Siamo in debito con Stephan Schwartz e cristiana Gutzen di Biobserve GmbH per sponsorizzare questo articolo e per gran parte l&#39;assistenza tecnica. Ringraziamo Olivia Ochoa, Christian Kaufman, e Zachary Cress per l&#39;assistenza con cura i pesci, siamo grati al governo federale messicano per il permesso di raccogliere i pesci. Siamo in debito con Glen Vigus, Frederic Parke, e il Laboratorio di visualizzazione della Texas A &amp; M. Athena Mason e Ryan Easterling assistito nella preparazione di questa pubblicazione. Il finanziamento è stato fornito da Texas A &amp; M University e NSF IOS-1045226.

1. Impostazione di hardware e di sistema Viewer. Il sistema è costituito da un serbatoio di prova affiancato da due monitor. Una videocamera collegata al sistema Viewer BIOBSERVE registra il movimento del soggetto in tempo reale. Dati di movimento è passato alla riproduzione video interattivo (IVP) programma su un server separato, che determina il movimento dello stimolo animati sullo schermo. <ol><li> Inserire due monitor CRT alle estremità opposte di un 80-l acquario riempito di acqua pulita; uscita monitor partita. </li><li> Telecamera in testa per riflettere piena vista acquario; connettersi a BIOBSERVE scheda video. </li><li> Configurare il sistema Viewer per ricevere informazioni di rilevamento dalla fotocamera. </li><li> Attiva plug-in per Viewer che invia le coordinate del muso dell&#39;animale, il corpo e la coda al server di animazione in tempo reale tramite un indirizzo di rete IP specificato. </li><li> Accendere il server di animazione. </li></ol> 2. Calibrazione. <ol><li> Sul server di animazione, aperto InteractiveDisplaySetup.txt. Inserisci larghezza dello schermo e l&#39;altezza dello schermo in pixel sotto &quot;Info Monitor&quot;. In &quot;ProgramType&quot; entrare &quot;calibrazione&quot;. Salvare le modifiche al file. </li><li> Fare doppio clic sull&#39;icona del programma IVP per avviare il programma. </li><li> Entra nel estensioni delle dimensioni del serbatoio come indicato nel sistema Viewer al punto 2.3. Questo assicura la corrispondenza tra i dati Viewer e output interattivo da IVP. </li><li> Dal momento che le estremità di acquari sono più piccoli i monitor, il software permette all&#39;utente di utilizzare la tastiera (a e s di larghezza, Z e X per altezza, e la freccia chiavi per posizione) per spostare l&#39;area di visualizzazione (finestra) del stimoli per allinearsi con le estremità del serbatoio di prova. Visto sul server di animazione, la finestra rosa è ripreso su un monitor di test e la finestra blu dall&#39;altro (figura 1). </li><li> Utilizzare Z e X sulla tastiera per ridimensionare la visualizzazione dei pesci di sesso maschile su entrambi i finestre fino a quando non corrisponde alla dimensione stimolo desiderato. </li><li> Spostare le caselle visualizzate in modo che si allineano ai bordi della vasca di prova. L&#39;utente utilizza i tasti Q o W per spostare le caselle verso o lontano dal centro del pesce. </li><li> Inserire le informazioni esperimento quando richiesto dal programma. L&#39;utente ha la possibilità di scegliere tra i modelli precaricati (nella nostra dimostrazione, corteggiamento maschile Xiphophorus birchmanni, X. malinche). L&#39;utente specifica anche il comportamento di ogni pesce in ogni fase (non interattivo o interattivo), il lato e la fase in cui ogni stimolo apparirà, e la dimensione desiderata (lunghezza standard) di ogni stimolo. </li><li> La domanda successiva chiede se l&#39;utente vuole il movimenti dei pesci di eseguire il mirroring, cioè che il movimento del modello su entrambi i lati dell&#39;acquario sarà esattamente lo stesso. Questo è utilizzato solo quando i pesci sono sia in modalità di animazione. Le ultime domande riguardano il movimento della pinna dorsale. L&#39;utente può selezionare dorsale di default, questo renderebbe la dorsale solo aumentare nel corso di un corteggiamento laterale. Se il dorsale non è impostato di default, l&#39;utente può decidere se il modello alza la pinna dorsale a seconda della distanza del soggetto dal monitor. </li></ol> 3.Starting IVP per compagno di test a scelta. <ol><li> InteractiveDisplaySetup.txt aperto e impostare &quot;ProgramType&quot; per liveTesting e impostare &#39;experimentName&#39; per lo stesso nome file che contiene i dati sperimentali. </li><li> Delicatamente luogo pesce soggetto in acquario e attendere 10 min. </li><li> Avviare il 2,0 Viewer e il PEV. </li></ol> 4. Mate-scelta di prova. La sequenza complessiva sperimentale segue studi precedenti utilizzando non interattivo stimoli video di 1-4. Le femmine sono presentati con due stimoli differenti sui monitor alle estremità opposte di un acquario di prova. Comportamento femminile viene monitorato in tempo reale dal sistema Viewer Biobserve. Il test è il tempo di risposta di associazione, la quantità di tempo che una femmina spende meno di 10 cm di un monitor o l&#39;altro. Tempo l&#39;associazione è automaticamente calcolato dal Viewer. <ol><li> Gli stimoli video sono visualizzati a soggetti in un processo costituito da due, 20 minuti di fasi. Una fase si compone di quattro 5 minuti a segmenti: <ol><li> Il primo segmento ambientale la femmina al serbatoio di prova per cinque minuti con la visualizzazione di uno schermo monocromatico su entrambi i monitor. </li><li> Nel secondo segmento, due stimoli diversi video vengono visualizzati alla femmina, uno sul monitor di sinistra e l&#39;altro sulla destra per cinque minuti. </li><li> Subito dopo la visualizzazione degli stimoli video, uno schermo monocromatico è di nuovo visualizzati su entrambi i monitor per cinque minuti. </li><li> Nel quarto ed ultimo segmento, stimoli il secondo segmento vengono presentati, ma la posizione di ogni stimolo è acceso. Ciò fornisce un controllo nel-femmina di bias lato. </li></ol></li><li> Il secconda fase si ripete lo stesso schema, con un diverso insieme di stimoli contemporaneamente-presentato. </li><li> Ulteriori studi sono gestiti da ritornando al passo 2 e la variazione sistematica lato e l&#39;ordine di presentazione. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati. Abbiamo valutato l&#39;efficacia della riproduzione interattive mettendo a confronto la risposta femminile a animazioni interattive e non interattive dei maschi corteggiare. Il non-interattiva stimolo effettuato uno stimolo sullo schermo corteggiamento, indipendente dal comportamento femminile, come in studi precedenti 1-4. Lo stimolo interattivo rintracciato la posizione orizzontale della femmina attraverso lo schermo. La posizione di entrambi i pesci simulati o il pesce soggetto è stato operativamente definito come il punto medio della linea che collega il baricentro e il muso. Le tre regole che disciplinano il comportamento maschile sono stati i seguenti, in cui la direzione X si riferisce alla lunghezza della vasca, e la direzione Z si riferisce alla larghezza della vasca (figura 2): Regola 1: Il maschio simulato segue sempre il soggetto attraverso lo schermo, il suo inseguimento in direzione Z. Regola 2: pinna dorsale Il maschio simulato viene generato solo quando si sta eseguendo un display laterale corteggiamento. Regola 3: Il pesce simulato portaspada maschio solo eseguire un display laterale corteggiamento per il 50% del tempo totale che viene visualizzato alla femmina. Il display corteggiamento laterale è innescata dai pesci di sesso maschile essere in un quarto lunghezza del corpo maschile del pesce femminile nella direzione Z. Il display corteggiamento laterale è indipendente da come chiudere la femmina è al monitor in direzione X. Lo stimolo interattivo seguito da vicino la posizione della femmina in tempo reale (figura 3). Il lavoro precedente con 4,5 stimoli non-interattivo ha mostrato che femminile X. birchmanni decisamente da preferire i segnali visivi della propria specie. Il non-interattiva stimoli creati dalla IVP erano ugualmente efficaci nel suscitare preferenze compagno di conspecifici (t = 1,923, N = 9, p = 0,046). Quando le femmine sono stati testati su simulati interattivi maschi conspecifici e heterospecific immediatamente prima o dopo, nello stesso studio, tuttavia, non sono riusciti a mostrare una preferenza (figura 4). <img src="/files/ftp_upload/2374/2374fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Impostazione per la calibrazione del monitor. <img src="/files/ftp_upload/2374/2374fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Schematica del serbatoio e la configurazione del monitor, assi indicatori utilizzati per descrivere la posizione. <img src="/files/ftp_upload/2374/2374fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Posizione orizzontale di esemplare animati e rappresentante soggetto femminile nel corso del tempo. <img src="/files/ftp_upload/2374/2374fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Tempo Association (s) delle femmine con stimoli conspecifici e heterospecific interattivi e non interattivi maschile. Ogni trama è creato da un cinque minuti di registrazione della posizione di uscita dal prototipo. In questi diagrammi, il tempo avanza in direzione Y verticale da 0 a 5 minuti. <img src="/files/ftp_upload/2374/2374fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Rappresentante i dati in tempo l&#39;associazione e il tracciamento da due stimoli interattivi. Due segmenti di cinque minuti per due femmine sono mostrati.

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	<li>Fisher, H. S., Mascuch, S., Rosenthal, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivariate+male+traits+misalign+with+multivariate+female+preferences+in+the+swordtail+fish,+Xiphophorus+birchmanni.">Multivariate male traits misalign with multivariate female preferences in the swordtail fish, Xiphophorus birchmanni.</a> Anim. Behav. 78, 265-269 (2009).</li><li>Fisher, H. S., Rosenthal, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hungry+females+show+stronger+mating+preferences.">Hungry females show stronger mating preferences.</a> Behavioral Ecology. 17, 979-981 (2006).</li><li>Fisher, H. S., Rosenthal, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male+swordtails+court+with+an+audience+in+mind.">Male swordtails court with an audience in mind.</a> Biology Letters. 3, 5-7 (2007).</li><li>Wong, B. B. M., Rosenthal, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Female+disdain+for+swords+in+a+swordtail+fish.">Female disdain for swords in a swordtail fish.</a> American Naturalist. 167, 136-140 (2006).</li><li>Fisher, H. S., Wong, B. B. M., Rosenthal, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+the+chemical+environment+disrupts+communication+in+a+freshwater+fish.">Alteration of the chemical environment disrupts communication in a freshwater fish.</a> Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 273, 1187-1193 (2006).</li><li>Rosenthal, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+considerations+and+techniques+for+constructing+video+stimuli.">Design considerations and techniques for constructing video stimuli.</a> Acta Ethol. 3, 49-54 (2000).</li><li>Turnell, E. R., Mann, K. D., Rosenthal, G. G., Gerlach, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mate+choice+in+zebrafish+(Danio+rerio)+analyzed+with+video-stimulus+techniques.">Mate choice in zebrafish (Danio rerio) analyzed with video-stimulus techniques.</a> Biol. Bull. 205, 225-226 (2003).</li><li>Rosenthal, G. G., Ryan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assortative+preferences+for+stripes+in+danios.">Assortative preferences for stripes in danios.</a> Animal Behaviour. 70, 1063-1066 (2005).</li><li>Reynolds, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flocks,+herds+and+schools:+A+distributed+behavioral+model.">Flocks, herds and schools: A distributed behavioral model.</a> , 256 (1985).</li><li>Reynolds, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steering+Behaviors+For+Autonomous+Characters.">Steering Behaviors For Autonomous Characters.</a> , (1999).</li><li>Hoare, D. J., Couzin, I. D., Godin, J. -. G. J., Krause, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Context-dependent+group+size+choice+in+fish.">Context-dependent group size choice in fish.</a> Animal Behaviour. 65, 663-669 (2004).</li><li>Hoare, D. J. &. a. m. p. ;. a. m. p., Krause, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Social+organisation,+shoal+structure+and+information+transfer.">Social organisation, shoal structure and information transfer.</a> Fish and Fisheries. 4, 269-279 (2003).</li></ol>

La produzione di questo video-articolo è stato sponsorizzato da Research Biobserve.

Metodi precedenti per la riproduzione di video interattivi in ​​comportamento animale hanno fatto affidamento su un operatore umano a fornire risposte agli stimoli comportamentali di soggetti. Con IVP, abbiamo creato un programma che applica le regole-base dell&#39;interattività in risposta a tempo reale, automatizzato di dati sul comportamento dei soggetti. Abbiamo brevemente i passaggi necessari per creare il programma qui sotto. Il primo passo è stato quello di creare digitale esemplari maschi di X. birchmanni e X. Malinche. Abbiamo preso un approccio simile a studi precedenti 6. Abbiamo creato maglie 3D che sono modellati su trame basate su fotografie di veri X. birchmanni e X. Malinche. Per catturare le texture realistiche dei pesci reali, le stesse fotografie utilizzato per modellare le forme di pesce sono state usate come texture per i pesci. Una mappa planare applicato al loro coordinate UV allineato la mappa UV con la texture fotografia. In secondo luogo, la rete pesce digitale deve deformarsi come un pesce vero e proprio. Per fare questo, uno scheletro virtuale è stato creato per il corpo e le pinne e la &quot;pelle&quot; per la maglia. Il processo di scuoiatura consente la maglia da deformare quando le articolazioni sono ruotati. In secondo luogo, abbiamo aggiunto il movimento per il pesce digitale. Sei movimenti chiave che un pesce portaspada maschi fa sono stati animati. Tre di questi movimenti sono stati utilizzati per rappresentare le diverse velocità alle quali un pesce che nuotano. Gli altri tre movimenti sono stati i pesci rimasti ancora, tornire, esibendo un display laterale corteggiamento. Dal momento che i maschi possono alzare o abbassare la loro pinna dorsale in accordo con i ricevitori se maschio o femmina sono presenti 3, abbiamo disaccoppiato il movimento della pinna dorsale da quella del display corteggiamento laterale. La pinna dorsale è stato immesso in modo che potesse essere alzato o abbassato in qualsiasi momento durante il ciclo. Un totale di 24 cicli di animazione sono stati utilizzati. Ogni ciclo è iniziato e si è concluso con il pesce nella stessa posizione in modo che i cicli di animazione potrebbe facilmente si fondono insieme. Tutti i 24 cicli di animazione sono stati creati da 7,8 rotoscoping il movimento desiderato dal video sovraccarico di un live, corteggiamento maschile X. birchmanni. In terzo luogo, abbiamo attivato l&#39;interattività. Abbiamo usato il sistema Biobserve Viewer per tenere traccia in tempo reale la posizione del muso, corpo e coda del portaspada femmina e trasmettere le informazioni in tempo reale al programma IVP. Ciò è stato fatto separatamente per ogni maschio corteggiamento su ogni monitor. L&#39;animazione maschile seguito la posizione del pesce soggetto. Abbiamo modellato seguendo con Reynolds è arrivato comportamento dello sterzo 9,10, che ha permesso di seguire il maschio la femmina e decelerare quando si avvicina la femmina. Per calcolare la posizione del pesce portaspada maschio ad ogni passo, il sistema è stato fornito con la posizione attuale della femmina, che ha permesso al programma di calcolare le forze che guidano il maschio. In primo luogo, l&#39;obiettivo-offset vettore è stato calcolato sottraendo la posizione dei pesci di sesso maschile dalla posizione del pesce femmina. Secondo la distanza dal pesce maschio alla femmina di pesce è stato determinato prendendo l&#39;ampiezza del target-offset vettore. In terzo luogo, la velocità desiderata dei pesci di sesso maschile è stato determinato dividendo la distanza per un valore di decelerazione costante. Questo ha permesso il pesce maschio a rallentare mentre si avvicinava il pesce femmina. Ultimo, l&#39;accelerazione voluta è stata calcolata sottraendo velocità della corrente del maschio dalla velocità desiderata. Dal momento che le animazioni sono resi come cornici discreta del video a 60 Hz, i calcoli sono stati fatti per ogni step tempo discreto, a intervalli di 0,016 secondi. Velocità massima è stato impostato su un valore di 10 cm / s per questi esperimenti. Se l&#39;ampiezza della nuova velocità è stata superiore alla velocità massima, la velocità è stata impostata al massimo. Per questa simulazione particolare, il pesce interattivo maschile alzato la pinna dorsale del 50% del tempo, e solo durante le interazioni corteggiamento. Il laterale comportamento di visualizzazione corteggiamento è stato attivato ogni volta che lo stimolo maschile era in 0,25 lunghezze corpo del pesce portaspada femminile nella dimensione Z. Siamo rimasti sorpresi che l&#39;interattività abolito la preferenza femminile per i conspecifici, nonostante il fatto che il non-interattiva animazioni suscitato una forte preferenza e dato che le femmine trascorso la maggior parte del tempo l&#39;associazione con gli stimoli interattivi. Una possibilità è che segue da vicino la femmina può ignorare segnali visivi utilizzati per valutare i maschi, come la spada e la pinna dorsale. In alternativa, le femmine possono essere meno probabilità di perdere interesse in un corteggiamento maschile, e quindi meno probabile che entrambi gli individui del campione (figura 5). Tuttavia, i nostri risultati mostrano che il principio di funzionamento del video-gioco e cioè la tecnologia, software-driven, basato su regole agenti di rispondere agli input dell&#39;utente può essere applicato con successo alla riproduzione interattivo in studi dicomportamento animale. Questo tipo di regole basate riproduzione interattivi dovrebbero rivelarsi utile per gli studi di movimento shoaling e collettiva 11,12. In particolare, la capacità di manipolare le regole che un esemplare virtuale utilizza per shoaling dovrebbe darci comprensione dei processi che gli animali utilizzano per prendere decisioni shoaling.

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		<div>
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		<tr>
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		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Maya 8.0</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>C# program using Microsoft&#x2019;s XNA Game Studio 2.0</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BIOBSERVE Viewer 2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dell 15&#x201D; CRT monitor (2)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>20 X 20 X 80 cm Plexiglas testing aquarium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dell Latitude computer (animation server)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

automated interactive video playback for studies of animal communication

La riproduzione video è una tecnica ampiamente utilizzata per la manipolazione controllata e la presentazione di segnali visivi di comunicazione animale. In particolare, basate su parametri animazione al computer offre la possibilità di manipolare in modo indipendente una serie di caratteristiche comportamentali, morfologici, o spettrale nel contesto realistico, immagini in movimento di animali sullo schermo. Una limitazione importante di riproduzione convenzionale, tuttavia, è che lo stimolo visivo non ha la capacità di interagire con l&#39;animale vivo. Prendendo in prestito da video-gioco la tecnologia, abbiamo creato un sistema automatico, sistema interattivo per la riproduzione video che controlla le animazioni in risposta a segnali in tempo reale da un sistema di monitoraggio video. Abbiamo dimostrato questo metodo conducendo compagno di prove a scelta di pesce portaspada femmina, Xiphophorus birchmanni. Le femmine hanno dato una scelta simultanea tra un maschio corteggia conspecifici e un maschio corteggia heterospecific (X. malinche) sui lati opposti di un acquario. Lo stimolo virtuale maschile è stato programmato per tracciare la posizione orizzontale della femmina, come fanno i maschi corteggiare in natura. Mate-scelta prove su catturati X. femmine birchmanni sono stati utilizzati per validare la capacità del prototipo di generare uno stimolo efficace realismo visivo.

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Automated Interactive Video Playback for Studies of Animal Communication

Riproduzione video è una tecnica ampiamente utilizzata in comportamento animale. Abbiamo creato e valutato un programma che applica regole-base, la riproduzione interattiva del 3-D animazioni al computer in risposta a tempo reale, automatizzato di dati sul comportamento dei soggetti.

Riproduzione automatica Interactive Video per gli Studi di comunicazione animale

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, ...

automated-interactive-video-playback-for-studies-animal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.2K Views.  Texas A&M University (TAMU). Riproduzione video è una tecnica ampiamente utilizzata in comportamento animale. Abbiamo creato e valutato un programma che applica regole-base, la riproduzione interattiva del 3-D animazioni al computer in risposta a tempo reale, automatizzato di dati sul comportamento dei soggetti.

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Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. Since then, the technique was developed further and currently there are many different ways to prepare organotypic cultures. The method presented here was adapted from the one described by Stoppini et al. for the preparation of the slices and from Gogolla et al. for the staining procedure 3,4.
A unique feature of this technique is that it allows you to study different parts of the brain such as hippocampus or cerebellum in their original structure, providing a big advantage over dissociated cultures in which all the cellular organization and neuronal networks are disrupted. In the case of the cerebellum it is even more advantageous because it allows the study of Purkinje cells, extremely difficult to obtain as dissociated primary culture. This method can be used to study certain developmental features of the cerebellum in vitro, as well as for electrophysiological and pharmacological experiments in both wild type and mutant mice.
The method described here was designed to study the effect of apoptotic stimuli such as Fas ligand in the developing cerebellum, using TUNEL staining to measure apoptotic cell death. If TUNEL staining is combined with cell type specific markers, such as Calbindin for Purkinje cells, it is possible to evaluate cell death in a cell population specific manner. The Calbindin staining also serves the purpose of evaluating the quality of the cerebellar cultures.

This method describes the generation of organotypic cerebellar cultures and the effect of certain apoptotic stimuli on the viability of different cerebellar cell types.

Organotipica Culture cerebellare: sfide apoptotiche e rilevamento

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Ricerca

Neuroscienze

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached in the region of interest. The fluorescence of the region recovers when the unbleached GFP-tagged protein from outside of the region diffuses into the region of interest. The mobility of the protein is then analyzed by measuring the fluorescence recovery rate. This technique could be used to characterize protein mobility and turnover rate.
In this study, we express the (enhanced green fluorescent protein) EGFP vector in cultured hippocampal neurons. Using the Zeiss 710 confocal microscope, we photobleach the fluorescence signal of the GFP protein in a single spine, and then take time lapse images to record the fluorescence recovery after photobleaching. Finally, we estimate the percentage of mobile and immobile fractions of the GFP in spines, by analyzing the imaging data using ImageJ and Graphpad softwares.
This FRAP protocol shows how to perform a basic FRAP experiment as well as how to analyze the data.

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of Green Fluorescence Protein (GFP)-tagged proteins in cultured cells. We examined the mobile/immobile fractions of the GFP by analyzing the fluorescence recovery percentage after photobleaching. In this study, FRAP was performed at spines of hippocampal neurons.

Recupero della fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) di fluorescenza proteine ​​Tagged in spine dendritiche di colture di neuroni ippocampali

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

Fotolisi lampo di composti Caged nel Cilia di neuroni sensoriali olfattivi

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents

The goal of fixation is to rapidly and uniformly preserve tissue in a life-like state. While placing tissue directly in fixative works well for small pieces of tissue, larger specimens like the intact brain pose a problem for immersion fixation because the fixative does not reach all regions of the tissue at the same rate 5,7. Often, changes in response to hypoxia begin before the tissue can be preserved 12. The advantage of directly perfusing fixative through the circulatory system is that the chemical can quickly reach every corner of the organism using the natural vascular network. In order to utilize the circulatory system most effectively, care must be taken to match physiological pressures 3. It is important to note that physiological pressures are dependent on the species used. Techniques for perfusion fixation vary depending on the tissue to be fixed and how the tissue will be processed following fixation. In this video, we describe a low-cost, rapid, controlled and uniform fixation procedure using 4% paraformaldehyde perfused via the vascular system: through the heart of the rat to obtain the best possible preservation of the brain for immunohistochemistry. The main advantage of this technique (vs. gravity-fed systems) is that the circulatory system is utilized most effectively.

Here we describe a low-cost, rapid, controlled and uniform fixation procedure using 4% paraformaldehyde perfused via the vascular system: through the heart of the rat to obtain the best possible preservation of the brain.

Tutta la perfusione di fissaggio degli animali per i roditori

The goal of fixation is to rapidly and uniformly preserve tissue in a life-like state. While placing tissue directly in fixative works well for small ...

Video-oculography in Mice

Eye movements are very important in order to track an object or to stabilize an image on the retina during movement. Animals without a fovea, such as the mouse, have a limited capacity to lock their eyes onto a target. In contrast to these target directed eye movements, compensatory ocular eye movements are easily elicited in afoveate animals1,2,3,4. Compensatory ocular movements are generated by processing vestibular and optokinetic information into a command signal that will drive the eye muscles. The processing of the vestibular and optokinetic information can be investigated separately and together, allowing the specification of a deficit in the oculomotor system. The oculomotor system can be tested by evoking an optokinetic reflex (OKR), vestibulo-ocular reflex (VOR) or a visually-enhanced vestibulo-ocular reflex (VVOR). The OKR is a reflex movement that compensates for "full-field" image movements on the retina, whereas the VOR is a reflex eye movement that compensates head movements. The VVOR is a reflex eye movement that uses both vestibular as well as optokinetic information to make the appropriate compensation. The cerebellum monitors and is able to adjust these compensatory eye movements. Therefore, oculography is a very powerful tool to investigate brain-behavior relationship under normal as well as under pathological conditions (f.e. of vestibular, ocular and/or cerebellar origin).
Testing the oculomotor system, as a behavioral paradigm, is interesting for several reasons. First, the oculomotor system is a well understood neural system5. Second, the oculomotor system is relative simple6; the amount of possible eye movement is limited by its ball-in-socket architecture ("single joint") and the three pairs of extra-ocular muscles7. Third, the behavioral output and sensory input can easily be measured, which makes this a highly accessible system for quantitative analysis8. Many behavioral tests lack this high level of quantitative power. And finally, both performance as well as plasticity of the oculomotor system can be tested, allowing research on learning and memory processes9.
Genetically modified mice are nowadays widely available and they form an important source for the exploration of brain functions at various levels10. In addition, they can be used as models to mimic human diseases. Applying oculography on normal, pharmacologically-treated or genetically modified mice is a powerful research tool to explore the underlying physiology of motor behaviors under normal and pathological conditions. Here, we describe how to measure video-oculography in mice8.

Video-oculography is a very quantitative method to investigate ocular motor performance as well as motor learning. Here, we describe how to measure video-oculography in mice. Applying this technique on normal, pharmacologically-treated or genetically modified mice is a powerful research tool to explore the underlying physiology of motor behaviors.

Video-oculografia in Mouse

Eye movements are very important in order to track an object or to stabilize an image on the retina during movement. Animals without a fovea, such as the ...

Direct Visualization of the Murine Dorsal Cochlear Nucleus for Optogenetic Stimulation of the Auditory Pathway

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. Few studies have examined gene transfer to the central auditory system. The dorsal cochlear nucleus (DCN) of the brainstem, which contains second order neurons of the auditory pathway, is a potential site for gene transfer. In this protocol, a technique for direct and maximal exposure of the murine DCN via a posterior fossa approach is demonstrated. This approach allows for either acute or survival surgery. Following direct visualization of the DCN, a host of experiments are possible, including injection of opsins into the cochlear nucleus and subsequent stimulation by an optical fiber coupled to a blue light laser.&#160;Other neurophysiology experiments, such as electrical stimulation and neural injector tracings are also feasible.&#160;The level of visualization and the duration of stimulation achievable make this approach applicable to a wide range of experiments.

The goal of this protocol is to outline a surgical approach to provide direct access to the dorsal cochlear nucleus in a murine model.

Visualizzazione diretta del Murine Dorsale Cochlear Nucleus per optogenetic stimolazione del percorso uditivo

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. ...

Assessment and Communication for People with Disorders of Consciousness

In this experiment, we demonstrate a suite of hybrid Brain-Computer Interface (BCI)-based paradigms that are designed for two applications: assessing the level of consciousness of people unable to provide motor response and, in a second stage, establishing a communication channel for these people that enables them to answer questions with either &#39;yes&#39; or &#39;no&#39;. The suite of paradigms is designed to test basic responses in the first step and to continue to more comprehensive tasks if the first tests are successful. The latter tasks require more cognitive functions, but they could provide communication, which is not possible with the basic tests. All assessment tests produce accuracy plots that show whether the algorithms were able to detect the patient&#39;s brain&#39;s response to the given tasks. If the accuracy level is beyond the significance level, we assume that the subject understood the task and was able to follow the sequence of commands presented via earphones to the subject. The tasks require users to concentrate on certain stimuli or to imagine moving either the left or right hand. All tasks are designed around the assumption that the user is unable to use the visual modality, and thus, all stimuli presented to the user (including instructions, cues, and feedback) are auditory or tactile.

With this experiment, one might be able to detect consciousness in people with disorders of consciousness. Furthermore, the approach can create a simple communication channel that enables people to give simple YES/NO answers to questions.

Valutazione e comunicazione per le persone con disturbi della coscienza

In this experiment, we demonstrate a suite of hybrid Brain-Computer Interface (BCI)-based paradigms that are designed for two applications: assessing the ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ablation of neurons is an effective method for this purpose when neurons are selectively labeled with fluorescent probes. In the present study, protocols for laser ablating a subpopulation of neurons using a two-photon microscope and testing of its functional and behavioral consequences are described. In this study, prey capture behavior in zebrafish larvae is used as a study model. The pretecto-hypothalamic circuit is known to underlie this visually-driven prey catching behavior. Zebrafish pretectum were laser-ablated, and neuronal activity in the inferior lobe of the hypothalamus (ILH; the target of the pretectal projection) was examined. Prey capture behavior after pretectal ablation was also tested.

Here, we present a protocol to ablate a genetically labeled subpopulation of neurons by a two-photon laser from Zebrafish larvae.

Ablazione di una popolazione neuronale utilizzando un Laser del due-fotone e sua valutazione usando formazione immagine del calcio e registrazione del comportamento nelle larve di Zebrafish

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

Exogenous Administration of Microsomes-associated Alpha-synuclein Aggregates to Primary Neurons As a Powerful Cell Model of Fibrils Formation

For years, the inability of replicating formation of insoluble alpha-synuclein (&#945;S) inclusions in cell cultures has been a great limitation in the study of &#945;S aggregation in Parkinson&#39;s Disease (PD). Recently, the development of new animal models through the exogenous inoculation of brain extracts from diseased &#945;S transgenic mice or PD patients has given new hopes to the possibility of creating more adequate cell models of &#945;S aggregation. Unfortunately, when it comes to cells in cultures, administration of raw brain extracts has not proven as successful as in mice and the source of choice of exogenous aggregates is still in vitro preformed &#945;S fibrils.
We have developed a method to induce the formation of intracellular &#945;S inclusions in primary neurons through the exogenous administration of native microsomes-associated &#945;S aggregates, a highly toxic &#945;S species isolated from diseased areas of transgenic mice. This fraction of &#945;S aggregates that is associated with the microsomes vesicles, is efficiently internalized and induces the formation of intracellular inclusions positive for aggregated and phosphorylated &#945;S. Compared to in vitro-preformed fibrils which are made from recombinant &#945;S, our method is faster and guarantees that the pathogenic seeding is made with authentic &#945;S aggregates extracted from diseased animal models of PD, mimicking more closely the type of inclusions obtained in vivo. As a result, availability of tissues rich in &#945;S inclusions is mandatory.
We believe that this method will provide a versatile cell-based model to study the microscopic aspects of &#945;S aggregation and the related cellular pathophysiology in vivo and will be a starting point for the creation of more accurate and sophisticated cell paradigm of PD.

The goal of this protocol is to provide a cell-based system that replicates the formation of alpha-synuclein aggregates in vivo. Intracellular alpha-synuclein inclusions are seeded in primary neurons by the internalization and propagation of exogenous administered native microsomes-associated alpha-synuclein aggregates isolated from diseased alpha-synuclein transgenic mice.

Somministrazione esogena di microsomi-collegato dell'alfa-synuclein aggregati di neuroni primari come un modello potente delle cellule di formazione di fibrille

For years, the inability of replicating formation of insoluble alpha-synuclein (&#945;S) inclusions in cell cultures has been a great limitation in the ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Due-fotone Imaging dei neuroni corticali in topi neonatali

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...