Per iniziare, prendi un'aliquota da 75 microlitri contenente un milligrammo di perle magnetiche rivestite di streptavidina legate al DNA e rimuovi il surnatante con la rastrelliera magnetica. Lavare le perline con 200 microlitri di tampone di caricamento. Quindi risospendere le perle in 75 microlitri di tampone di carico e mescolare delicatamente pipettando.
Successivamente, aggiungere il complesso di riconoscimento dell'origine a una concentrazione finale di 37,5 nanomolari al DNA legato alla perlina e incubare la reazione per cinque minuti a 30 gradi Celsius con un'agitazione di 800 giri al minuto. Aggiungere CDC6 a una concentrazione finale di 50 nanomolari e incubare la reazione come dimostrato in precedenza. Quindi aggiungere Mcm2-7 Cdt1 a una concentrazione finale di 100 nanomolari e incubare la reazione per 20 minuti come dimostrato in precedenza.
Successivamente, aggiungere DDK a una concentrazione finale di 100 nanomolari e incubare in modo simile per 30 minuti. Dopo aver rimosso il surnatante, lavare gli esameri Mcm-2-7 fosforilati legati alle perle con 200 microlitri di tampone ad alto contenuto di sale. Miscelare mediante pipettaggio, assicurandosi che le perle siano completamente risospese.
Quindi, rimuovere il tampone e lavare le perle una volta con 200 microlitri di tampone CMG. Per assemblare e attivare il CMG marcato in fluorescenza sul DNA legato alle microsfere, rimuovere il tampone CMG e risospendere le perle legate al DNA in 50 microlitri di tampone CMG integrato con cinque millimolari di ADP. Quindi, mescola tutti i componenti menzionati sullo schermo in un tubo e mettilo sul ghiaccio.
Aggiungere immediatamente il DNA legato alla perlina risospesa alla miscela proteica. Incubare la reazione per 15 minuti a 30 gradi Celsius con agitazione a 800 giri/min. Lavare il cordone in sequenza con il tampone HSW e il tampone CMG.
Dopo aver rimosso il tampone, risospendere il CMG contenente microsfere magnetiche legate al DNA in 200 microlitri di tampone di eluizione, quindi incubare a temperatura ambiente per un'ora con agitazione a 800 giri/min. Posizionare la provetta in una rastrelliera magnetica e lasciare che le perle vengano raccolte per cinque minuti. Raccogliere con cura il surnatante contenente i complessi DNA-CMG eluiti senza interrompere le perle depositate e trasferirlo in una nuova provetta.
Per assicurarsi che non rimangano perle nella soluzione, riposizionare il surnatante raccolto in una rastrelliera magnetica e conservare con cura per altri cinque minuti. Raccogliere il surnatante e trasferirlo in un nuovo tubo. Aggiungere 1.400 microlitri di tampone CMG ai 200 microlitri di surnatante.
Il campione è ora pronto per l'imaging di una singola molecola.
