Ibridazione di cellule batteriche con una sonda oligonucleotidica marcata con un fluoroforo mediante ibridazione in situ a fluorescenza (FISH)

Per iniziare, prendi le cellule batteriche fissate nella paraformaldeide. Centrifugare le celle a 14.000 x g per 10 minuti. Quindi rimuovere il surnatante.

Risospendere il pellet in 100 microlitri di etanolo analitico al 96% e incubare per un minuto a temperatura ambiente. Ripetere la centrifugazione per cinque minuti, quindi rimuovere l'etanolo e asciugare all'aria il pellet di cellule. Ora ibridare le cellule in una soluzione contenente oligonucleotide marcato in fluorescenza per tre ore a 46-gradi Celsius.

Subito dopo l'ibridazione, centrifugare i campioni in un rotore preriscaldato a 46 gradi Celsius per 15 minuti alla temperatura massima consentita. Quindi lavare i campioni in un tampone con un adeguato rigore per 15 minuti a 48 gradi Celsius. Dopo aver centrifugato il campione, ancora una volta, lavare le cellule con 500 microlitri di PBS ghiacciato.

Risospenderli in 20 microlitri di PBS e conservarli a quattro gradi Celsius fino a nuovo utilizzo.