NIH R01 HL085369, HL067322, HL082729, EB008999

1. Preparazione <ol><li> Preparare appena Tyrodes fatto &#39;la soluzione (in mm, 128,2 NaCl, 1.3 CaCl 2, 4.7 KCl, 1,19 NaH 2 PO 4, 1,05 MgCl 2, 20,0 NaHCO 3, e 11.1 glucosio). Per velocizzare la preparazione quotidiana di soluzioni, preparare due soluzioni stock in anticipo e conservarli a +4 ° C frigorifero: (1) Azione i (in g/2L, 374,6 NaCl, CaCl 2 9,56, 17,52 KCl, 8,21 NaH 2 PO 4 , 10,67 MgCl 2) e (2) Stock II (in g/2L, 84,01 NaHCO 3). Per rendere 2L di soluzione sufficiente per un esperimento prendere Tyrodes &#39;1840mL di acqua deionizzata e mescolare in esso 80ml di Stock I, 80 ml di Stock II e 4g di glucosio. </li><li> Preparare soluzioni di coloranti e uncouplers: (1) eccitazione-contrazione blebbistatin soluzione disaccoppiatore magazzino (Tocris Bioscience, soluzione 2mg/ml in DMSO), (2) voltaggio-sensibile colorante di-4-ANEPPS soluzione madre (Invitrogen, 1mg/mL soluzione in DMSO), (3) tensione sensibile colorante RH 237 soluzione madre (Invitrogen, soluzione 1.25mg/ml in DMSO), (4) Indicatore di calcio Rhod-2:00 soluzione madre (Invitrogen, soluzione 1mg/ml in DMSO). Un esperimento unico coniglio richiede circa 30 l di la di-4-ANEPPS soluzione madre, 30 microlitri della soluzione del RH237 stock, e 200 microlitri della Rhod-2:00 soluzione madre. Per evitare congelamenti e scongelamenti ripetuti, memorizziamo aliquote di 100 ml di di-4-ANEPPS a -20 ° C. Altri coloranti sono inoltre conservati a -20 ° C. Conservare il blebbistatin sciolto in frigorifero 4 ° C. </li><li> Prima della raccolta del, cuore Tyrodes trasferimento &#39;soluzione nella bottiglia di 2L e posizionarlo in un bagno d&#39;acqua (Fisher Scientific), che mantiene la temperatura della soluzione a 37 ° C. La soluzione è ossigenato con il 95% O 2 - 5% di CO 2. Il pH è mantenuto a 7,35 ± 0,05, regolando il livello di ossigenazione. La soluzione viene fatta circolare nel sistema di perfusione Langendorff ed è filtrata da un filtro a rete di nylon (diametro dei pori: 11μm, Millipore) posto nella linea di perfusione prima della cannula. </li><li> Preparare apparecchiature di monitoraggio prima della raccolta del cuore. Un trasduttore di pressione (WPI) viene utilizzato per monitorare la pressione aortica durante l&#39;esperimento. Linea di base del trasduttore di pressione viene regolata a zero mmHg quando il cuore non è collegato al sistema di perfusione. Pseudo-elettrodi ECG sono poste nella camera al piombo approssimativa I, II e III del triangolo di Einthoven ECG. </li></ol> 2. Raccolta e Perfusione di Cuori Coniglio <ol><li> Fissare il coniglio nel dispositivo di immobilizzazione coniglio. Euthanize il coniglio da una iniezione endovenosa di sodio pentobarbital (50 mg / kg) con 2000 U di eparina. Quando il coniglio è completamente eutanasia, che è determinata dalla mancanza di riflesso il dolore, la cavità toracica è aperto rapidamente e il cuore ed i polmoni sono escisse. </li><li> Fare un taglio nella parte alta della aorta ascendente e prima di tutti i rami della aortico. Lavare l&#39;aria dal aorta ascendente e poi rapidamente cannulate il cuore ad una 16-gauge cannula, che è stato precedentemente collegato a un cacciatore di bolla che è molto importante per mantenere l&#39;aria fuori delle coronarie. Una volta che il cuore è retrogrado perfuso in un non-sistema di ricircolo perfusione Langendorff, fare un taglio per aprire il pericardio in fretta. </li><li> Rimuovere il polmone, trachea, grasso e tessuti connettivi, mentre il sangue viene lavata dal perfusione. </li><li> Molto importante! Un tubo in silicone (~ lunga tre centimetri, e 2mm di diametro) viene inserito attraverso una vena polmonare e la valvola mitrale nel ventricolo sinistro (LV) e tenuti lì per tutto l&#39;esperimento. Questo tubo rilascia la soluzione che è intrappolato nel LV. Senza circolazione per ore durante la Langedorff-perfusione esperimento di un cuore meccanico immobilizzato, è probabile che a causare ischemia grave nella cavità ventricolare sinistra e per la produzione di aritmia. </li><li> Spostare il cuore con la cannula al ricircolo Langendorff-perfusione sistema con l&#39;apparato mappatura ottica. </li></ol> 3. Conducendo esperimenti con il sistema ottico panoramica Mapping <ol><li> Mettere il cuore in una misura da camera esagonale e collegare la cannula al sistema di perfusione. Mantenere la pressione aortica a 60 ± 5 mmHg, regolando la portata della pompa di perfusione. Monitor di piombo I pseudo-ECG. Mantenere il pH a circa 7,35 ± 0,05. </li><li> Spegnere la luce della stanza, perché blebbistatin è photoinactivated entro la fine UV e bassa (450-490 nm) 17 per la parte visibile dello spettro. Iniettare lentamente la soluzione blebbistatin magazzino attraverso la porta di iniezione in aria a bolle cacciatore si trova sopra la cannula. Iniettare lentamente blebbistatin 0,1 ml per ogni bolo. Attendere che la pressione si stabilizzi prima dell&#39;iniezione successiva. </li><li> Posizionare delicatamente l&#39;elettrodo stimolazione sul percorso specifico per il progetto sperimentale. </li><li> Mettere a fuoco l&#39;immagine del cuore in vetro smerigliato situato al piano dell&#39;immagine di ogni fotodiodo array (PDA) da treequidistanti angoli che circonda il cuore. Regolare la posizione della cannula e le distanze tra ogni PDA e il cuore per adattarsi al cuore nel campo di vista di tutti e tre i PDA. Scatta una foto di ogni immagine focalizzata in vetro smerigliato. </li><li> Iniettare lentamente 10 ~ 20μL di-4-ANEPPS soluzione madre attraverso la porta di iniezione in aria-bolla trappola nella soluzione di perfusione. Attendere 1 ~ 3 minuti prima di effettuare registrazioni ottiche. </li><li> Per la registrazione prima accendere la luce LED verde (nessun filtro di eccitazione, INONDAZIONI LED, LUMILEDS), prendi registrazioni ottiche contemporaneamente da tre PDA connessi con la misura sistema di acquisizione dati, 5 e spegnere la luce a LED. Controllare la qualità dei segnali provenienti da diversi pixel di tutti e tre i palmari. Aggiungere 0,1 ~ 0,2 ml di soluzione madre blebbistatin se artefatti da movimento nel potenziale di azione ottico si notano. Aggiungere un altro 5 microlitri di-4-ANEPPS soluzione madre se segnale-rumore è basso. </li><li> Terminare il protocollo progettato sperimentale per lo studio funzionale. Re-macchia il cuore con l&#39;aggiunta di 5μL-4-ANEPPS soluzione di riserva se il segnale si deteriora durante la sperimentazione a causa di photobleaching o washout. </li><li> Accendere la luce della stanza dopo il completamento dello studio funzionale. Scatta foto del cuore da 36 angoli equidistanti. Ciò si ottiene ruotando il cuore a un passo di 10 ° con una fotocamera digitale fissa nella posizione di un PDA. </li><li> Prendete il cuore dalla camera. Scolate tutte le soluzioni. Lavare il sistema di perfusione nella sequenza di acqua deionizzata, alcol reagente al 70%, e di nuovo acqua deionizzata. </li><li> L&#39;analisi dei dati comprende la ricostruzione della geometria cuore dal 36 fotografie digitali, la registrazione del segnale ottico sulla superficie della geometria ricostruita, e la quantificazione della durata del potenziale d&#39;azione (APD), la velocità di conduzione (CV), fase, ecc 6 </li></ol> 4. Conducendo esperimenti con il sistema a doppia mappatura <ol><li> (Continua dopo parte 2) Mettere il cuore cannulata in una camera di vetro (Radnóti) e collegare la cannula al sistema di perfusione. Definire con precisione il cuore in fondo al silicio della camera ventricolare al vertice e atri. </li><li> Spegnere la luce della stanza. Iniettare lentamente la soluzione blebbistatin magazzino (15 ~ 20 minuti per raggiungere 10μM) attraverso la porta di iniezione prima cannula perfusione per immobilizzare il cuore. </li><li> Mettete un piatto di plastica Petri, o altri copertura vetrata, al di sopra della superficie epicardico per ridurre il movimento della superficie soluzione. </li><li> Messa a fuoco due telecamere CMOS nel sistema di doppia mappatura (Ultima-L, SciMedia) presso lo stesso campo di vista. Fluorescenza emessa è separata da uno specchio dicroico (635nm cutoff, Omega Optical), e filtrata da un filtro longpass 700nm (Thorlabs) per i segnali di tensione e da un filtro passa-banda 590/30 nm (Omega Optical) per i segnali di calcio. </li><li> Puntare le guide luce di due lampade alogene (Newport Oriel Instruments, Stratford, CT; SciMedia, Costa Mesa, CA) verso il campo di mappatura al fine di raggiungere anche l&#39;illuminazione. Filtri di eccitazione (nm 531/40, SemRock) sono utilizzati. </li><li> Macchia il cuore con la tensione sensibile colorante RH 237 soluzione madre (10 ~ 30 mL) attraverso la porta di iniezione. </li><li> Miscelare il Rhod-2:00 (0,2 ml) soluzione madre con Pluronic F-127 (Invitrogen, miscela 1:1). Ultrasuoni per 1 minuto in un bagnomaria ultrasuoni. Iniettare la miscela attraverso la porta del cacciatore bolla. Attendere circa 20 minuti per permettere la de-esterificazione degli Rhod-02:00 prima dell&#39;inizio della mappatura. </li><li> Per una registrazione, spegnere la pompa superfusione per evitare il movimento sulla superficie della soluzione; accendere la sorgente di luce di eccitazione (le lampade alogene), prendere registrazioni ottiche utilizzando entrambe le telecamere collegate al sistema di acquisizione dati (Ultima-L, SciMedia) ; spegnere la luce di eccitazione, e accendere la pompa superfusione. Controllare la qualità dei segnali ottici. Re-macchia il tessuto, se necessario. </li><li> Termina il resto del protocollo progettato per uno studio sperimentale. </li><li> Accendere la luce della stanza e fare una fotografia del cuore che contiene il campo visivo. Prendete il cuore dalla camera. Scolate tutte le soluzioni. Lavare il sistema di perfusione nella sequenza di acqua deionizzata, alcol reagente al 70% (Fisher Scientific) e acqua deionizzata. </li><li> L&#39;analisi dei dati contiene misure di APD, CV, la durata di calcio transitoria (carta sta), il ritardo tra la salita AP e aumento CAT, il tempo di salita del calcio transitorio, e la costante di tempo di un adattamento monoesponenziale del decadimento CAT. </li></ol> Rappresentante dei risultati: <img src="/files/ftp_upload/3160/3160fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Risultati rappresentante di una Langendorff-perfuso esperimento coniglio utilizzando il sistema di mappatura panoramica ottico. (A) La vista anteriore del cuore di coniglio e la ricostruzione della geometria cuore di coniglio in forma di un&#39;immagine tridimensionale mesh-grid superficie. (B) Tscartò superficie epicardico codice colore dalla fase (ottenuti dall&#39;analisi piano delle fasi 18) che indica il fronte d&#39;onda in rosso durante un episodio di tachiaritmia. (C) L&#39;ottica registrazioni del potenziale d&#39;azione in cinque sedi in tutto il singolarità fase segnata da 1-5 in pannello B. (D) Otto istantanee di attivazione del fronte d&#39;onda (colore rosso) propagazione durante un ciclo di un&#39;aritmia stabile rientrante. I cerchi in senso orario attorno ad un fronte d&#39;onda singolarità fase, che è visibile sulla superficie anteriore del cuore. Il colore di ripolarizzazione (blu) è impostato per essere parzialmente trasparente in modo che il fronte d&#39;onda posteriore è visibile (ad esempio, a 80ms, 100ms e 120ms). Un film di questa aritmia rientro è previsto nel video supplementare 1. I metodi per la ricostruzione della geometria, la registrazione del segnale, il calcolo di mappa di fase, e l&#39;apertura di superficie sono descritti in dettaglio altrove 6. <img src="/files/ftp_upload/3160/3160fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. I risultati rappresentativi da una Langendorff-perfuso esperimento coniglio cuore utilizzando il sistema a doppia mappatura (mappatura simultanea di potenziale d&#39;azione e calcio transitoria). (A) La superficie anteriore del cuore con il campo mappatura di vista coperta da puntini neri. (B) Una vista ravvicinata delle registrazioni da un sito. (C) le tracce del campione del potenziale d&#39;azione (blu) e di calcio transitoria (rosso) da una serie di punti equidistanti segnato dai puntini neri nella nota pannello A. che non tutte le registrazioni dei pixel vengono mostrate e la risoluzione spaziale è 200μm.

<ol>
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R., Burton, F., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+Ca2++triggers+early+afterdepolarizations+and+Torsade+de+Pointes+in+rabbit+hearts+with+type+2+long+QT+syndrome.">Cytosolic Ca2+ triggers early afterdepolarizations and Torsade de Pointes in rabbit hearts with type 2 long QT syndrome.</a> J Physiol. 543, 615-631 (2002).</li><li>Hwang, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+calcium+and+vulnerability+to+fibrillation+and+defibrillation+in+Langendorff-perfused+rabbit+ventricles.">Intracellular calcium and vulnerability to fibrillation and defibrillation in Langendorff-perfused rabbit ventricles.</a> Circulation. 114, 2595-2603 (2006).</li><li>Lou, Q., Efimov, I. 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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Sulla base della nostra esperienza, le chiavi per il successo Langendorff-perfuso esperimento coniglio cardiaca comprendono soluzione ben preparati Tyrodes &#39;, raccolta veloce del cuore, ben curato pressione di perfusione, e il pH della soluzione appropriata ossigenato nel sistema di perfusione. Al fine di registrare il segnale con il più alto possibile segnale-rumore, dobbiamo prendere in considerazione fattori come fonte di luce, filtri ottici, concentrandosi ottica, fotorivelatori, ecc 19. I dettagli di questi aspetti sono discussi altrove 19. Conigli giovani (età: 4-5 mesi, peso: 7-9 libbre) potrebbero essere utilizzati per evitare il grasso epicardico, che diminuisce il rapporto segnale-rumore dei segnali ottici. Il segnale registrato da ogni pixel è un&#39;integrazione ponderata della luce emessa da un volume di tessuto. La profondità di questo volume dei tessuti dipende dalla lunghezza d&#39;onda di eccitazione ed emissione del colorante utilizzato. Per di-4-ANEPPS, ad esempio, la profondità di penetrazione stimato è 300μm nel cuore di coniglio 20. Così, l&#39;interpretazione del segnale ottico dovrebbe essere fatto con cautela quando l&#39;eterogeneità locali di funzioni elettriche sono presenti nel nodo seno-atriale, nodo atrio-ventricolare, e durante aritmia ventricolare 1,21,22. Una limitazione della tecnica di mappatura ottica rispetto alla registrazione elettrodo è che la fase di ripolarizzazione del potenziale d&#39;azione ottico è spesso distorta da artefatti da movimento causato dalla contrazione cardiaca. Vincolo meccanico potrebbe essere utilizzato per ridurre l&#39;artefatto, ma non lo elimina completamente. In confronto, farmacologico eccitazione-contrazione uncouplers sono efficaci nel rimuovere il manufatto movimento. Tuttavia, questi uncouplers (ad esempio 2,3-Butanedione monoxime) potrebbe avere gravi effetti collaterali elettrofisiologico. Blebbistatin è stato dimostrato non avere effetti collaterali negativi sulla elettrofisiologia cardiaca nel cuore normale 23, ed è quindi un disaccoppiatore promettente per la mappatura ottica. Va notato che l&#39;accelerazione di edema dovuto alla abolizione della contrazione potrebbe anche incidere sulla elettrofisiologia.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, New Jersey </td><td> S271-1 </td></tr><tr><td> CaCl 2 (2H 2 O) </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, New Jersey </td><td> C79-500 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, New Jersey </td><td> S217-500 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (6H 2 O) </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, New Jersey </td><td> M33-500 </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 (H 2 O) </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, New Jersey </td><td> S369-500 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, New Jersey </td><td> S233-3 </td></tr><tr><td> D-glucosio </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, New Jersey </td><td> D16-1 </td></tr><tr><td> Blebbistatin </td><td> Bioscience Tocris, Ellisville, MO </td><td> 1760 </td></tr><tr><td> Di-4-ANEPPS </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> D1199 </td></tr><tr><td> RH237 </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> S1109 </td></tr><tr><td> Rhod, 02:00 </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> R1244 </td></tr><tr><td> Pluronic F127 </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> P3000MP </td></tr><tr><td> Dimetilsolfossido (DMSO) </td><td> Sigma, St. Louis, MO </td><td> D2650 </td></tr></tbody></table>

multiparametric optical mapping of the langendorff-perfused rabbit heart

L&#39;imaging ottico e sonde fluorescenti hanno metodologia di ricerca avanzate in modo significativo nel campo della elettrofisiologia cardiaca in modi che non avrebbe potuto essere realizzato da altri approcci 1. Con l&#39;uso dei coloranti calcio e voltaggio-sensibile, la mappatura ottica permette la misurazione dei potenziali d&#39;azione transmembrana e transienti di calcio ad alta risoluzione spaziale, senza il contatto fisico con il tessuto. Questo rende le misurazioni dell&#39;attività elettrica cardiaca possibile in molte condizioni in cui l&#39;utilizzo di elettrodi è scomodo o impossibile 1. Per esempio, le registrazioni ottiche fornire accurate cambiamenti morfologici del potenziale di membrana durante e immediatamente dopo la stimolazione e defibrillazione, mentre le tecniche di elettrodi convenzionali soffrono di stimolo-indotta artefatti durante e dopo gli stimoli a causa di polarizzazione degli elettrodi 1. Il Langendorff-perfuso cuore di coniglio è uno dei modelli più studiati della fisiologia e fisiopatologia cuore umano. Molti tipi di aritmie clinicamente osservato potrebbe essere riassunta nel modello cuore di coniglio. E &#39;stato dimostrato che i modelli di onda nel cuore di coniglio durante aritmie ventricolari, determinata dalla dimensione effettiva del cuore e la lunghezza d&#39;onda di rientro, sono molto simili a quella del 2 cuore umano. E &#39;stato anche dimostrato che gli aspetti critici di eccitazione-contrazione (CE) accoppiamento in coniglio miocardio, come ad esempio il contributo relativo del reticolo sarcoplasmatico (SR), è molto simile a uomo accoppiamento CE 3. Qui vi presentiamo le procedure di base di esperimenti di mappatura ottica in Langendorff-perfuso cuori di coniglio, tra cui la configurazione del sistema perfusione Langendorff, l&#39;ottica di mappatura dei sistemi, l&#39;isolamento e la cannulazione della perfusione cardiaca, colorazione e tintura del cuore, eccitazione-contrazione disaccoppiamento, e la raccolta di segnali ottici. Questi metodi possono essere applicate anche al cuore da specie diverse da coniglio con adattamenti portate, ottica, soluzioni, ecc Due sistemi di mappatura ottica sono descritti. Il sistema di mappatura panoramica è utilizzato per mappare l&#39;intera epicardio del cuore di coniglio 4-7. Questo sistema fornisce una visione globale dell&#39;evoluzione dei circuiti rientranti durante arrhythmogenesis e la defibrillazione, ed è stato utilizzato per studiare i meccanismi di aritmie e antiaritmici terapia 8,9. Il sistema di doppia mappatura viene utilizzato per mappare il potenziale d&#39;azione (AP) e di calcio transitoria (CAT) contemporaneamente dallo stesso campo di vista di 10-13. Questo approccio ha migliorato la nostra comprensione del ruolo importante di calcio nel alternanza elettrica e l&#39;induzione di aritmia 14-16.

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Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Questo articolo descrive le procedure di base per lo svolgimento di esperimenti di mappatura ottica nella Langendorff-perfuso cuore di coniglio con il sistema di imaging panoramico, e il doppio (tensione e calcio) modalità di imaging.

Multiparametrica mappatura ottica del Langendorff-perfuso Rabbit Heart

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

multiparametric-optical-mapping-langendorff-perfused-rabbit

Research

JoVE Journal

Bioengineering

22.4K Views.  Washington University in St. Louis. Questo articolo descrive le procedure di base per lo svolgimento di esperimenti di mappatura ottica nella Langendorff-perfuso cuore di coniglio con il sistema di imaging panoramico, e il doppio (tensione e calcio) modalità di imaging.

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Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

Mappatura ottico dei potenziali d&#39;azione e transitori Calcio nel Cuore mouse

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Ricerca

Bioingegneria

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including skeletal muscle, bone and placenta. Contemporary studies demonstrate fusion of cells of the same type confers enhanced function. For example, when the trophoblast cells of the placenta fuse to form the syncytiotrophoblast, the syncytiotrophoblast is better able to transport nutrients and hormones across the maternal-fetal barrier than unfused trophoblasts1-4. More recent studies demonstrate fusion of cells of different types can direct cell fate. The "reversion" or modification of cell fate by fusion was once thought to be limited to cell culture systems. But the advent of stem cell transplantation led to the discovery by us and others that stem cells can fuse with somatic cells in vivo and that fusion facilitates stem cell differentiation5-7. Thus, cell fusion is a regulated process capable of promoting cell survival and differentiation and thus could be of central importance for development, repair of tissues and even the pathogenesis of disease.
Limiting the study of cell fusion, is lack of appropriate technology to 1) accurately identify fusion products and to 2) track fusion products over time. Here we present a novel approach to address both limitations via induction of bioluminescence upon fusion (Figure 1); bioluminescence can be detected with high sensitivity in vivo8-15. We utilize a construct encoding the firefly luciferase (Photinus pyralis) gene placed adjacent to a stop codon flanked by LoxP sequences. When cells expressing this gene fuse with cells expressing the Cre recombinase protein, the LoxP sites are cleaved and the stop signal is excised allowing transcription of luciferase. Because the signal is inducible, the incidence of false-positive signals is very low. Unlike existing methods which utilize the Cre/LoxP system16, 17, we have incorporated a "living" detection signal and thereby afford for the first time the opportunity to track the kinetics of cell fusion in vivo.
To demonstrate the approach, mice ubiquitously expressing Cre recombinase served as recipients of stem cells transfected with a construct to express luciferase downstream of a floxed stop codon. Stem cells were transplanted via intramyocardial injection and after transplantation intravital image analysis was conducted to track the presence of fusion products in the heart and surrounding tissues over time. This approach could be adapted to analyze cell fusion in any tissue type at any stage of development, disease or adult tissue repair.

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

A method to track cell fusion in living organisms over time is described. The approach utilizes Cre-LoxP recombination to induce luciferase expression upon cell fusion. The luminescent signal generated can be detected in living organisms using biophotonic imaging systems with a sensitivity of detection of &tilde;1,000 cells in peripheral tissues.

Un Cre-Lox P approccio ricombinazione per la rilevazione di fusione cellulare In Vivo</em

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including ...

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Collagen fibrils are present in the extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and mechanical strength. These native collagen fibrils have a characteristic banding periodicity of ~67 nm and are formed in vivo through the hierarchical assembly of Type I collagen monomers, which are 300 nm in length and 1.4 nm in diameter. In vitro, by varying the conditions to which the monomer building blocks are exposed, unique structures ranging in length scales up to 50 microns can be constructed, including not only native type fibrils, but also fibrous long spacing and segmental long spacing collagen. Herein, we present procedures for forming the three different collagen structures from a common commercially available collagen monomer. Using the protocols that we and others have published in the past to make these three types typically lead to mixtures of structures. In particular, unbanded fibrils were commonly found when making native collagen, and native fibrils were often present when making fibrous long spacing collagen. These new procedures have the advantage of producing the desired collagen fibril type almost exclusively. The formation of the desired structures is verified by imaging using an atomic force microscope.

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Simple and reproducible procedures are described for making three structurally distinct collagen assemblies from a common commercially available Type I collagen monomer. Native type, fibrous long spacing or segmental long spacing collagen can be constructed by varying the conditions to which the 300 nm long and 1.4 nm diameter monomer building block is exposed.

In sintesi in vitro di Native, Spaziatura fibrosa lungo e segmentale collagene spaziatura lungo

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

Patient-specific Modeling of the Heart: Estimation of Ventricular Fiber Orientations

Patient-specific simulations of heart (dys)function aimed at personalizing cardiac therapy are hampered by the absence of in vivo imaging technology for clinically acquiring myocardial fiber orientations. The objective of this project was to develop a methodology to estimate cardiac fiber orientations from in vivo images of patient heart geometries. An accurate representation of ventricular geometry and fiber orientations was reconstructed, respectively, from high-resolution ex vivo structural magnetic resonance (MR) and diffusion tensor (DT) MR images of a normal human heart, referred to as the atlas. Ventricular geometry of a patient heart was extracted, via semiautomatic segmentation, from an in vivo computed tomography (CT) image. Using image transformation algorithms, the atlas ventricular geometry was deformed to match that of the patient. Finally, the deformation field was applied to the atlas fiber orientations to obtain an estimate of patient fiber orientations. The accuracy of the fiber estimates was assessed using six normal and three failing canine hearts. The mean absolute difference between inclination angles of acquired and estimated fiber orientations was 15.4 &deg;. Computational simulations of ventricular activation maps and pseudo-ECGs in sinus rhythm and ventricular tachycardia indicated that there are no significant differences between estimated and acquired fiber orientations at a clinically observable level.The new insights obtained from the project will pave the way for the development of patient-specific models of the heart that can aid physicians in personalized diagnosis and decisions regarding electrophysiological interventions.

A methodology to estimate ventricular fiber orientations from in vivo images of patient heart geometries for personalized modeling is described. Validation of the methodology performed using normal and failing canine hearts demonstrate that that there are no significant differences between estimated and acquired fiber orientations at a clinically observable level.

Paziente-specifica modellazione del Cuore: Stima di orientamento delle fibre ventricolari

Patient-specific  simulations of heart (dys)function aimed at personalizing cardiac therapy are hampered  by the absence of in vivo imaging technology for ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

Rilevamento ottico di<em&gt; E. coli</em&gt; Batteri di mesoporosi Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be increasingly important. As RNA function often depends on its ability to adopt alternative structures, it is difficult to predict RNA three-dimensional structures directly from sequence. Single-molecule approaches show potentials to solve the problem of RNA structural polymorphism by monitoring molecular structures one molecule at a time. This work presents a method to precisely manipulate the folding and structure of single RNA molecules using optical tweezers. First, methods to synthesize molecules suitable for single-molecule mechanical work are described. Next, various calibration procedures to ensure the proper operations of the optical tweezers are discussed. Next, various experiments are explained. To demonstrate the utility of the technique, results of mechanically unfolding RNA hairpins and a single RNA kissing complex are used as evidence. In these examples, the nanomanipulation technique was used to study folding of each structural domain, including secondary and tertiary, independently. Lastly, the limitations and future applications of the method are discussed.

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

Nanomanipolazione di Single RNA Molecole da pinzette ottiche

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

In Situ mappatura delle proprietà meccaniche del biofilm da-Particle tracciamento Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Intraductal Delivery to the Rabbit Mammary Gland

Localized intraductal treatments for breast cancer offer potential advantages, including efficient delivery to the tumor and reduced systemic toxicity and adverse effects1,2,3,4,5,6,7. However, several challenges remain before these treatments can be applied more widely. The development and validation of intraductal therapeutics in an appropriate animal model facilitate the development of intraductal therapeutic strategies for patients. While the mouse mammary gland has been widely used as a model system of mammary development and tumorigenesis, the anatomy is distinct from the human gland. A larger animal model, such as the rabbit, may serve as a better model for mammary gland structure and intraductal therapeutic development. In contrast to mice, in which ten ductal trees are spatially distributed along the body axis, each terminating in a separate teat, the rabbit mammary gland more closely resembles the human gland, with multiple overlapping ductal systems that exit through separate openings in one teat. Here, we present minimally invasive methods for the delivery of reagents directly into the rabbit mammary duct and for visualization of the delivery itself with high-resolution ultrasound imaging.

Here, we describe a technique for the localized delivery of reagents to the rabbit mammary gland via an intraductal injection. In addition, we describe a protocol for visualization and the confirmation of delivery by high-resolution ultrasound imaging of contrast agents.

Consegna intraduttale al Coniglio ghiandola mammaria

Localized intraductal treatments for breast cancer offer potential advantages, including efficient delivery to the tumor and reduced systemic toxicity and ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. Traditional light-sheet techniques involve the use of a single illumination beam directed orthogonally at sample tissue. Images of large samples that are produced using a single illumination beam contain stripes or artifacts and suffer from a reduced resolution due to the scattering and absorption of light by the tissue. This study uses a dual-sided illumination beam and a simplified CLARITY optical clearing technique for the murine heart. These techniques allow for deeper imaging by removing lipids from the heart and produce a large field of imaging, greater than 10 x 10 x 10 mm3. As a result, this strategy enables us to quantify the ventricular dimensions, track the cardiac lineage, and localize the spatial distribution of cardiac-specific proteins and ion-channels from the post-natal to adult mouse hearts with sufficient contrast and resolution.

This study uses a dual-sided illumination light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) technique combined with optical clearing to study the murine heart.

Microscopia di fluorescenza di luce-foglio per lo studio del cuore murino

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

Biaxial Mechanical Characterizations of Atrioventricular Heart Valves

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive models, which provide a mathematical representation of the mechanical function of those structures. This presented biaxial mechanical testing protocol involves (i) tissue acquisition, (ii) the preparation of tissue specimens, (iii) biaxial mechanical testing, and (iv) postprocessing of the acquired data. First, tissue acquisition requires obtaining porcine or ovine hearts from a local Food and Drug Administration-approved abattoir for later dissection to retrieve the valve leaflets. Second, tissue preparation requires using tissue specimen cutters on the leaflet tissue to extract a clear zone for testing. Third, biaxial mechanical testing of the leaflet specimen requires the use of a commercial biaxial mechanical tester, which consists of force-controlled, displacement-controlled, and stress-relaxation testing protocols to characterize the leaflet tissue&#39;s mechanical properties. Finally, post-processing requires the use of data image correlation techniques and force and displacement readings to summarize the tissue&#39;s mechanical behaviors in response to external loading. In general, results from biaxial testing demonstrate that the leaflet tissues yield a nonlinear, anisotropic mechanical response. The presented biaxial testing procedure is advantageous to other methods since the method presented here allows for a more comprehensive characterization of the valve leaflet tissue under one unified testing scheme, as opposed to separate testing protocols on different tissue specimens. The proposed testing method has its limitations in that shear stress is potentially present in the tissue sample. However, any potential shear is presumed negligible.

This protocol involves characterizations of atrioventricular valve leaflets with force-controlled, displacement-controlled, and stress-relaxation biaxial mechanical testing procedures. Results acquired with this protocol can be used for constitutive model development to simulate the mechanical behavior of functioning valves under a finite element simulation framework.

Caratterizzazioni biassiale meccaniche delle valvole atrioventricolari cuore

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive ...