Esegui l'imaging di singole molecole in una configurazione commerciale, combinando pinzette ottiche a doppio raggio con microscopia confocale. Utilizzare il canale di iniezione uno per l'intrappolamento delle perline, il canale due per il legame del complesso proteico del DNA, il canale tre per controllare la presenza di CMG e i canali quattro e cinque come serbatoi proteici e posizioni di scambio del tampone. Far fluire tutte le soluzioni nella cella di flusso a una pressione costante di 0,5 bar nella porta di iniezione.
Quindi disattivare il flusso nei canali quattro e cinque. Dopo aver fatto scorrere inizialmente tutte le soluzioni, ridurre la pressione a 0,2 bar. Spostare i laser di intrappolamento sul canale uno fino a quando una perlina non viene catturata in ciascuna trappola ottica.
Sposta le perline intrappolate sul canale due muovendo il joystick mentre premi il grilletto. Usando il joystick senza premere il grilletto, si pesca un complesso DNA CMG spostando la perlina destra verso e lontano dalla perlina sinistra fino a quando non viene intrappolato un cavo di DNA. Spostare le perline sul canale tre e interrompere immediatamente il flusso in tutti i canali.
Regolare la potenza del laser a 561 nanometri a quattro microwatt nel pannello del laser di eccitazione e quindi eseguire una scansione di prova di un fotogramma del DNA nel canale tre. Se presente, il CMG apparirà come macchie limitate dalla diffrazione bidimensionale. In questo caso, spostare il cavo del DNA sul canale quattro o cinque per l'imaging.
In caso contrario, riattivare il flusso, scartare le perline e ripetere i passaggi. Nei canali quattro o cinque inserire due piconewton nel pannello della spettroscopia di forza e fare clic sul pulsante di abilitazione per avviare un morsetto di forza. Una volta che la tensione iniziale raggiunge i due piconewton, disabilitare il morsetto di forza prima dell'imaging facendo nuovamente clic sul pulsante di abilitazione nel pannello della spettroscopia di forza.
Fare clic sul pulsante Avvia scansione nel pannello di scansione delle immagini. Immagine fluorescente CMG ogni cinque secondi con un laser a 561 nanometri a una potenza di quattro microwatt misurata all'obiettivo. In una reazione priva di aggregazione, il CMG è apparso come una diffrazione discreta e simmetrica, con macchie limitate che affollano scarsamente il DNA.
Al contrario, gli aggregati sono meno discreti, a volte blob asimmetrici che affollano una lunghezza maggiore del DNA. Se il test è stato eseguito con successo e si è raggiunta un'elevata purezza delle proteine purificate, si potrebbe osservare un movimento a lungo raggio del CMG in presenza di ATP.
