osseo di topo neonato per fiaschetta T75 in 10 millilitri di DMEM completo contenente 2,5 millilitri di surnatante cellulare al 10% L929. Incubare il pallone di coltura a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per cinque giorni. Il terzo giorno di differenziazione, aggiungere due millilitri di terreno condizionato L929 nel pallone.
Sotto un microscopio invertito con ingrandimento 20x, osservare quotidianamente le cellule. Per raccogliere i macrofagi il quinto giorno, aspirare il mezzo di differenziazione dal pallone. Lavare le cellule con cinque millilitri di PBS per rimuovere le cellule non aderenti e le proteine del siero.
Aggiungere cinque millilitri di tripsina EDTA allo 0,05% al pallone e incubare a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Dopo cinque minuti, aggiungere cinque millilitri di DMEM e pipettare per staccare le cellule. Centrifugare la sospensione cellulare a 350 g per cinque minuti.
Dissociare il palato cellulare in un millilitro di DMEM completo. Contare le celle su un contatore di celle automatizzato. In presenza di surnatante cellulare L929, le cellule del midollo osseo sono state differenziate in macrofagi entro cinque giorni.
La formazione di cellule a forma di fuso è stata osservata a partire dal secondo giorno, con quasi la metà che mostrava questa morfologia entro il terzo giorno e la maggior parte entro il quinto giorno.
