Procedere all'esecuzione della reazione dopo aver funzionalizzato entrambe le estremità del substrato lineare di DNA. Per prima cosa, prendi quattro colonne di rotazione S-400 e vorticile per almeno 30 secondi per risospendere la resina. Quindi, centrifugarli per un minuto a 735 G per rimuovere il tampone di conservazione.
Trasferire le colonne per pulire le provette da 1,5 millilitri. Immediatamente, aggiungere 100 microlitri della soluzione di DNA lineare doppiamente funzionalizzata a ciascuna colonna. Centrifugare le colonne per due minuti a 735G per far fluire il DNA attraverso la colonna trattenendo i nucleotidi non incorporati.
Dopo aver raccolto il flusso contenente il DNA dalle quattro colonne, misurare il volume con una pipetta. Quindi, agitare le perle magnetiche rivestite di streptavidina M-280 per 30 secondi per risospenderle. Trasferire quattro milligrammi di perle magnetiche risospese in un tubo pulito da 1,5 millilitri.
Posizionare la provetta in una rastrelliera magnetica per un minuto per raccogliere le perle prima di rimuovere il buffer di conservazione. Risospendere le perle in un millilitro di tampone A agitando per cinque secondi prima di incubare le perle a temperatura ambiente per cinque minuti. Raccogli le perline inserendo il tubo in un supporto magnetico per un minuto.
Dopo aver rimosso il tampone A, risospendere le perle in 400 microlitri di tampone 2X A mediante pipettaggio. Quindi, aggiungere 400 microlitri della soluzione di DNA funzionalizzato alle microsfere e mescolare delicatamente pipettando. Incubare la miscela di DNA della perlina per una notte a quattro gradi Celsius con rotazione da un'estremità all'altra.
Il giorno successivo, utilizzare la rastrelliera magnetica per rimuovere il surnatante prima di calcolare la quantità totale di DNA legato alle perle magnetiche. Quindi, lavare le perle in sequenza con il tampone B e il tampone C.Risospendere le perle in 300 microlitri di tampone C e fare quattro aliquote da 75 microlitri.
